Name: Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Découvrez une méthode d'analyse du profil métabolique in vivo chez les embryons de poisson zèbre. Cette technique permet d'évaluer la fonction mitochondriale dans un contexte d'organisme entier et d'étudier les effets de manipulations génétiques ou pharmacologiques.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du personnel du Fonds pour l&#39;Université de Deakin poisson zèbre pour fournir d&#39;excellents soins d&#39;élevage en cours. YG est soutenu par une bourse de recherche postdoctorale Alfred Deakin et une subvention de recherche du Centre de l&#39;Université Deakin. SLM est pris en charge par une bourse de développement de carrière NHMRC. ACW est soutenu par une subvention NHMRC d&#39;habilitation. Tous les auteurs sont pris en charge par le Centre de recherche sur la recherche moléculaire et médicale à l&#39;Université Deakin stratégique.

Partie 1: Traitement chimique des embryons de poisson zèbre <ol><li> Recueillir des embryons de poisson zèbre après la fécondation. Incuber à 28,5 ° C dans du milieu E3 dans 100 × 15 mm boîtes de Pétri. Remarque: Pour l&#39;hybridation in situ ou d&#39;huile rouge-O coloration, le 1-phényl-2-thio-urée (PTU) à une concentration finale de 0,2 mM est ajouté à inhiber la formation de pigment, 1 mais n&#39;est pas nécessaire pour l&#39;analyse hippocampe. </li><li> Pour les études pharmacologiques, ajouter le produit chimique nécessaire à une concentration finale appropriée pour le développement d&#39;embryons de poisson zèbre à environ 26 h après la fécondation (HPF) avec un véhicule approprié seule commande. Remarque: sensibles à la lumière inhibiteurs pharmacologiques, les embryons peuvent être autorisés à se développer dans l&#39;avant sombre à l&#39;analyse. </li></ol> Partie 2: Profil métabolique direct Utilisation de l&#39;hippocampe XF 24 Analyseur <ol><li> Avant chaque essai, la cartouche d&#39;hippocampe XF analyseur 24 qui abrite le 2 O et H <sjusqu&#39;à +&gt; fluorophores est étalonné par un processus automatisé effectuée par l&#39;analyseur. </li><li> Préparation de la plaque de 24 puits XF îlot 24. La séquence expérimentale suivante est utilisée: <ol><li> Comme la consommation d&#39;oxygène est sensible aux variations de température, quatre puits sont utilisés pour contrôler les fluctuations de température possibles à travers la plaque. Ces puits ne contiennent pas d&#39;embryons, mais sont remplis avec 700 pi de milieu E3 (figure 2A). </li><li> Les 20 autres puits (voir partie 2.2) sont remplies avec 700 ul de milieu E3 et un embryon de chacun (figure 2B). </li><li> Pour chaque expérience, 10 embryons sont traités avec le véhicule seul (témoin) et 10 patients traités avec des produits chimiques inhibiteur (traité). Embryons témoins et traités sont alternés (par exemple, ainsi A2: embryon de contrôle; ainsi A3: embryon traité: A4 ainsi: embryon de contrôle; ainsi embryon A5 traités, etc.) </li><li> Un îlot de capture d&#39;écran est ajouté sur le dessus de. chaque puits afin de s&#39;assurer que l&#39;échantillon reste dans la chambre de mesure tout au long de l&#39;essai (figure 2B) Remarque: traités chimiquement embryons restent avec leur solution chimique d&#39;origine pendant toute la procédure, sans qu&#39;il soit nécessaire de laver le produit chimique avant l&#39;exécution de l&#39;analyseur Seahorse programme. </li><li> Une fois terminé, la plaque est chargé dans l&#39;analyseur hippocampe et le test est commencé. </li></ol></li><li> L&#39;analyse des échantillons. Deux tests différents sont effectués régulièrement. <ol><li> Basale programme de la respiration respiration / maximum (durée environ 90 min.). Altérations de la respiration basale sous-tendent la dysfonction métabolique, tandis que la respiration maximale est une mesure de la capacité de production d&#39;énergie totale et des modifications de ce paramètre associé à un certain nombre de pays à la fois physiologiques et pathologiques. La capacité respiratoire de secours, ou la capacité du système pour augmenter encore la production d&#39;ATP, est également calculéà partir de ce test par la soustraction de base de respiration maximale. Trois répétitions de chaque mélange (2 min) / d&#39;attente (1 min) / mesure (2 min) cycle est effectué d&#39;abord établir la respiration basale. A la fin du troisième cycle, une concentration finale de 2,5 uM de FCCP (mitochondrial protonophore / découpleur) est ajouté à chaque puits permettant la mesure de la respiration maximale. Le cycle de mesure est répété de 5 à 8 fois (figure 3). </li><li> Programme ATP fuite chiffre d&#39;affaires / Proton (durée environ 60 min.). La respiration à cause de renouvellement de l&#39;ATP représente la fonction majeure de mitochondries dans la forme de la production d&#39;ATP, tandis que la respiration à cause de fuite de protons, ou la respiration découplée, est inextricablement liée à d&#39;autres paramètres de la fonction mitochondriale dont la respiration basale et formation d&#39;espèces réactives d&#39;oxygène. Respiration en raison du roulement ATP est représenté par la différence de respiration après l&#39;addition de 25 pM oligomycine (un inhibiteur de l&#39;ATP synthase) par rapport à la respiration basale. Respiration désaccouplée, ou en raison de la respiration fuite de protons, est déterminée en calculant la différence entre oligomycine médiée par la respiration et la respiration après l&#39;addition de 25 pM roténone (un inhibiteur du complexe I). Cycles de mesure sont répétées 8 fois après l&#39;addition de chaque inhibiteur mitochondrial. </li></ol></li></ol> A la fin des essais, les valeurs moyennes de la commande 10 et 10 embryons traités chimiquement sont calculés. Partie 3: huile rouge O coloration <ol><li> Embryons à 50 hpf sont dechorionated l&#39;aide de pinces fines et fixées dans 4% PFA nuit à 4 ° C. </li><li> Huile rouge O-coloration est effectuée, comme décrit précédemment 2 (voir Figure 4). </li></ol>

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li>
<li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652(2011).</li>
<li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li>
<li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes%3A+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li>
<li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Endocrinol.+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li>
<li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li>
<li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li>
<li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le poisson zèbre est un modèle génétique bien établie à la fois vers l&#39;avant (ENU mutagenèse) et arrière (Tilling, doigt de zinc nucléase ciblée knock-out, knock-down morpholino) 3,4 approches génétiques, tandis que la fonction des gènes dans les embryons de poisson zèbre peut également être facilement bloqué ou activé l&#39;aide sélective de composés pharmacologiques spécifiques pour les produits codés. En raison de leur développement externe et de petite taille, embryons de poisson zèbre sont particulièrement adaptés à l&#39;analyse métabolique. Cependant, la mesure robuste du profil métabolique et la fonction mitochondriale in vivo chez des embryons de poisson zèbre n&#39;a pas été atteint, avec une seule description préliminaire rapportée 5. Analyse Seahorse a été conçu à l&#39;origine pour les études métaboliques cellulaires et a été démontré pour donner des résultats précis et fiables 6. L&#39;application de cette nouvelle méthode d&#39;embryons de poisson zèbre est importante, et susceptible d&#39;augmenter le plus large utilisation de ce modèle pour les études métaboliques. Dans cette étude, nous démontrons la mesure de toute une gamme de paramètres de la respiration dans les embryons de poisson zèbre à l&#39;aide de l&#39;analyseur Seahorse, y compris la respiration basale, la respiration maximale, la capacité respiratoire de secours, renouvellement de l&#39;ATP et la fuite de protons. Nous fournissons également un exemple de la façon dont ces mesures peuvent être mises en corrélation avec d&#39;autres paramètres physiologiques, dans ce cas, l&#39;accumulation de lipides et de l&#39;utilisation d&#39;inhibiteurs pharmacologiques de ce système de dosage. Combinée à l&#39;utilisation d&#39;organismes génétiquement modifiés par les embryons, cela donne une puissante plate-forme expérimentale pour la compréhension des facteurs qui influent sur le métabolisme. Il existe une variété d&#39;applications pour cette nouvelle méthodologie, un dysfonctionnement mitochondrial est impliqué dans de nombreuses maladies humaines, telles que le diabète sucré 7, l&#39;obésité 8, la sclérose en plaques 9, la maladie de Parkinson 10, la maladie d&#39;Alzheimer 11 et certains types de cancers 12. Surtout, our travail est effectuée in vivo, où les influences de l&#39;environnement - tels que les cytokines, lié au développement de croissance etc - sont actifs, en fournissant ainsi une vue physiologiquement pertinente de la respiration et le profil métabolique in vivo. Comme les écrans chimiques sont aussi couramment effectuée dans le type sauvage et mutantes embryons de poisson zèbre fond (figure 1), les produits pharmaceutiques novateurs que la respiration influence, la fonction mitochondriale ou le métabolisme pourrait être facilement identifiés à l&#39;aide de l&#39;analyseur hippocampe. Les résultats obtenus en utilisant l&#39;analyseur hippocampe pourrait être utilisée en conjonction avec d&#39;autres dosages de fournir des informations supplémentaires. Cela peut inclure l&#39;analyse physiologique, tels que l&#39;huile rouge de coloration, ou l&#39;analyse moléculaire, telles que l&#39;hybridation in situ pour les marqueurs adipocytaires spécifiques tels que cebpα, PPARa, PPARy, etc SAF Il reste quelques limites à cette méthode. Bien que nous et d&#39;autres avons pu utiliser oligomycine à la mesureure la production d&#39;ATP et de fuite de protons sur les embryons jeunes 5 (voir figure 3), dans des embryons de plus de 60 hpf oligomycine traitement est inefficace. Nous croyons que dans les anciens embryons oligomycine ne peut pas diffuser aussi facilement que chez les jeunes embryons rendant les résultats impossibles à interpréter. Comme les résultats oligomycine sont obligatoires pour la détermination de la respiration à cause de renouvellement de l&#39;ATP et la respiration découplée, nous étudions actuellement des concentrations plus élevées de oligomycine pour les anciens embryons. Cependant, antimycine A traitements restent efficaces plus longtemps, avec d&#39;autres mesures, telles que la respiration basale, la respiration maximale et la capacité respiratoire de secours, peut être effectuée dans embryons de poisson zèbre âgés, jusqu&#39;à 68 hpf (non représentée). Une autre limitation dans l&#39;utilisation de la configuration actuelle Seahorse Analyser est l&#39;espace physique au sein de chaque plaque de capture et d&#39;îlots, de sorte qu&#39;ils ne conviennent que pour les embryons de poisson zèbre et les jeunes larves. Par conséquent, l&#39;exécution metabolic études sur le régime alimentaire induite par l&#39;obésité chez les poissons adultes, par exemple, n&#39;est pas encore techniquement possible. Cependant, cette étude pourrait inciter le développement des plaques spécialement conçues pour les poissons juvéniles et adultes, étendant ainsi la portée des analyses possibles.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> XF 24 analyseur de flux extracellulaire </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100737-101 </td><td> Format 24 puits </td></tr><tr><td> Microplaque capture Islet </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101122-100 </td><td> Format 24 puits </td></tr><tr><td> XF Calibrant Solution </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de dosage XF </td><td> Seahorse Bioscience </td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td> Huile rouge O- </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1-phényl-2-thio-urée (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td><td>/ Zfbook/chapt10.html # wptohtml51 &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3 (moyenne embryonnaire) </td><td> Self made </td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html # wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100x15 mm boîtes de Pétri </td><td> Faucon </td><td> 35-1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td> Sigma </td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td> Oligomycine </td><td> Sigma </td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td> Un antimycine </td><td> Sigma </td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

L&#39;un des objectifs de plus en plus dans le domaine du métabolisme est de déterminer l&#39;impact de la génétique sur les différents aspects de la fonction mitochondriale. La compréhension de ces relations aidera à comprendre l&#39;étiologie sous-jacente à toute une gamme de maladies liées à un dysfonctionnement mitochondrial, comme le diabète et l&#39;obésité. Les récents progrès dans l&#39;instrumentation, a permis à la surveillance des paramètres distincts de la fonction mitochondriale dans des lignées cellulaires ou des explants de tissus. Nous présentons ici une méthode pour une analyse rapide et sensible des paramètres de la fonction mitochondriale in vivo au cours du développement embryonnaire du poisson zèbre en utilisant le Seahorse biosciences XF 24 analyseur de flux extracellulaire. Ce protocole utilise la capture Islet microplaques où un seul embryon est placé dans chaque puits, permettant la mesure de la bioénergétique, y compris: (i) la respiration de base, (ii) la respiration mitochondriale basale (iii) la respiration mitochondriale en raison de renouvellement de l&#39;ATP, (iv) des mitochondries respiration découplée ou prOton fuite et de la respiration maximale (iv). En utilisant cette approche embryonnaires paramètres de la respiration du poisson zèbre peut être comparé entre le type sauvage et d&#39;embryons génétiquement modifiés (mutants, la sur-expression du gène ou inactivation génique) ou les manipuler pharmacologiquement. Il est prévu que la diffusion de ce protocole permettra aux chercheurs de nouveaux outils pour analyser les bases génétiques des maladies métaboliques in vivo dans ce modèle animal vertébré pertinente.

<html> Nous sommes intéressés à comprendre le rôle des gènes spécifiques sur le métabolisme, en particulier le taux de respiration et le métabolisme des lipides. Par conséquent, nous avons traité sauvages embryons de poisson zèbre à partir du mois de type HPF 26 avec un inhibiteur pharmacologique spécifique de l&#39;enzyme codée par l&#39;un de ces gènes. À 50 hpf, la moitié du véhicule et un inhibiteur embryons traités ont été analysées en utilisant le Seahorse pour la fonction mitochondriale, tandis que l&#39;autre moitié a été fixé à 4% PFA nuit à 4 ° C et ensuite colorées pour le dépôt des lipides avec de l&#39;huile-rouge-O. Le traitement par l&#39;inhibiteur de l&#39;enzyme spécifique mené une ~ 2 fois plus de respiration basale (figure 4A), qui a été associée à une augmentation des dépôts de lipides en particulier dans le télencéphale et au-dessous de la vésicule otique (Figure 4B, C). pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Représentation schématique du traitement chimique des embryons de poisson zèbre. Type sauvage, génétiquement manipulés, ou pharmacologiquement traitées embryons de poisson zèbre sont arrière-plan. <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> Figure 2. XF24 plaque îlot mis en place. (A) Quatre puits contiennent un milieu embryonnaire seulement comme contrôle de la température (marqué par un X) et les autres contiennent un embryon / puits. (B) Close-up d&#39;un puits (C6) montrant un embryon de 50 hpf type sauvage traitées avec le véhicule (DMSO) couvert par une capture d&#39;écran îlot (tête de flèche). <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> Figure 3. Respiratparamètres d&#39;ions de type sauvage pour 50 embryons de poisson zèbre HPF. (A) Pour chaque mesure, la moyenne des 20 embryons individuels est présenté. Respiration basale (moyenne: 299,7; SD: 75,7; SEM: 16,9), la respiration maximale (moyenne: 387,4; SD: 93,3; SEM: 20,9), la capacité respiratoire de secours (moyenne: 87,7; SD: 72,0; SEM: 16,1). (B) pour chaque mesure, la moyenne des résultats individuels 20 est présenté. Basale respiration mitochondriale; respiration mitochondriale en raison de renouvellement de l&#39;ATP; mitochondrial respiration découplée et non mitochondrial respiration. Mt: mitochondriale; SRC: Pièce de rechange Capacité respiratoire; SD: écart-type, SEM: erreur standard de la moyenne. Les résultats sont présentés en pmoles de O 2 consommée / min / embryon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Représentantdes résultats représentatifs de l&#39;exposition chimique sur la respiration basale et le dépôt de lipides. (A, B) 50 embryons hpf colorées avec l&#39;huile rouge O en vue latérale. L&#39;embryon incubé avec l&#39;inhibiteur sélectif (B) affiche plus d&#39;huile coloration rouge-O dans le télencéphale (tête de flèche) et en dessous de la vésicule otique (flèche) par rapport à un embryon de contrôle traité par le véhicule. (C) la respiration basale montre un ~ 2 fois plus chez les embryons traités chimiquement (n = 10 embryons par groupe). Les résultats sont présentés en pmoles de O 2 / min / embryon.

Poisson-zèbre constituent un modèle vertébré puissant qui a été sous-utilisée pour les études métaboliques. Nous décrivons ici un moyen rapide pour mesurer la<em&gt; In vivo</em&gt; Profil métabolique du poisson zèbre développement qui permet de comparer les différents paramètres de la fonction mitochondriale entre génétiquement ou pharmacologiquement embryons manipulés, ce qui augmente l&#39;applicabilité de cet organisme.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

Un objectif croissant dans le domaine du métabolisme est de déterminer l'impact de la génétique sur différents aspects de la fonction mitochondriale. Comprendre ces...

L'objectif général du protocole suivant est de mesurer le profil métabolique d'embryons de poisson zèbre en réponse à des altérations génétiques ou physiologiques spécifiques. Cela est réalisé en modulant d'abord une voie génétique ou physiologique particulière à l'aide d'un composé pharmacologique sélectif. Ensuite, lorsque les stades de développement souhaités sont atteints, la respiration basale est mesurée chez les embryons témoins et traités à l'aide de l'analyseur Seahorse XF 24.Ensuite, les paramètres de respiration sont calculés à partir des données ; les résultats obtenus montrent que les profils métaboliques peuvent être étudiés chez le poisson-zèbre en développement in vivo, et que ces profils peuvent être modulés en ciblant un gène spécifique au cours du développement embryonnaire. Le principal avantage de cette méthode par rapport aux techniques déjà disponibles, telles que les tests cellulaires ou les mesures indirectes de la respiration, réside dans le fait que l'on travaille avec l'organisme entier, un embryon complet, ce qui nous permet d'examiner tous les aspects de la respiration mitochondriale. Cette technique peut aider à répondre à des questions clés en métabolisme en mesurant la respiration de l'animal entier et la fonction mitochondriale.Pour commencer le traitement, récupérez les embryons de poisson zèbre après fécondation pour une hybridation in situ ou une coloration au rouge d'huile O à 0,2 millimolaire d'1-phényl-2-thiosemicarbazide. Pour empêcher la formation de pigments, incubez les embryons pendant environ 26 heures. Ajoutez le composé désiré à une concentration finale appropriée, en incluant un témoin avec véhicule uniquement, avant d'utiliser l'analyseur Seahorse XF 24 ; effectuez l'étalonnage qui met en place les capteurs de fluoroxygène et de flux d'hydrogène afin de préparer la plaque XF 24 à 24 puits pour îlots.Commencez par ajouter 700 microlitres de milieu E trois à chacun. Ensuite, ajoutez un embryon à 20 des puits afin de garantir que l'échantillon reste dans la chambre de mesure. Pendant tout le dosage, appliquez un tamis de capture à œillet sur le dessus de chaque puits.10 des puits sont utilisés pour les embryons témoins, indiqués par un C, et 10 des puits sont utilisés pour les embryons traités, indiqués par un T. Les boîtes noires indiquent les puits sans embryons, qui servent à contrôler les fluctuations de température à travers la plaque. Placez maintenant la plaque dans l'analyseur Seahorse. Pour mesurer la respiration, utilisez le programme de respiration basale et respiration maximale afin d'établir la respiration basale.Effectuez trois mesures de deux minutes chacune, en attendant une minute entre chaque mesure, puis ajoutez le coupleur mitochondrial FCCP à une concentration finale de 2,5 micromolaire. Répétez le cycle de mesure de cinq à huit fois après avoir établi la respiration basale. Utilisez le programme de « renouvellement des protons de la ATPase » pour mesurer le renouvellement de l'ATP en présence de 25 micromolaires d'oligomycine, un inhibiteur de la synthase de l'ATP, puis effectuez huit cycles de mesure.Ensuite, utilisez les valeurs de respiration obtenues pour calculer la différence entre la respiration liée au ligand et la respiration médiée, d'une part, et la respiration basale, d'autre part. Répétez ce processus en ajoutant 25 micromolaire de rotenone, un inhibiteur du complexe I. Déterminez ensuite la respiration découplée en calculant la différence entre la respiration médiée et la respiration après l'ajout de rotenone une fois le programme terminé.L’analyseur Seahorse calcule les valeurs moyennes des 10 embryons témoins et des 10 embryons traités chimiquement afin d’effectuer la coloration au rouge O pour analyser le dépôt lipidique. Lorsque les embryons traités et non traités atteignent 50 heures post-fécondation, utilisez une pince fine pour les manipuler et les fixer dans du paraformaldéhyde 4 % en PBS toute la nuit à quatre degrés Celsius.Lavez les embryons une fois dans le PBT pendant cinq minutes, puis incubez-les dans du 60 % d’isopropanol pendant une heure, suivie de deux heures dans du 0,3 % d’huile rouge O et du 60 % d’isopropanol. Rincez brièvement les embryons deux fois dans du 60 % d’isopropanol, puis une fois dans le PBT. Transférez enfin les embryons de 30 à 50, puis à 75 % de glycérol pour la photographie comme indiqué ici. Le traitement des embryons avec un inhibiteur enzymatique spécifique a entraîné une augmentation d’environ deux fois la respiration, associée à un accroissement du dépôt lipidique, particulièrement dans le céphalon et sous la vésicule otique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de travailler avec des embryons au même stade de développement.Cela est particulièrement vrai lorsque vous comparez la respiration mitochondriale entre un embryon témoin et un embryon muté ou traité pharmacologiquement, qui pourrait présenter un léger retard de développement. Ainsi, le développement de cette technique a permis aux chercheurs spécialisés en métabolisme d'étudier la respiration et la fonction mitochondriale chez l'animal entier en utilisant le poisson-zèbre comme modèle de vertébré.

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Nous rapportons le développement d'un système automatisé pour l'imagerie et l'analyse des embryons de poisson zèbre transgénique dans des plaques multipuits. Ceci démontre la capacité de mesurer les effets dose-dépendante d'une petite molécule, la BCI, le Fibroblast Growth Factor expression du gène rapporteur et de fournir la technologie pour établir des écrans à haut débit chimiques du poisson zèbre.

Développement de l&#39;imagerie automatisée et d&#39;analyse pour les écrans chimiques du poisson zèbre.

Cette vidéo montre l’utilisation de la chromatographie en phase gazeuse dans l’espace de tête pour déterminer les concentrations d’éthanol dans les embryons de poisson-zèbre. Cette méthode constitue un outil utile pour l’analyse qualitative et quantitative des composés organiques volatils.

Chromatographie en phase gazeuse dans l’espace de tête : une technique pour évaluer la concentration d’éthanol dans les embryons de poisson-zèbre

Ici, nous rapportons un protocole pour mesurer le stress oxydatif chez les embryons de poisson-zèbre vivants. Cette procédure permet de détecter les espèces réactives de l’oxygène (ROS) à la fois dans les tissus embryonnaires entiers et dans les populations unicellulaires. Ce protocole permettra d’effectuer des analyses qualitatives et quantitatives.

Analyse du stress oxydatif dans embryons de poissons zèbres

Les poissons-zèbres sont un organisme modèle important pour l’étude de l’homéostasie énergétique.  En utilisant un indicateur redox sensible au NADH2, alamar Blue, nous avons mis au point un test qui mesure le taux métabolique des larves de poisson-zèbre dans un format de plaque à 96 puits et peut être appliqué à la découverte de médicaments ou de gènes.

High Throughput<em&gt; Danio rerio</em&gt; Dépense énergétique Assay

Ce protocole présente une approche pour l’analyse du transcriptome ensemble des embryons de poisson-zèbre, larves, ou trier des cellules. Nous incluons l’isolement de l’ARN, la voie analyse des données RNASeq et qRT-PCR-based validation des modifications de l’expression génique.

Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

Poisson zèbre servaient récemment un système de modèle in vivo pour étudier la synchronisation de réplication ADN au cours du développement. Voici détaillées les protocoles d’utilisation des embryons de poisson-zèbre à synchronisation de réplication de profil. Ce protocole peut être facilement adapté pour étudier la synchronisation de la réplication en mutants, types de cellules individuelles, les modèles de maladies et d’autres espèces.

Profilage ADN calendrier de réplication à l’aide de poisson-zèbre comme un système de modèle In Vivo

Ce travail décrit un protocole pour quantifier les niveaux d’éthanol dans un embryon de poisson zèbre à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de la tête à partir de méthodes d’exposition appropriées au traitement des embryons et à l’analyse de l’éthanol.

Quantification des niveaux d’éthanol dans les embryons de poisson zèbre à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de tête

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Ce protocole décrit une procédure de dépistage de médicaments chez les larves de poisson-zèbre 3 à 7 jours après la fécondation, suivie d’une évaluation morphologique.

Dépistage de petites molécules et essais de toxicité chez les larves de poisson-zèbre à un stade précoce

Les RASopathies sont des syndromes génétiques multisystémiques causés par l’hyperactivation de la voie RAS-MAPK. Des variants potentiellement pathogènes en attente de validation émergent en permanence alors que de mauvaises preuves précliniques limitent le traitement. Ici, nous décrivons notre protocole in vivo pour tester et valider les niveaux d’activation ERK associés à RASopathy et sa modulation pharmacologique au cours de l’embryogenèse par imagerie FRET en direct chez le poisson-zèbre...

Un protocole efficace pour évaluer la modulation de l’activité ERK dans des modèles précoces de poisson zèbre du syndrome de Noonan via la microscopie FRET en direct et l’immunofluorescence

Ce protocole décrit une méthode de microscopie optique peu coûteuse pour évaluer la morphologie et la fonction cardiaques chez les embryons de poisson-zèbre, permettant une évaluation reproductible de la cardiotoxicité pour le développement sans avoir besoin de systèmes d’imagerie avancés.

Imagerie cardiaque fonctionnelle chez les embryons de poisson-zèbre à l’aide de la microscopie standard et de l’analyse vidéo : applications dans la recherche environnementale et biomédicale

Découvrez une méthode d'analyse du profil métabolique in vivo chez les embryons de poisson zèbre. Cette technique permet d'évaluer la fonction mitochondriale dans un contexte d'organisme entier et d'étudier les effets de manipulations génétiques ou pharmacologiques.

Analyse du profil métabolique des embryons de poisson zèbre

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