Name: Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Apprenez à isoler les protéines chromatiniennes du cœur de souris par homogénéisation et gradient de sucrose. Cette méthode permet d'analyser quantitativement le protéome nucléaire dans les maladies cardiaques.

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Le laboratoire Vondriska est financée par des subventions de l&#39;Institut National Heart, Lung and Blood du NIH et la Fondation Laubisch à l&#39;UCLA. EM est destinataire de la Jennifer S. Buchwald bourse d&#39;études supérieures en physiologie à l&#39;UCLA; HC est le destinataire d&#39;un American Heart Association pré-doctoral, le député est le récipiendaire d&#39;une NIH Ruth Kirschstein post-doctoral, et SF est le récipiendaire du une NIH K99 Award.

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<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
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<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease+for+%27middle-down%27+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Deux principales méthodes d&#39;isolement nucléaire ont été examinés précédemment: 27 on est la technique d&#39;homogénéisation Behrens tissu lyophilisé dans un solvant non aqueux et le second, une modification, dont nous utilisons ici, d&#39;homogénéisation des tissus dans une solution aqueuse de saccharose / solution saline suivie par différence de densité ou à gradient de centrifugation. Sous-fractionnement des noyaux par extraction à l&#39;acide sur des échantillons de tissus ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Dulbeco Modified Eagle Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Protéase à granulés </td><td> Roche </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> Tamis de 100 um </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracut ultramicrotome </td><td> Reichert </td><td></td></tr><tr><td> 100CX électronique à transmission Microscope </td><td> JEOL USA, Inc </td><td></td></tr><tr><td> Loriot </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> Histone H2A anticorps </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8648 </td></tr><tr><td> Nucléoporine p62 anticorps </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> Adénine nucléoanticorps transporteur marée </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-9299 </td></tr><tr><td> BiP anticorps </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-1050 </td></tr><tr><td> Anticorps tubuline </td><td> Sigma </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> Histone H3 anticorps </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> Anticorps fibrillarine </td><td> Signalisation cellulaire </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 anticorps </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1 anticorps </td><td> Thermo Fisher </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> Anticorps rétinoblastome </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> Factor-1 inductible par l&#39;hypoxie anticorps </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> Dosage de protéines BCA </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23227 </td></tr><tr><td> Colonne en phase inverse </td><td> Obj Nouveaucace </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> Navigateur BioWorks </td><td> Thermo Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse quantitative des protéomes chromatine dans la maladie

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

Dans le noyau résident les protéomes dont les fonctions sont le plus intimement lié à la régulation des gènes. Adulte noyaux des cardiomyocytes de mammifères sont uniques en raison du pourcentage élevé de cellules binucléées, 1 l&#39;état hétérochromatique principalement de l&#39;ADN, et la nature non-division du cardiomyocyte qui rend noyaux adulte dans un état ​​permanent d&#39;interphase. 2 Régulation transcriptionnelle au cours du développement et maladie ont été bien étudiés dans cet organe, 3-5, mais ce qui reste relativement inexploré est le rôle joué par les protéines nucléaires responsables de l&#39;empaquetage de l&#39;ADN et de l&#39;expression, et comment ces protéines contrôlent des changements dans les programmes transcriptionnels qui se produisent au cours de la maladie. 6 Dans les pays développés monde, les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité pour les hommes et les femmes 7. Regard sur la façon dont les protéines nucléaires coopèrent pour réguler la progression de cette maladie est essentielle pour faire avancer le traitement actuel options. La spectrométrie de masse est l&#39;outil idéal pour répondre à ces questions car elle permet une annotation non biaisée de la quantification nucléaire protéome et relative de la façon dont l&#39;abondance de ces protéines varie avec la maladie. Bien qu&#39;il y ait eu plusieurs études protéomiques pour des complexes de protéines de mammifères nucléaires, 8-13 jusqu&#39;à récemment 14, on a eu qu&#39;une seule étude portant sur ​​le protéome cardiaque nucléaire, et considéré comme le noyau entier, plutôt que d&#39;explorer le protéome au niveau des compartiments nucléaires sous 15. En grande partie, ce manque de travail est due à la difficulté d&#39;isoler les noyaux cardiaque. Noyaux cardiaque ultérieure dans un semi-rigide et dense actine-myosine l&#39;appareil auquel ils sont reliés par plusieurs extensions du réticulum endoplasmique, dans la mesure où la contraction des myocytes modifie leur forme générale. 16 En outre, les cardiomyocytes sont 40% en volume 17 mitochondries qui necessitàTES enrichissement du noyau mis à part les autres organites. Ici, nous décrivons un protocole d&#39;enrichissement nucléaire cardiaque et un fractionnement supplémentaire en compartiments biologiquement pertinentes. En outre, nous avons détail les méthodes pour le label sans dissection spectrométrie de masse quantitative de ces fractions des techniques qui se prêtent à l&#39;expérimentation in vivo dans divers modèles animaux et des systèmes d&#39;organes où marquage métabolique n&#39;est pas réalisable.

La figure 4 met en évidence l&#39;utilité de cette forme de quantification relative. Montré dans le panneau de gauche sont différents pics peptidiques monoisotopiques (recouvert de différentes souris), qui ont été désignés comme appartenant à la HMGB1 protéines (identifiés par une recherche de base de données). Chaque pic, essentiellement un chromatographe ionique extrait pour le peptide donné, provient d&#39;une autre souris. Les groupes représentent les trois différents états physiologiques: la base, ...

Les progrès de la spectrométrie de masse ont permis l&#39;analyse à haut débit de l&#39;expression protéique et la modification dans une multitude de tissus. Combiné avec fractionnement subcellulaire et modèles de maladies, spectrométrie de masse quantitative et de la bioinformatique peut révéler de nouvelles propriétés dans les systèmes biologiques. Le procédé décrit ici analyse des protéines associées à la chromatine dans le cadre d&#39;une maladie cardiaque et est facilement applicable à d&#39;autres<em&gt; In vivo</em&gt; Modèles de maladies humaines.

Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

Le noyau abrite les protéomes dont les fonctions sont les plus intimement liées à la régulation génique. Les noyaux de cardiomyocytes de mammifères adultes sont uniques en raison de...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les protéines liées à la chromatine à partir du cœur de souris. Cela est réalisé en homogénéisant d'abord le cœur, puis en isolant les noyaux cardiaques par centrifugation sur gradient de densité de saccharose. Ensuite, le plasma nucléaire est séparé de la fraction chromatine.Ensuite, les protéines sont extraites du culot de chromatine afin d'enrichir les protéines faiblement liées à l'ADN. Enfin, les protéines sont extraites d'un culot de chromatine différent pour enrichir les protéines fortement liées à l'ADN. En définitive, des résultats peuvent être obtenus qui montrent les caractéristiques du protéome nucléaire dans différentes conditions physiologiques grâce à une analyse quantitative par spectrométrie de masse sans marquage.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine cardiaque, comme la manière dont le remodelage de la chromatine contribue à l'hypertrophie et à l'insuffisance cardiaques. Après avoir sacrifié une souris adulte et excisé le cœur, rincez-le dans du PBS glacé. Ensuite, placez-le dans un tube en verre avec deux millilitres de tampon de lyse contenant un mélange d'inhibiteurs de protéa

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Ici, nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) procédure pour analyse de la localisation du génome entier d'isoformes de protéines qui diffèrent dans un domaine histone-contraignant. Nous sommes en l'appliquant à ChIP-Seq analyse pour identifier les cibles de la déméthylase KDM5A/JARID1A/RBP2 histones.

Analyse du génome entier en utilisant ChIP d&#39;identifier les gènes cibles spécifiques Isoform

La combinaison de l'immunoprécipitation de la chromatine et le séquençage ultra-haut débit (chip-seq) permet d'identifier et de cartographier les interactions protéine-ADN dans une lignée de tissu ou de cellule donné. Décrit est de savoir comment générer un modèle de puce de haute qualité pour le séquençage ultérieur, en utilisant l'expérience avec le facteur de transcription TCF7L2 comme un exemple.

Génération de haute qualité Immunoprécipitation de la chromatine Patron de l&#39;ADN pour le séquençage à haut débit (ChIP-seq)

En combinant natif et réticulation immunoprécipitation de la chromatine à haute résolution de spectrométrie de masse, l'approche ChroP permet de disséquer l'architecture protéomique composite de modifications des histones, des variantes et des protéines non-histoniques synergie au domaines de la chromatine fonctionnellement distinctes.

L&#39;approche ChroP Combine puce et la spectrométrie de masse à Disséquer protéomiques paysages Locus spécifiques de la chromatine

Sequential extraction du sel de protéines chromatiniennes lié est un outil utile pour déterminer les propriétés de liaison de complexes protéiques importantes. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer le rôle des sous-unités individuelles ou des domaines de l’affinité globale d’une protéine complexe en bloc de la chromatine.

Extractions séquentielles de sels pour l’analyse de la chromatine en vrac, lier des propriétés de la chromatine modification Complexes

Nous décrivons ici une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et le protocole de préparation de bibliothèque de ChIP-seq pour générer des profils épigénomique global d’échantillons embryonnaires de poulet de faible abondance.

Chromatine protocole d’immunoprécipitation (puce) pour les échantillons embryonnaires de faible abondance

Nous décrivons ici un protocole de puce-séquençage haut débit optimisé et pipeline analyses calcul pour la détermination de modèles État pangénomique chromatine de lignées de cellules et tissus tumoraux congelés.

Une plate-forme intégrée pour la cartographie de la Genome-wide, des États de la chromatine, à l’aide de la puce séquençage haut-débit dans les tissus de la tumeur

Il s’agit d’une méthode pour identifier de nouvelles protéines interagissant avec ADN loci cible spécifique, en s’appuyant sur la capture de séquences spécifiques de chromatine réticulée pour analyses protéomiques ultérieures. Aucune connaissance préalable de protéines de liaison potentielle, ni modifications cellulaires ne sont nécessaires. Initialement développé pour la levure, la technologie a été adaptée pour les cellules mammifères.

Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères

Nous présentons un protocole pour identifier les implications fonctionnelles des variantes non codantes identifiées par des études d'association à l'échelle du génome (GWAS) utilisant des interactions tridimensionnelles de chromatine.

Cartographier les variantes de la maladie d'Alzheimer à leurs gènes cibles à l'aide de l'analyse computationnelle de la configuration de la chromatine

Ce protocole se concentre sur la préparation de la chromatine à partir de tissus congelés et convient à l’immunoprécipitation de la chromatine par réticulation (X-ChIP) suivie d’une analyse PCR quantitative (X-ChIP-qPCR) ou d’approches de séquençage de nouvelle génération (X-ChIP-seq).

Extraction de chromatine à partir de tissu hépatique chimérique congelé pour l’analyse de l’immunoprécipitation de la chromatine

En utilisant la PCR quantitative, nous montrons comment le bien-établie chiches CAM modèle peut être utilisé pour analyser quantitativement la métastase des cellules tumorales humaines à des organes éloignés.

Analyse quantitative des métastases du cancer en utilisant un modèle d&#39;embryon aviaire

Apprenez à isoler les protéines chromatiniennes du cœur de souris par homogénéisation et gradient de sucrose. Cette méthode permet d'analyser quantitativement le protéome nucléaire dans les maladies cardiaques.

Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

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