Essai de plaque pour le norovirus murin

L'objectif général de cette procédure est de quantifier les particules de norovirus neuronales infectieuses. Cela est réalisé en préparant tout d'abord une dilution au dixième de l'inoculum viral. La deuxième étape consiste à transférer la dilution de l'inoculum viral sur une monocouche RAW 264.7 et à incuber les plaques en agitant à température ambiante pendant une heure.

Ensuite, aspirez l'inoculum et recouvrez-le d'un mélange équivalent (1:1) de milieu de plaque C et de deux XMEM, puis incubez les plaques pendant 48 heures dans un incubateur de culture tissulaire. L'étape finale consiste à recouvrir les plaques d'une solution de coloration au rouge neutre et à les incuber de une à trois heures dans un incubateur de culture tissulaire. Enfin, la solution de coloration au rouge neutre est soigneusement aspirée sans retirer la couche de plaque présente, puis les plex sont dénombrés à l'aide d'une boîte lumineuse.

Cette méthode de quantification des particules virales infectieuses peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du norovirus, telles que la quantité de particules infectieuses excrétées dans les selles ou les tissus qui favorisent l'infection. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés à maintenir des cellules saines et viables tout au long du test. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car le test de plaque pour le norovirus miroir peut être difficile à comprendre pour les personnes sans expérience préalable.

L'achèvement réussi de ce test repose sur une série cumulative d'étapes nécessitant une quantité adéquate de cellules, une température correcte et une manipulation précise afin d'observer facilement les plaques. Examinez d'abord la monocouche cellulaire au microscope optique pour vérifier la morphologie des cellules. La majorité des cellules doivent apparaître rondes.

Ne laissez pas les cellules surcroître car elles ne formeront généralement pas de plaques ; pour préparer un flacon de culture tissulaire de 175 centimètres carrés presque confluent de cellules RAW 264.7 destiné au test de plaque du virus neurotrope murin, aspirez le milieu du flacon et ajoutez 10 millilitres de DMEM 10 frais aux cellules. Ensuite, grattez les cellules du fond du flacon à l’aide d’un grattoir à cellules et utilisez une pipette de 10 millilitres pour aspirer puis expulser la suspension cellulaire contre le fond du flacon. Répétez cette opération au moins trois fois afin de rompre les éventuels agrégats cellulaires.

Pour adapter un flacon stock. Prélever un à deux millilitres de suspension cellulaire et les déposer dans un nouveau flacon carré de 175 centimètres carrés contenant 33 à 34 millilitres de DMEM 10. Incuber le flacon dans un incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours, puis effectuer à nouveau un massage.

Une fois le complément ajouté pour ensemencer les plaques destinées au test, ajustez la densité de la suspension cellulaire à un fois dix puissance six cellules viables par millilitre dans du DMEM 10 et ajoutez deux millilitres de cette suspension dans chaque puits d'une plaque de 3,5 centimètres de diamètre à six puits. Fermez la plaque, puis agitez-la manuellement pendant 10 secondes pour répartir uniformément les cellules dans les puits.

Ne pas surcharger la plaque car cela provoquerait l'agrégation des cellules au centre du puits. Ensuite, placer la plaque dans un incubateur de culture tissulaire pendant au moins quatre heures, ou idéalement toute la nuit, pour permettre l'attachement des cellules. L'inoculum viral peut être obtenu à partir de tissus homogénéisés infectés par le MNV ou d'échantillons fécaux de souris infectées par le MNV. Si l'on utilise des échantillons de tissus, placer un morceau de tissu de la taille d'un petit pois dans un tube de deux millilitres à visser contenant des billes de silice stériles et un millilitre de DMEM 10, puis homogénéiser ici.

Un homogénéisateur est utilisé à 6 000 tr/min pendant une minute. Si l'on utilise des échantillons fécaux, homogénéiser au maximum trois granules fécaux de la même manière, congeler les échantillons homogénéisés à moins 80 degrés Celsius, puis décongeler l'inoculum le jour du dosage des plaques. Utiliser une pipette répétitive pour distribuer 1,35 millilitre de DMEM cinq dans chaque puits d'une plaque de 24 puits, puis pipeter 0,15 millilitre de l'inoculum viral au troisième passage dans le premier puits de la plaque.

Effectuez des dilutions sériées d’un facteur dix en aspirant 0,15 millilitre de la première dilution 10 à la puissance moins un et en la transférant dans le deuxième puits de la plaque pour obtenir une dilution 10 à la puissance moins deux. Répétez ensuite le processus avec la dilution du deuxième puits afin d’obtenir une dilution 10 à la puissance moins trois. Notez qu’il peut être nécessaire de réaliser des dilutions supplémentaires jusqu’à 10 à la puissance moins neuf, selon l’échantillon.

Une fois les dilutions séries préparées, étiquetez les plaques contenant des cellules RAW 264,07 à 60 à 80 % de confluence avec les noms des échantillons et les dilutions utilisées. Ensuite, retirez tout le milieu d'une des plaques en aspirant ou en secouant, puis ajoutez 0,5 millilitre d'un échantillon dilué dans un puits. Répétez l'opération dans un puits en double, puis passez à la dilution inférieure suivante.

Une fois les trois dilutions ajoutées en double sur une même plaque, inclinez la plaque d'avant en arrière pour vous assurer que toutes les cellules ont été recouvertes. Répétez la procédure avec la plaque de cellules suivante. Une fois que toutes les plaques ont été traitées, placez-les sur un agitateur rotatif réglé à environ 18 oscillations par minute pendant une heure à température ambiante, puis chauffez au micro-ondes un flacon d'agarose préalablement préparé ou encapsulé jusqu'à ce qu'il soit fondu.

Ensuite, placer les agaroses fondus dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pour les équilibrer à la température. Puis, mélanger les agaroses fondus avec un milieu 2 XMEM stérile dans un flacon stérile, selon un rapport de un pour un. Placer le flacon contenant cette solution de recouvrement dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu'à son utilisation.

À la fin de l'incubation d'une heure, aspirez l'inoculum de chaque puits et ajoutez lentement deux millilitres de la solution de recouvrement dans chaque puits, en veillant à placer la pointe de pipette contre la paroi de chaque puits. Pour éviter de détacher les cellules, couvrez les plaques et laissez le recouvrement durcir environ 10 minutes à température ambiante. Puis transférez les plaques dans l'incubateur de culture tissulaire pendant 48 heures.

À la fin de la période d'incubation, examiner les boîtes pour détecter la présence de plaques. Si aucune plaque n'est visible, remettre les boîtes dans l'incubateur, puis vérifier à nouveau après quatre heures. Répéter la procédure si nécessaire, mais l'incubation ne doit pas dépasser 72 heures.

Préparez d'abord la solution de coloration au rouge neutre. Ajoutez ensuite deux millilitres de solution de rouge neutre dans chaque puits pour ce protocole ; la fiche aros n'a pas besoin d'être retirée. Incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Une fois le temps d'incubation écoulé, vérifiez la présence de plaques sur les boîtes tout en conservant la solution de rouge neutre dans les puits. Si aucune coloration n'est apparente, incubez les boîtes encore une heure, pour un maximum de trois heures. Dès que les plaques deviennent visibles, aspirez délicatement la solution de rouge neutre en veillant à ne pas perturber le bouchon apparu, puis procédez au comptage des plaques.

Examinez les boîtes et identifiez la dilution pour laquelle les plaques sont clairement séparées. Placez la boîte sur une boîte lumineuse et comptez les plaques en marquant d'un point celles déjà comptées afin d'éviter les doubles comptages.

Ensuite, répétez le dénombrement sur un puits ayant une dilution différente du virus et calculez la titration virale en unités formant des plaques par millilitre. Conformément aux instructions du protocole écrit, cette image représentative montre une monocouche avant infection. Les cellules RAW 264.7 ont été cultivées pendant la nuit et observées au microscope optique avec un grossissement de 20 fois.

Cette image montre le même monocouche après la formation de plaques. Les cellules ont été colorées avec une solution de rouge neutre à 0,01 % après 48 heures d'infection et observées au microscope optique avec un grossissement de quatre fois. Les chiffres romains un, deux et trois indiquent trois plaques visibles.

Cette image montre une plaque à la fin du protocole de dosage des plaques, avec des puits en double de trois dilutions décimales étiquetés avec des chiffres romains. Les puits un et quatre correspondent à la dilution 10 à la puissance moins un. Les puits deux et cinq correspondent à la dilution 10 à la puissance moins deux, et les puits trois et six correspondent à la dilution 10 à la puissance moins trois.

Le titre viral de l'échantillon est indiqué ci-dessous. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de changer les embouts de pipette entre chaque dilution afin d'éviter toute contamination croisée entre les échantillons, d'équilibrer les solutions à la température appropriée et de ne pas laisser sécher les monocouches cellulaires. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'effectuer un dosage par plaques et de quantifier les particules infectieuses de mi neurovirus.

N'oubliez pas que lors de travaux avec le norovirus Mira dans une hotte de sécurité biologique, des précautions telles que le port de gants et d'une blouse doivent toujours être prises pendant l'exécution de cette procédure, et que les déchets doivent être éliminés correctement conformément aux directives établies par votre comité local de biosécurité.