Name: Essai de plaque pour le norovirus murin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Apprenez à quantifier les particules infectieuses du norovirus murin par essai de plaque sur macrophages murins RAW 264.7. Cette méthode virologique permet d'étudier la dynamique des infections à norovirus.

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Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Wobus pour les commentaires et suggestions. Travailler dans le laboratoire de l &#39;AI a été financée par fonds de démarrage de l&#39;Université du Michigan, une subvention de développement de carrière à partir du Centre NIH / NIAID régional d&#39;excellence pour Bio-défense et émergentes de recherche en infectiologie (RCE) du programme, la Région V&#39; Grande Lacs »RCE (NIH prix 1-U54-AI-057 153) et le NIH R01 AI080611. MBG-H. a été financé par l&#39;immunologie expérimentale (NIH T32 A1007413-16) et les Mécanismes moléculaires de la pathogenèse microbienne (NIH T32 A1007528) bourses de formation à l&#39;Université du Michigan. JBC a été financé par coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES), Brasilia, Brésil.

1. La culture de la lignée cellulaire de macrophages RAW 264.7 <ol><li> Maintenir des cellules RAW 264.7 (ATCC, numéro de catalogue TIB-71) dans DMEM-10 des médias, qui se compose de glucose à haute DMEM avec 10% (v / v) faible endotoxine sérum fœtal bovin (&lt;10 EU / ml), HEPES 10 mM , 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 1 mM de non-acides aminés essentiels, 2 mM de L-glutamine. Les cellules sont généralement maintenues dans 175 cm 2 flacons de culture tissulaire contenant 35 ml de milieu par flacon et incubées à 37 ° C et 5% de CO 2 dans un incubateur de culture tissulaire. Cependant, tout flacon format peut être utilisé avec un volume de support qui est adapté à la taille du flacon. </li><li> Pour diviser des cellules: Aspirer les anciens médias, ajouter 10 ml de DMEM frais-10 médias sur les cellules, puis gratter les cellules du fond du flacon à l&#39;aide d&#39;un grattoir à cellules. Ensuite, remettre en suspension les cellules dans une solution homogène en élaborant des cellules dans une pipette de 10 ml et serrer avec force les cellules à travers l&#39;embout de pipette prEssed contre le fond du flacon. Répétez cette opération au moins 3 fois si les cellules ne s&#39;agrègent. Vérifier par microscopie optique qu&#39;une suspension de cellules isolées a été généré. Ensuite, transférer 1 ml (dilution 1:10 ou ~ 1x10 7 cellules) - 2 ml (dilution 1:5 ou ~ 2x10 7 cellules) de la suspension cellulaire à un nouveau flacon de 175 cm 2, et porter le volume final du milieu jusqu&#39;à 35 ml. </li><li> Les cellules divisées quand ils sont presque confluentes (~ 1x10 8 cellules total/175 cm 2 flacons): tous les trois jours si vous commencez avec une dilution de 1:10, ou tous les deux jours si vous commencez avec une dilution 1:5. Utilisez la microscopie optique pour vérifier la morphologie des cellules, avant fractionnement de cellules. La plupart des cellules devraient regarder autour et pas activée. Cellules activées ont granules et / ou étendues, avec des appendices filiformes morphologie. Ne laissez pas envahir les cellules comme les cellules ne sont généralement pas former des plaques. Gardez une trace du nombre de passages et souvent recommencer par la fonte d&#39;une partie aliquote passage inférieur de cellules. (Nous utilisons passage 30 comme un cut-off). </li></ol> 2. Infecter les cellules RAW 264.7 MNV avec l&#39;inoculum <ol><li> Semences cellules RAW 264.7 en plaques 6 puits (3,5 cm de diamètre) à une densité de 1x10 6 cellules viables / ml dans du DMEM-10 médias, et ajouter 2 ml de cette suspension dans chaque puits. Il est important de distribuer uniformément les cellules dans des puits de plaques, soit par basculement à la main au moins 10 fois ou au moyen d&#39;un dispositif à bascule pour ~ 10 min. Ne pas faire tourbillonner les plaques car cela pourrait causer des cellules à se regrouper dans le centre du puits. Plaques placer dans un incubateur de culture tissulaire (à 37 ° C et 5% de CO 2). Laisser les cellules d&#39;attacher pendant la nuit ou pendant au moins 4 heures à 37 ° C. Les cellules doivent être de 60 à 80% de confluence pour le dosage de la plaque et distribué uniformément dans le puits. </li><li> Le lendemain, préparer l&#39;inoculum viral, qui peut être de MNV cellules infectées en culture de tissus ou de tissus homogénéisés ou des échantillons fécaux de MNV souris infectées. Lors de l&#39;utilisation d&#39;échantillons de tissus, taille d&#39;un pois piEPE de tissus sont homogénéisés dans 2 ml à bouchon à vis des tubes contenant des billes de silice stériles dans 1 ml de DMEM-10 à l&#39;aide d&#39;un homogénéiseur de tissus (par exemple MagnaLyser; Roche). Pour les échantillons fécaux, pas plus de 3 pelotes fécales doivent être homogénéisés dans 1 ml médias. Tous les échantillons sont ensuite congelés (à -80 ° C) et décongelés une fois avant d&#39;effectuer le dosage de la plaque. </li><li> Préparer 10 dilutions de l&#39;inoculum viral dans du DMEM complet-5 moyen, qui se compose de DMEM / glucose élevé, 5% (v / v) faible endotoxines sérum de veau fœtal (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 1 mM de non-acides aminés essentiels, 2 mM de L-glutamine. </li><li> Dix dilutions en série sont disposés dans des plaques 24-puits: Une pipette de répéteur est utilisé pour distribuer 1,35 ml de milieu dans des puits multiples, la dilution 10 -1 est réalisée en mélangeant 1,35 ml de milieu et 0,15 ml de virus contenant de l&#39;échantillon, et puis 0,15 ml de la dilution 10 -1 est ajouté à 1,35 ml médias afin de faire le 10 -2 dilution et ainsi de suite. Il est important de changer d&#39;embout chaque fois que vous effectuez une nouvelle dilution. Une pipette multicanaux peut être utilisée pour effectuer les dilutions d&#39;échantillons multiples à la fois avec deux pointes de montage dans un puits d&#39;une plaque de 24 puits transfert d&#39;un volume total de 0,15 ml par puits (voir figure 3A). </li><li> Une gamme de dilution de type homogénats de tissus et les contenus fécaux est de 10 -1 à 10 -3. Cependant, les plaques de ces échantillons ont tendance à être plus petits par rapport à ceux des échantillons de culture de tissus. En outre, dans certains cas, une dilution 1:100 des échantillons fécaux est nécessaire pour diluer suffisamment sur les composants toxiques des matières fécales qui peuvent perturber la monocouche de cellules, empêchant ainsi la capacité de compter des plaques. La gamme de dilution des lysats de culture de tissus dépend du point de temps d&#39;intérêt au cours du cycle de vie du virus. Dilutions allant jusqu&#39;à 10 -9 peut être nécessaire à l&#39;apogée de l&#39;infection. </li><li> Après les dilutions sont préparées, étiqueter la plaque à 6 puitss contenant RAW 264.7 monocouches (à partir de la section 2.1) avec le nom de l&#39;échantillon et les dilutions étant plaqué. Une plaque à la fois, retirer tout support en le feuilletant ou en dehors d&#39;aspiration. Immédiatement après, ajoutez 0,5 ml d&#39;un échantillon dilué dans un puits, puis répétez avec un double puits, avant de procéder à la dilution suivante. Une fois tous les 3 dilutions sont ajoutés à une plaque d&#39;inclinaison plaque, d&#39;avant en arrière à la main pour s&#39;assurer que toutes les cellules ont été couverts. Manipuler une plaque à la fois pour s&#39;assurer que les cellules ne se dessèchent pas. </li><li> Après addition de 0,5 ml des dilutions de chaque puits, à empiler des plaques droite et les incuber pendant 1 heure à température ambiante. Parce que le volume ajouté à chaque puits n&#39;est pas suffisante pour couvrir complètement la monocouche, les plaques doivent être légèrement inclinée vers l&#39;arrière et en arrière à la main toutes les 10-15 minutes ou placé sur un appareil à bascule (~ 18 oscillations par minute). Cela empêche les cellules de se dessécher. </li></ol> 3. Faible point de fusion d&#39;agarose (SeaPlaque) Préparation Overlay <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Remarque: il est conseillé d&#39;avoir plusieurs bouteilles avec autoclave SeaPlaque agarose préparé à l&#39;avance. D&#39;agarose peuvent être refondus dans un four micro-ondes avant l&#39;utilisation. <ol><li> Calculer la quantité de revêtement nécessaire pour que le volume total des plaques avant l&#39;incubation 1 h est terminée. Le volume nécessaire est de 2 ml / puits ou 12 ml/6-well plaque. Préparer agarose (voir section 3.2) et les médias (voir la section 3.3) séparément. </li><li> À préparer l&#39;agarose, suspendre 3 g de SeaPlaque agarose dans un volume total de 100 ml d&#39;eau distillée (3% v / v) dans un flacon en verre. Autoclaver pendant 20-30 min. (Si agarose a été déjà préparé avant-main, de refonte d&#39;agarose à micro-ondes.) Il est important d&#39;équilibrer SeaPlaque agarose à 42 ° C dans un bain d&#39;eau avant de l&#39;utiliser parce que si l&#39;agarose est trop chaud, il va tuer les cellules. S&#39;assurer que le niveau d&#39;eau est égal ou supérieur au niveau de l&#39;agarose pour éviter la solidification indésirable. </li><li> Pour préparer les médias: faire 100 ml de milieu MEM 2x, qui se compose de2x MEM, 10% (v / v) faible endotoxine sérum de veau fœtal (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 4 mM de L-glutamine. Équilibrer médias à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Mélanger à la fois l&#39;agarose SeaPlaque et les médias MEM 2x ensemble dans un flacon stérile dans un rapport 1:1 immédiatement avant la superposition des monocouches de cellules infectées. Si plus de 200 ml de recouvrement est nécessaire, le volume divisé en plusieurs bouteilles et de garder à 37 ° C bain d&#39;eau jusqu&#39;au moment de servir. </li><li> À la fin de l&#39;incubation de 1 h (voir section 2.7), aspirer l&#39;inoculum hors de chaque puits. Ajouter lentement 2 ml de recouvrement vers le bord de chaque puits en plaçant la pointe de la pipette contre la paroi de chaque puits. Jusqu&#39;à 5 plaques peuvent être traitées simultanément sans cellules se dessécher. </li><li> Permettre le recouvrement se solidifier pendant environ 10 min à température ambiante avant de placer les plaques verticalement dans le incubateur de culture tissulaire. Incuber les plaques pendant 48 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2. </li><li> Aprèsla période d&#39;incubation, les plaques sont à peine visible à l&#39;œil nu, afin de vérifier plaques non colorées de la présence de plaques. Si aucune plaque sont visibles, incuber pendant 4 heures supplémentaires et vérifier de nouveau. Toutefois, la période d&#39;incubation maximale ne doit pas dépasser 72 heures. </li></ol> 4. Visualisation des plaques de coloration rouge neutre <ol><li> Pour visualiser les plaques, la solution de coloration au rouge neutre est préparé en ajoutant 3 ml de rouge neutre (0,33% v / v dans du DPBS, Sigma, catalogue # N2889) pour chaque ml de PBS 1x 97 (grade de culture tissulaire, Mg 2 + -, Ca 2 + - gratuit; Gibco, catalogue # 10010). Calculer le volume de solution de coloration au rouge neutre nécessaire pour l&#39;expérience: 12 ml de solution neutre coloration rouge sont obligatoires pour chaque plaque à 6 puits. Ensuite, ajoutez 2 ml dans chaque puits. Bien que certains protocoles de dosage plaque nécessitent la prise d&#39;agarose à être présente dans le puits, en ce protocole la solution de coloration au rouge neutre est ajouté directement sur le revêtement. </li><li> Après une heure un danscubation à 37 ° C, vérifier si les plaques sont visibles avec une solution de coloration au rouge neutre encore dans les puits. Si les plaques ne sont pas évidentes, permettent la coloration se poursuivre pendant une autre heure. Continuer jusqu&#39;à ce que l&#39;incubation des plaques sont visibles. (Remarque:. Coloration pendant plus de 3 heures n&#39;est pas optimale et si aucune plaque sont visibles dans l&#39;échantillon de contrôle positif après 3 heures de la coloration, le dosage de la plaque ne fonctionne pas correctement) Après la coloration est terminée, aspirer la solution de coloration au rouge neutre , en veillant à la prise d&#39;agarose n&#39;est pas perturbée, puis procéder au comptage des plaques. </li><li> Compter plaques en plaçant la plaque à l&#39;envers sur une boîte à lumière et un point de marquage sur des plaques en compte pour éviter chiffres dupliquée. Choisissez la dilution de compter plaques dans les puits où les plaques sont clairement séparées (ie pas de preuve visuelle de fusion plaques ensemble). Si possible, compter plaques à deux dilutions. Il est important de noter que la taille des plaques peut varier entre les souches MNV, inoculum de virus, et dépend de laétat des cellules RAW 264.7 au cours de l&#39;essai de plaque. </li><li> Si aucune plaque sont visibles dans un puits, soit il n&#39;y avait pas de virus présent dans l&#39;échantillon ou la quantité de virus était sous la limite de détection de la méthode des plages. Dans ce cas, le puits se colorent en rouge avec une couleur similaire à celle d&#39;autres plaques contenant du puits. Alternativement, l&#39;absence de plaques est également observée quand il ya trop de particules virales présentes dans une dilution donnée. Cela conduit à la lyse de la monocouche tout puits prend une couleur orange / jaune. </li><li> Calculer les titres viraux. Ajouter le nombre de plaques dans les deux puits à une dilution unique et multiplier par le facteur de dilution (soit 1 ml si 2 puits sont infectés avec 0,5 ml). Cela donnera la quantité d&#39;unités formant des plages (UFP) dans votre volume d&#39;inoculum de 1 ml. Par exemple, dans la Figure 4 à la dilution 10 -2, un puits (&quot;II&quot;) dispose de 14 plaques et l&#39;autre puits (marqué &quot;V&quot;) dispose de 17 plaques. Ainsi, le titre viral sera de 14x10 2 + 2 = 17x10 3100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Infectieuses MNV-1 particules peuvent être quantifiés à l&#39;aide d&#39;un dosage de la plaque comme indiqué schématiquement dans la figure 1. Figure 2A montre un puits avec une monocouche de cellules RAW 264.7 juste avant l&#39;infection, tandis que la figure 2B montre trois plaques visibles indiquées par des chiffres romains I, II et III dans un puits. Les différentes étapes de l&#39;analyse sont représentés dans les figures 3A à F. La figure 3A montre la préparation de la série de dilution de 10 fois d&#39;un échantillon contenant un virus. Figure 3B montre le transfert des dilutions de dupliquer les puits d&#39;une plaque à 6 puits. Figure La figure 3C montre le dispositif de bascule utilisée pour incuber des cellules RAW 264,7 avec l&#39;inoculum à la température ambiante pendant 1 h figure 3D montre des cellules est recouverte par la SeaPlaque:. MEMmélange. figure 3E montre une plaque à la température ambiante pour permettre la superposition de se solidifier, tandis que la figure 3F montre des cellules étant colorées avec une solution 0,01% neutre 48 h plus tard rouge. Après la coloration des cellules pour hr 1-3 et aspirer la solution de coloration au rouge neutre, les plaques sont visibles et peuvent être pris en compte (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma du protocole de MNV dosage de la plaque. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figure 2. Images représentatives d&#39;un puits d&#39;une monocouche avant l&#39;infection et après la formation de plaques. A 264,7) RAW cellules ont été cultivées pendant une nuit et imagée sous un microscope optique à un grossissement de 20x. B) Les cellules ont été colorées avec une solution à 0,01% de rouge neutre après 48 hr de l&#39;infection et visualisées sous un microscope optique à un grossissement de 4x. Roman numéros I, II, et III indiquent trois plaques visibles. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figure 3. Images représentatives des différentes étapes d&#39;analyse plaque. A) MNV-1 inoculum est préparé dans 10 des dilutions. B) L&#39;inoculum est ajouté à des monocouches de cellules dans les puits en double. C) Les cellules et l&#39;inoculum sont incubés en basculant pendant 1 heure à température ambiante. D) Les cellules sont recouvertes d&#39;un mélange 1:1 de SeaPlaque agarose et 2x MEM médias. E) Les plaques sont incubées pendant 10 min à température ambiante pour permettre la superposition de se solidifier. F) La coloration des cellules avec la solution de coloration au rouge neutre 48 heures post-infection. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Figure 4. Plaques MNV-1 dans la cellule formes monolayers. Montré ici est une plaque plaque représentant test 48 heures après l&#39;infection, montrant plaques colorées avec une solution de coloration au rouge neutre après 1 heure d&#39;incubation. La plaque montre deux puits de trois 10-dilutions. Wells étiquetés avec chiffres romains I et IV correspondent à la dilution 10-1, II et V correspondent à la dilution 10-2, III et VI correspondent à la dilution 10-3. Le titre viral de l&#39;échantillon est indiquée ci-dessous (voir la section 4.5 pour les détails du calcul).

<ol><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+norovirus%3A+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li>
<li>Condit, R. C. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCondit%2C+RC+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 1, Lippincott Williams & Wilkins. 25-58 (2007).</li>
<li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+estimating+50%25+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li>
<li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li>
<li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435(2011).</li>
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<li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li>
<li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode de dosage de la plaque de MNV-1 présenté ici est un moyen de quantifier les particules infectieuses MNV. En suivant les étapes de l&#39;analyse illustrés à la figure 3, on peut obtenir des titres viraux reproductibles. La limite de détection du dosage dépend de la dilution de départ utilisé. Lors du démarrage d&#39;une dilution 1:10 de l&#39;échantillon tel que décrit ci-dessus, la limite de détection du test est la plaque 10 pfu (soit 1 plaque visible à la dilution à 10 -1). Étant donné que chaque plaque représente un seul virus, le dosage de la plaque peut également être utilisé pour purifier des populations clonales de MNV en choisissant plaques isolées et leur multiplication comme décrit précédemment 1. En outre, purifications sur plaque peut également être utilisé pour séparer une population de virus individuel de populations virales mixtes. Une limitation de l&#39;utilisation d&#39;une plaque d&#39;essai pour la détection de l&#39;infection MNV est que toutes les souches MNV former des plaques 4. Toutefois, il peut être possible de surmonter la inabilité de certaines souches MNV, isolés chez les animaux, pour former des plaques en série passages de ces virus dans 7 la culture de tissus. Une alternative à l&#39;essai de plaque est de mesurer les particules infectieuses par la technique DICT 50 3, 4. Ce test quantifie la quantité de virus nécessaire pour produire CPE dans 50% des cellules de culture tissulaire inoculés après dilutions de point final et prend 1 semaine à remplir pour MNV 4. En plus d&#39;être plus lent qu&#39;un essai de plaque, le test TCID 50 n&#39;est pas aussi sensible (limite de détection = 200 DICT 50 / ml) en raison de la toxicité des échantillons de tissus pour des cellules RAW 264.7 4. Bien que les étapes critiques dans le protocole ont été décrites dans le protocole, la section suivante fournit un résumé pour faciliter le dépannage. L&#39;étape la plus critique dans le protocole est de faire en sorte que les cellules RAW 264.7 rester viable tout au long de l&#39;essai à charge la réplication du virus. Cela peutêtre contrôlés à chaque étape de l&#39;analyse par microscopie optique. La viabilité cellulaire est assurée de deux façons. Tout d&#39;abord, il faut prendre soin de ne pas laisser sécher les cellules lors de la manipulation des plaques. Ainsi, les plaques sont inoculées une à la fois, bercé pendant la période d&#39;infection, et doit rester fermé quand ils ne sont pas traitées. Deuxièmement, les solutions ajouté sur les cellules doivent être équilibrés à ~ 37 ° C En outre, il est vital pour la santé globale des cellules RAW 264.7 de les maintenir dans un milieu contenant une endotoxine sérique basse (&lt;10 EU / ml), ce qui limite l&#39;activation des cellules. En outre, nous avons observé un taux d&#39;échec plus élevé de l&#39;essai de plaque lors de l&#39;utilisation des cellules de passage 30 ou supérieur. Bien que cela va probablement varier d&#39;un laboratoire à l&#39;autre, il est important d&#39;inclure un contrôle positif (par exemple, un échantillon avec un titre connu virale) afin d&#39;assurer la reproductibilité des titres, en particulier lors de l&#39;utilisation plus élevés passage des cellules RAW 264.7. Pour limiter l&#39;utilisation de cellules de passage plus élevées, il est conseillé de congeler les flacons de début passacellules ge à la réception de cellules RAW 264.7 et commencer une nouvelle culture des flacons congelés fréquemment. Starting over avec de faibles cultures de cellules de passage sera également utile lorsque les cellules présentent des caractéristiques altérées, comme le non-respect, des changements dans la morphologie des cellules (par exemple de rond à grêles et étalées), ou lorsque contamination par des mycoplasmes a été détectée. Un autre point important de faire attention à faire en sorte que les embouts de pipette sont changés entre les échantillons et pendant les dilutions. Cela permettra d&#39;assurer précises dilutions en série et à prévenir la contamination croisée entre les échantillons. L&#39;étape dans le protocole une où le même embout de pipette peut être utilisée à nouveau, c&#39;est quand dilutions en série d&#39;un même échantillon sont ajoutés dans les puits. Dans ce cas, on devrait commencer à partir de l&#39;inoculum plus dilué à tout le moins, et vigoureusement pipette de haut en bas lors de l&#39;élaboration d&#39;une nouvelle dilution. Le protocole de dosage de la plaque est modifiable à plusieurs modifications. Une modification qui peut être fait lorsque tici ne sont pas assez de cellules pour inoculer des puits en double exemplaire consiste à inoculer qu&#39;un seul puits pour chaque dilution. Toutefois, étant donné le volume d&#39;inoculum est de 0,5 ml, le nombre de plaques doit ensuite être multiplié par un facteur de 2 à normaliser à pfu / ml. Le dosage de la plaque peut également être adapté pour être utilisé avec n&#39;importe quelle autre lignée cellulaire adhérente qui est capable de supporter la réplication de MNV, et cela a été décrit pour la lignée murine microgliale BV-2 8 cellules. D&#39;autres modifications qui peuvent être mises en œuvre sont des adaptations qui ont été décrits pour les protocoles d&#39;essais développés plaque pour d&#39;autres virus. En cas de MNV, les modifications suivantes ont déjà été mis en œuvre avec succès, l&#39;utilisation de la cellulose de méthyle au lieu d&#39;une plaque d&#39;agarose Mer 9, et la coloration des cellules avec du cristal violet ou bleu de méthylène au lieu de rouge neutre 10, 11. Dans l&#39;ensemble, ce protocole peut facilement être adapté selon les besoins de quantifier les autres formatrices de plages virus ou utilisés pour other virus qui causent des infections lytiques dans des cellules RAW 264.7, ce qui en fait un outil utile pour quantifier les particules virales infectieuses en général.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> DMEM / glucose élevé </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x pénicilline et de la streptomycine </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM non-acides aminés essentiels </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-glutamine </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Plaque mer Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Rouge neutre 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm en zircone / silice perles </td><td> Produits BIOSPEC </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Rocker Speed ​​Modèle 35 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Instrument Lyser Magna </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> RAW 264.7 lignée cellulaire </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Incubateur de culture tissulaire </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

essai de plaque pour le norovirus murin

Plaque Assay for Murine Norovirus

Norovirus murin (MNV) est le seul membre du genre Norovirus qui pousse efficacement en 1 culture de tissu, 2. La lyse cellulaire et l&#39;effet cytopathogène (ECP) sont observées pendant MNV-1 infection des cellules dendritiques ou des macrophages murins 1. Cette propriété de MNV-1 peut être utilisé pour quantifier le nombre de particules infectieuses dans un échantillon donné en effectuant un essai de 1 plaque. Le dosage de la plaque repose sur la capacité de MNV-1 pour lyser les cellules et pour former des trous dans une monocouche confluente de cellules, qui sont appelées des plaques 3. De multiples techniques peuvent être utilisées pour détecter les infections virales en culture de tissu, tissu récolté, cliniques, et les échantillons environnementaux, mais ne mesurent pas tous le nombre de particules infectieuses (p. ex qRT-PCR). Une façon de quantifier les particules virales infectieuses est d&#39;effectuer un test de la plaque 3, qui sera décrit plus en détail ci-dessous. Une variation sur le dosage de la plaque MNV est le fluordosage accent escent, où l&#39;antigène est MNV immunocolorées en 4 monocouches de cellules. Ce test peut être plus rapide, puisque l&#39;expression des antigènes viraux précède la formation de plaques. Il est également utile pour le titrage de virus sont incapables de former des plaques. Cependant, le dosage accent fluorescente nécessite des ressources supplémentaires au-delà de celles de l&#39;essai de plaque, comme les anticorps et d&#39;un microscope à compter accent unités formatrices. MNV infectieux peut également être quantifiée par la détermination de la dose dans les tissus de 50% de la culture infectieuse (DICT 50) 3. Ce test mesure la quantité de virus nécessaire pour produire CPE dans 50% des cellules de culture tissulaire inoculés de 5 titrage à point final. Cependant, la limite de détection est plus élevé par rapport à un 4 essai de plaque. Dans cet article, nous décrivons un protocole de dosage plaque qui peut être utilisé efficacement pour déterminer le nombre de particules infectieuses MNV présents dans les échantillons biologiques ou environnementaux 1, 4, 6. Cette méthode est based sur la préparation de 10 dilutions en série de MNV échantillons contenant, qui sont utilisés pour inoculer une monocouche de cellules permissives (cellules RAW 264.7 murines macrophages). Virus est autorisé à joindre à la monocouche de cellules pendant une période de temps donnée et ensuite aspiré avant de recouvrir les cellules avec un mélange d&#39;agarose et de milieux de culture cellulaire. L&#39;agar-agar permet la propagation de la descendance virale aux cellules voisines tout en limitant la propagation des cellules situées loin. Par conséquent, les cellules infectées sont lysées et les trous de formulaires dans la monocouche connu sous le nom de plaques. Lors de la propagation du virus suffisante, les plaques deviennent visibles coloration suivante de cellules avec des colorants, comme le rouge neutre, le bleu de méthylène, ou cristal violet. À de faibles dilutions, chaque plaque provient d&#39;une particule virale infectieuse et sa descendance, qui se propager aux cellules voisines. Ainsi, en comptant le nombre de plaques permet de calculer unités formatrices de plages (UFP) présents dans l&#39;échantillon non dilué 3.

Nous décrivons ici une méthode pour quantifier les particules infectieuses de norovirus murin (MNV), qui est le norovirus seulement que se réplique efficacement en culture cellulaire. Le dosage de la plaque profite du tropisme MNV pour les macrophages murins et peut être adapté pour une utilisation avec des échantillons biologiques ou environnementaux contenant MNV.

Essai de plaque pour le norovirus murin

Le norovirus murin (MNV) est le seul membre du genre Norovirus capable de croître efficacement en culture tissulaire 1, 2. La lyse cellulaire et l'effet cytopathique (ECP) sont ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les particules de norovirus neuronales infectieuses. Cela est réalisé en préparant tout d'abord une dilution au dixième de l'inoculum viral. La deuxième étape consiste à transférer la dilution de l'inoculum viral sur une monocouche RAW 264.7 et à incuber les plaques en agitant à température ambiante pendant une heure.Ensuite, aspirez l'inoculum et recouvrez-le d'un mélange équivalent (1:1) de milieu de plaque C et de deux XMEM, puis incubez les plaques pendant 48 heures dans un incubateur de culture tissulaire. L'étape finale consiste à recouvrir les plaques d'une solution de coloration au rouge neutre et à les incuber de une à trois heures dans un incubateur de culture tissulaire. Enfin, la solution de coloration au rouge neutre est soigneusement aspirée sans retirer la couche de plaque présente, puis les plex sont dénombrés à l'aide d'une boîte lumineuse.Cette méthode de quantification des particules virales infectieuses peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du norovirus, telles que la quantité de particules infectieuses excrétées dans les selles ou les tissus qui favorisent l'infection. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés à maintenir des cellules saines et viables tout au long du test. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le test de plaque pour le norovirus miroir peut être difficile à comprendre pour les personnes sans expérience préalable.L'achèvement réussi de ce test repose sur une série cumulative d'étapes nécessitant une quantité adéquate de cellules, une température correcte et une manipulation précise afin d'observer facilement les plaques. Examinez d'abord la monocouche cellulaire au microscope optique pour vérifier la morphologie des cellules. La majorité des cellules doivent apparaître rondes.Ne laissez pas les cellules surcroître car elles ne formeront généralement pas de plaques ; pour préparer un flacon de culture tissulaire de 175 centimètres carrés presque confluent de cellules RAW 264.7 destiné au test de plaque du virus neurotrope murin, aspirez le milieu du flacon et ajoutez 10 millilitres de DMEM 10 frais aux cellules. Ensuite, grattez les cellules du fond du flacon à l’aide d’un grattoir à cellules et utilisez une pipette de 10 millilitres pour aspirer puis expulser la suspension cellulaire contre le fond du flacon. Répétez cette opération au moins trois fois afin de rompre les éventuels agrégats cellulaires.Pour adapter un flacon stock. Prélever un à deux millilitres de suspension cellulaire et les déposer dans un nouveau flacon carré de 175 centimètres carrés contenant 33 à 34 millilitres de DMEM 10. Incuber le flacon dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours, puis effectuer à nouveau un massage.Une fois le complément ajouté pour ensemencer les plaques destinées au test, ajustez la densité de la suspension cellulaire à un fois dix puissance six cellules viables par millilitre dans du DMEM 10 et ajoutez deux millilitres de cette suspension dans chaque puits d'une plaque de 3,5 centimètres de diamètre à six puits. Fermez la plaque, puis agitez-la manuellement pendant 10 secondes pour répartir uniformément les cellules dans les puits.Ne pas surcharger la plaque car cela provoquerait l'agrégation des cellules au centre du puits. Ensuite, placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins quatre heures, ou idéalement toute la nuit, pour permettre l'attachement des cellules. L'inoculum viral peut être obtenu à partir de tissus homogénéisés infectés par le MNV ou d'échantillons fécaux de souris infectées par le MNV. Si l'on utilise des échantillons de tissus, placer un morceau de tissu de la taille d'un petit pois dans un tube de deux millilitres à visser contenant des billes de silice stériles et un millilitre de DMEM 10, puis homogénéiser ici.Un homogénéisateur est utilisé à 6 000 tr/min pendant une minute. Si l'on utilise des échantillons fécaux, homogénéiser au maximum trois granules fécaux de la même manière, congeler les échantillons homogénéisés à moins 80 degrés Celsius, puis décongeler l'inoculum le jour du dosage des plaques. Utiliser une pipette répétitive pour distribuer 1,35 millilitre de DMEM cinq dans chaque puits d'une plaque de 24 puits, puis pipeter 0,15 millilitre de l'inoculum viral au troisième passage dans le premier puits de la plaque.Effectuez des dilutions sériées d’un facteur dix en aspirant 0,15 millilitre de la première dilution 10 à la puissance moins un et en la transférant dans le deuxième puits de la plaque pour obtenir une dilution 10 à la puissance moins deux. Répétez ensuite le processus avec la dilution du deuxième puits afin d’obtenir une dilution 10 à la puissance moins trois. Notez qu’il peut être nécessaire de réaliser des dilutions supplémentaires jusqu’à 10 à la puissance moins neuf, selon l’échantillon.Une fois les dilutions séries préparées, étiquetez les plaques contenant des cellules RAW 264,07 à 60 à 80 % de confluence avec les noms des échantillons et les dilutions utilisées. Ensuite, retirez tout le milieu d'une des plaques en aspirant ou en secouant, puis ajoutez 0,5 millilitre d'un échantillon dilué dans un puits. Répétez l'opération dans un puits en double, puis passez à la dilution inférieure suivante.Une fois les trois dilutions ajoutées en double sur une même plaque, inclinez la plaque d'avant en arrière pour vous assurer que toutes les cellules ont été recouvertes. Répétez la procédure avec la plaque de cellules suivante. Une fois que toutes les plaques ont été traitées, placez-les sur un agitateur rotatif réglé à environ 18 oscillations par minute pendant une heure à température ambiante, puis chauffez au micro-ondes un flacon d'agarose préalablement préparé ou encapsulé jusqu'à ce qu'il soit fondu.Ensuite, placer les agaroses fondus dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pour les équilibrer à la température. Puis, mélanger les agaroses fondus avec un milieu 2 XMEM stérile dans un flacon stérile, selon un rapport de un pour un. Placer le flacon contenant cette solution de recouvrement dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu'à son utilisation.À la fin de l'incubation d'une heure, aspirez l'inoculum de chaque puits et ajoutez lentement deux millilitres de la solution de recouvrement dans chaque puits, en veillant à placer la pointe de pipette contre la paroi de chaque puits. Pour éviter de détacher les cellules, couvrez les plaques et laissez le recouvrement durcir environ 10 minutes à température ambiante. Puis transférez les plaques dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 48 heures.À la fin de la période d'incubation, examiner les boîtes pour détecter la présence de plaques. Si aucune plaque n'est visible, remettre les boîtes dans l'incubateur, puis vérifier à nouveau après quatre heures. Répéter la procédure si nécessaire, mais l'incubation ne doit pas dépasser 72 heures.Préparez d'abord la solution de coloration au rouge neutre. Ajoutez ensuite deux millilitres de solution de rouge neutre dans chaque puits pour ce protocole ; la fiche aros n'a pas besoin d'être retirée. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant une heure.Une fois le temps d'incubation écoulé, vérifiez la présence de plaques sur les boîtes tout en conservant la solution de rouge neutre dans les puits. Si aucune coloration n'est apparente, incubez les boîtes encore une heure, pour un maximum de trois heures. Dès que les plaques deviennent visibles, aspirez délicatement la solution de rouge neutre en veillant à ne pas perturber le bouchon apparu, puis procédez au comptage des plaques.Examinez les boîtes et identifiez la dilution pour laquelle les plaques sont clairement séparées. Placez la boîte sur une boîte lumineuse et comptez les plaques en marquant d'un point celles déjà comptées afin d'éviter les doubles comptages.Ensuite, répétez le dénombrement sur un puits ayant une dilution différente du virus et calculez la titration virale en unités formant des plaques par millilitre. Conformément aux instructions du protocole écrit, cette image représentative montre une monocouche avant infection. Les cellules RAW 264.7 ont été cultivées pendant la nuit et observées au microscope optique avec un grossissement de 20 fois.Cette image montre le même monocouche après la formation de plaques. Les cellules ont été colorées avec une solution de rouge neutre à 0,01 % après 48 heures d'infection et observées au microscope optique avec un grossissement de quatre fois. Les chiffres romains un, deux et trois indiquent trois plaques visibles.Cette image montre une plaque à la fin du protocole de dosage des plaques, avec des puits en double de trois dilutions décimales étiquetés avec des chiffres romains. Les puits un et quatre correspondent à la dilution 10 à la puissance moins un. Les puits deux et cinq correspondent à la dilution 10 à la puissance moins deux, et les puits trois et six correspondent à la dilution 10 à la puissance moins trois.Le titre viral de l'échantillon est indiqué ci-dessous. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de changer les embouts de pipette entre chaque dilution afin d'éviter toute contamination croisée entre les échantillons, d'équilibrer les solutions à la température appropriée et de ne pas laisser sécher les monocouches cellulaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer un dosage par plaques et de quantifier les particules infectieuses de mi neurovirus.N'oubliez pas que lors de travaux avec le norovirus Mira dans une hotte de sécurité biologique, des précautions telles que le port de gants et d'une blouse doivent toujours être prises pendant l'exécution de cette procédure, et que les déchets doivent être éliminés correctement conformément aux directives établies par votre comité local de biosécurité.

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