Name: Énumération des principales populations de leucocytes périphériques sanguins pour essais cliniques multicentriques en utilisant un test de sang total Phénotypage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Découvrez une méthode standardisée d'énumération des leucocytes périphériques par cytométrie en flux pour essais cliniques multicentriques. Cette technique utilise des tubes TruCount et des anticorps fluorescents pour analyser le sang total frais.

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Nous tenons à remercier Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain et Stephen Voght pour leur aide dans l&#39;élaboration de cette méthode, manuscrits et vidéo. Ce travail a été soutenu par la Fondation Bill et Melinda Gates CAVD subvention 38 645 (MJM) et les Instituts nationaux de la santé de subventions UM1 AI068618 et AI069481 U01 (MJM). EA-N. est soutenu par des subventions du NIH T32 AI007140. Nous remercions le James B. Pendleton Charitable Trust pour leur don généreux équipement.

Remarque: Pour protéger les anticorps conjugués fluorophore de la lumière, effectuer toutes les étapes d&#39;une armoire de biosécurité avec la lumière éteinte. 1. Préparation du panneau anticorps présentent une coloration <ol><li> Le panneau de coloration des anticorps peuvent être trouvés dans le tableau 1. Concentration d&#39;anticorps doivent être définis par titrage avec du sang total et en utilisant le matériel de cytométrie en flux même et procédures qui seront utilisées pour acquérir des échantillons de phénotypage tachés. </li><li> Une fois les titres de coloration appropriées sont déterminées, mélanger tous les anticorps dans un seul mélange dans un tube lock-bouchon. Ajouter tampon de lavage débit (PBS de Dulbecco avec inactivé à la chaleur 2% de sérum de veau foetal) pour porter le volume total à 100 ml. L&#39;échelle du mélange pour le nombre d&#39;échantillons colorés. Ce mélange peut être conservé à 4 ° C pendant un maximum de huit semaines. </li></ol> 2. Tachant <ol><li> Si le sang prélevé doit être utilisé à d&#39;autres fins en annoncecondition à cet essai, mis de côté pendant une aliquote plus sensibles au temps procédures sont effectuées sur le sang restant. L&#39;aliquote peut être conservé à température ambiante pendant 4 heures après la ponction veineuse sans perte significative de cellules. </li><li> Vérifier l&#39;existence d&#39;un bourrelet intact culot au fond du tube et Trucount étiquette du tube pour identifier l&#39;échantillon est coloré. Dans les essais cliniques HVTN, le Laboratoire de gestion des données du système (Frontier Science et de la Technologie Research Foundation, Amherst, New York) est utilisé pour marquer et suivre les échantillons colorés. </li><li> Notez les numéros de lot et les dates d&#39;expiration de tous les réactifs. Notez le numéro de tube Trucount nombre bourrelet prévu par le fabricant sur le sac de tubes, assurez-vous que le numéro de lot sur le sac correspond au numéro de lot sur le tube. </li><li> Utiliser reverse pipetage avec précision pipette 100 ul de sang total dans le tube Trucount, juste au-dessus de la retenue en métal. Éviter sang bavures sur le côté du tube. </li><li&gt; Utilisation régulière (marche avant) technique de pipetage, pipette 100 ul du panneau de coloration des anticorps mixte (voir tableau 1) dans le tube Trucount. Boucher le tube et agiter au vortex à basse vitesse pendant environ 15 secondes pour mélanger. Inspecter visuellement le tube de sorte que le culot de billes est entièrement dissous. </li><li> Incuber le tube Trucount pendant 15 minutes à température ambiante (15-30 ° C) dans l&#39;obscurité. </li><li> Si nécessaire, diluer une partie aliquote de 10 x solution de lyse FACS à l&#39;aide 1X diH 2 O. Ajouter 900 pl 1 x solution de lyse FACS sur le tube. </li><li> Boucher le tube et vortexer soigneusement à faible vitesse pendant environ 15 secondes pour mélanger. Appuyer sur le bouchon fermement en position de verrouillage sur le tube et le joint avec le film de laboratoire. </li><li> Stocker le tube à -65 ° C à -95 ° C jusqu&#39;à ce que l&#39;échantillon est prêt pour l&#39;expédition au laboratoire central d&#39;analyse pour l&#39;analyse ou dans la maison. Les échantillons sont stables à ce stade pour au moins quatre semaines. En cas d&#39;envoi ou de dosage immédiatediatement, cette étape peut être omise. </li></ol> 3. Transport maritime Remarque: Les instructions suivantes utilisent un système d&#39;expédition isolé de Saf-T-Pak, Inc spécialement conçu pour expédition de catégorie B exemptés des substances biologiques selon l&#39;International Air Transport Association et (IATA). Si l&#39;analyse des échantillons dans le même emplacement que la coloration produite, passez à la section 4. <ol><li> Les échantillons peuvent être expédiés immédiatement après coloration ou une fois qu&#39;ils sont congelés à -65 ° C à -95 ° C. Envelopper chaque tube complètement en aluminium et les placer dans la boîte d&#39;échantillons colorés. Placez la boîte dans un échantillon coloré étanche poly-sac avec un matériau absorbant. </li><li> Placez le poly-sac étanche et contenu dans un sac de Tyvek et le joint avec le moins d&#39;air possible dans le sac. </li><li> Placez le paquet d&#39;échantillon (échantillon à l&#39;intérieur de l&#39;emballage secondaire) à l&#39;intérieur de la boîte intérieure brun. </li><li> Placez le brun intérieure bbœuf à l&#39;intérieur de la poitrine en styromousse, en le fixant dans le renfoncement pour éviter tout déplacement. </li><li> Remplissez la poitrine polystyrène avec de la glace sèche (environ 8 kg) et placez le couvercle fermement sur la poitrine. </li><li> Fixez solidement le carton d&#39;expédition et navire comme substance biologique de catégorie B (3373) avec la glace sèche correcte (UN1845) les marquages; suivre l&#39;IATA PI-650 instructions. </li><li> Dès réception, les échantillons sont stockés à -65 ° C à -95 ° C jusqu&#39;à leur analyse. </li></ol> 4. Dégel et de l&#39;analyse de cytométrie en flux <ol><li> Retirer l&#39;échantillon coloré du congélateur pour décongeler à la température ambiante dans l&#39;obscurité avant de recueillir sur le cytomètre en flux. Si la collecte des données sur plus d&#39;un échantillon, de normaliser le processus pour tous les tubes en échelonnant la décongélation sorte que les tubes ne sont pas assis à la température ambiante pendant plus de 1 heure chacune. </li><li> Les échantillons doivent être acquises en utilisant un cytomètre de flux laser quatre équipés de filtres appropriés, tels que le LSR BDII. Utilisez l&#39;étalonnage cytomètre standard et les méthodes de compensation de fluorescence pour la collecte des données 4. </li></ol> Remarque: Ne réglez pas avant seuils de dispersion de dispersion ou de côté lors de la collecte 5. Perles Trucount peut tomber sous le seuil de réglage le plus bas possible pour ces paramètres causant un sous-ensemble de perles pour ne pas être pris en compte lors de l&#39;analyse. Si requis par l&#39;instrument de fixer un seuil, fixé le plus bas possible Am Cyan canal de seuil. Parce CD45 + leucocytes colorés avec le panneau sera Am Cyan positif, et des perles Trucount également une fluorescence dans le canal Am Cyan, ce qui devrait permettre à toutes les données pertinentes soient dûment collectées. <ol start="3"><li> Vortexer le tube échantillon pendant 5 secondes avant le chargement sur le cytomètre en flux. Perles Trucount fluorescence fortement dans de nombreux canaux. Porte des perles pendant la collecte en trouvant la population qui est très positif pour les deux PE Cy5 et l&#39;APC (la colo deuxrs que la plupart aisément distinguer les perles à partir des cellules peut varier en fonction de l&#39;instrumentation). Sélectionnez la porte de perles de votre porte d&#39;arrêt, et enregistrer des données jusqu&#39;à au moins 20.000 perles sont acquises. </li><li> Analyser les données en utilisant un logiciel approprié, comme FlowJo (Treestar, à Ashland, OR). Figure 1 montre le schéma de déclenchement utilisé pour l&#39;analyse des différentes populations leucocytaires d&#39;une prise de sang de contrôle représentant. </li></ol> 5. Calculs Trucount <ol><li> Chaque tube contient une Trucount pastille lyophilisée de billes fluorescentes. Après addition de liquide dans le tube et un vortex, les billes doivent être répartis également dans l&#39;échantillon. Le nombre de perles dans le culot varie légèrement selon le numéro de lot et peuvent être consultés sur le sac de rangement pour les tubes. </li><li> Porte des perles Trucount et des populations cellulaires comme le montre la figure 1 pour déterminer le nombre d&#39;événements pour chaque population. En comparant le nombre d&#39;événements in la porte du talon le nombre total de billes à l&#39;origine dans le tube vous permettra de déterminer le rapport de l&#39;échantillon collectés, qui peut ensuite être utilisée pour déterminer la concentration absolue (c.-à-cellules / ul) pour chaque population. L&#39;équation suivante peut être utilisée à cette fin: concentration cellulaire (cellules / ul # sang total) = [# / population événements (événements perles # / # perles totales en granulés)] / 100 pi. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs <img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" /> Système d&#39;ouverture de porte Figure 1. Utilisés pour l&#39;analyse des principales populations de leucocytes contenant des données représentatives d&#39;un volontaire sain. A) Trucount perles (i) sont bloqués et exclues de cellules. Granulocytes (ii) sont délimitées et lympohcytes et les monocytes sont divisés en 3 popluations: CD14lymphocytes négatifs (iii), toutes les cellules CD14 négatives (iv), et non des lymphocytes (v). B) CD14 des lymphocytes négatifs sont déclenchés pour distinguer les cellules T CD4 (vi), lymphocytes T CD8 + (vii), les cellules B (viii), CD56 vives cellules NK (ix), CD56 dim cellules NK (x), et CD56 négatives des cellules NK (xi). C) Toutes les cellules CD14 négatives sont déclenchés à distinguer myéloïde (xii) et les cellules dendritiques plasmacytoïdes (xiii). D) Non-lympocytes sont déclenchés à distinguer non classiques (xiv), intermédiaires (xv), et classique (xvi) les monocytes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . Sous-ensembles de cellules plus spécifiques qui ne sont pas représentés dans la figure 1 (par exemple, les cellules NKT ou neutrophiles) peuvent également être distingués en utilisant le panneau de nous présenter, et le système de déclenchement peuvent être élargis ou modifiés pour répondre aux besoins particuliers de l&#39;étude. Certaines étapes de déclenchement indiquées sont uniques à cette méthode. On notera en particulier, un portail d&#39;inclusion etgrille exclusion sont entraînés autour des talons Trucount et placé au-dessus de l&#39;autre, une grille à billes pour le comptage, et pour exclure une des perles de l&#39;analyse cellulaire (Figure 1A). Aussi, parce que les lymphocytes, les monocytes et les granulocytes ne sont pas aussi faciles à distinguer dans le sang entier car ils sont dans les cellules mononucléées du sang périphérique par diffusion vers l&#39;avant et le côté de dispersion, ouverture de porte à l&#39;aide de ces cellules CD45 expression et la diffusion latérale est souvent nécessaire (figure 1A). Granulocytes contaminants (encerclée) qui ne pouvaient pas être séparés de lymphocytes et les monocytes CD45 et utilisant la diffusion latérale se distinguent dans certaines parcelles de leur grande expression CD16 (figure 1C et 1D figure). Le nombre de granulocytes contaminants est généralement faible, et ils n&#39;interfèrent pas avec déclenchement cellulaire de monocytes et NK.

<ol><li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells%3A+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li>
<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li>
<li>Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+granulocytes%3A+study+of+granulocyte+function+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure.</a> Blood. 56, 237-245 (1980).</li>
<li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).</li>
<li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li>
<li>Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+blood+processing+parameters+for+optimal+detection+of+cryopreserved+antigen-specific+responses+for+HIV+vaccine+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials.</a> J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).</li>
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<li>Hulspas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+the+stability+of+phycoerythrin-tandem+dye+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates.</a> Cytometry A. 75, 966-972 (2009).</li>
<li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li>
<li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6(2001).</li>
<li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li>
<li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis%3A+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li>
<li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets%3A+the+dendritogram%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans ce rapport, nous présentons une méthode basée sur cordon pour le dénombrement des populations de leucocytes dans le sang entier frais par cytométrie en flux et couvrir les paramètres nécessaires à son utilisation dans un essai clinique multicentrique avec analyse de l&#39;échantillon centralisée. Cette méthode s&#39;appuie sur le protocole et optimise BD Trucount et permet son utilisation fiable dans un cadre essai clinique multicentrique. L&#39;essai de coloration est simple et prend environ 45 minutes à remplir, ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Trucount absolus Tubes de comptage </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> FACS 10X solution de lyse </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> Catégorie B &amp; système d&#39;expédition exonéré, isolé </td><td> Saf-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> CD45 anticorps monoclonal AmCyan </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> CD3 FITC anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8 PerCP-Cy 5,5 anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa Fluor 700 Antibo monoclonaldy </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> HLA-DR DPE anticorps monoclonal </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> CD14 anticorps monoclonal V450 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> CD19 PE anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> CD16 APC-H7 anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> CD56 PE-Cy7 anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> CD123 PE-Cy5 anticorps monoclonal </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

Énumération des principales populations de leucocytes périphériques sanguins pour essais cliniques multicentriques en utilisant un test de sang total phénotypage

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

La cryoconservation des leucocytes du sang périphérique est largement utilisé pour conserver des cellules pour les évaluations de la réponse immunitaire dans les essais cliniques et offre de nombreux avantages pour la facilité et la standardisation des évaluations immunologiques, mais les effets néfastes de ce processus ont été observés sur certains sous-ensembles de cellules, telles que les granulocytes, les lymphocytes B , les cellules dendritiques et 1-3. Le dosage de leucocytes frais donne une image plus précise de l&#39;état dans vivo des cellules, mais il est souvent difficile à réaliser dans le cadre de vastes essais cliniques. Dosages de cellules fraîches dépendent des engagements volontaires et des délais, et si de temps, leur application peut être impossible en raison des heures de travail requis du personnel de laboratoire. En outre, lorsque les essais sont effectués dans plusieurs centres, les laboratoires avec les ressources et la formation nécessaires pour effectuer les dosages peuvent ne pas être situé à proximité suffisante de sites cliniques. Pour répondre à ces questions, nous avons développéloppé un panneau 11-couleur anticorps présentent une coloration qui peut être utilisé avec des tubes Trucount (Becton Dickinson, San Jose, CA) au phénotype et énumérer les principales populations de leucocytes dans le sang périphérique, ce qui donne plus robuste de type cellulaire renseignements précis que les tests comme un numération formule sanguine (CBC) ou des tests disponibles dans le commerce avec des panneaux conçus pour les tubes Trucount qui se colorent seulement pour quelques types cellulaires. La procédure de coloration est simple, ne nécessite que 100 ul de sang entier frais, et dure environ 45 minutes, ce qui permettrait aux standards du sang de traitement de laboratoires à effectuer. Il est adapté de la BD du tube Trucount fiche technique ( <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">la version 8/2010</a> ). Le cocktail d&#39;anticorps coloration peut être préparé à l&#39;avance en vrac à un laboratoire d&#39;analyse central et expédiés aux laboratoires de traitement sur place. Stained tubes peuvent être fixéset congelé pour expédition au laboratoire d&#39;analyse central pour analyse par cytométrie en flux multicolore. Les données générées par ce panneau coloration peut être utilisé pour suivre l&#39;évolution des concentrations de leucocytes dans le temps par rapport à l&#39;intervention et pourrait facilement être développé afin d&#39;évaluer l&#39;état d&#39;activation des types de cellules spécifiques d&#39;intérêt. Dans ce rapport, nous démontrons la procédure utilisée par les techniciens de laboratoire de sang de traitement pour exécuter des taches sur du sang total frais et les mesures pour analyser ces échantillons colorés dans un laboratoire de test central supportant un essai clinique multicentrique. Les détails sur la vidéo de la procédure telle qu&#39;elle est pratiquée dans le cadre d&#39;un prélèvement sanguin essai clinique de vaccin contre le VIH pour les essais Network (HVTN).

Dans ce rapport, nous démontrons les étapes de coloration et de l&#39;analyse d&#39;un test de phénotypage réalisé sur sang total frais d&#39;énumérer les principaux innées et adaptatives des populations leucocytaires. Nous insistons sur des considérations d&#39;effectuer ces procédures dans le cadre d&#39;un essai clinique multicentrique.

Énumération des principales populations de leucocytes périphériques sanguins pour essais cliniques multicentriques en utilisant un test de sang total Phénotypage

La cryopréservation des leucocytes du sang périphérique est largement utilisée pour conserver les cellules destinées aux évaluations de la réponse immunitaire dans le cadre d'essais cliniques et offre de nombreux...

Ce vidéo décrit la procédure mise au point par le réseau d'essais de vaccins contre le VIH du Fred Hutchinson Cancer Research Center pour la coloration de sang total frais dans le cadre d'essais cliniques multicentriques, destinée à être analysée par un laboratoire centralisé. La procédure utilise des tubes TruCount fabriqués par Becton Dickinson Biosciences, chacun contenant un comprimé lyophilisé qui se dissout lors de la préparation de l'échantillon, libérant ainsi un nombre connu de billes fluorescentes. Des anticorps fluorescents sont utilisés pour marquer des marqueurs de surface spécifiques à différentes populations cellulaires.Le nombre de cellules dans ces différentes populations peut être comparé au nombre de billes fluorescentes lors de l'analyse par cytométrie en flux, et les concentrations absolues de différentes populations de leucocytes dans le sang total peuvent être suivies au fil du temps en relation avec une intervention. Bonjour, je m'appelle Erica Anderson Nissan et je suis scientifique contractuelle au sein du Réseau d'essais cliniques sur les vaccins contre le VIH. La procédure que vous êtes sur le point de regarder est celle que nous avons mise au point pour être utilisée dans nos essais cliniques multicentriques.Dans ces essais, les techniciens de laboratoire chargés du traitement du sang reçoivent des échantillons frais de sang total, les marquent avec des anticorps marqués au fluorochrome, puis expédient les échantillons vers un laboratoire centralisé capable de les analyser par cytométrie en flux. Le sang total frais n'est souvent pas analysé dans le cadre d'essais cliniques en raison de contraintes liées au coût et à la faisabilité, mais nous avons mis au point un panel de marquage utilisant un seul anticorps permettant d'identifier les principales populations de leucocytes présents dans le sang périphérique, et ce marquage prend moins de 45 minutes, ce qui le rend applicable aux essais cliniques au sein du HVTN. Nous utilisons ce panel pour mieux comprendre les événements précoces survenant après la vaccination par des vaccins candidats contre le VIH, mais ce panel PI pourrait être davantage modifié afin de cibler des types cellulaires spécifiques selon les intérêts de chaque chercheur. Nous vous remercions vivement d'avoir suivi cette présentation et espérons qu'elle vous sera utile à l'avenir.Le tableau un présente un panel de coloration par anticorps à 11 couleurs, conçu pour phénotyper et dénombrer les principales populations de leucocytes présents dans le sang périphérique. Le cocktail d'anticorps est préparé par le laboratoire d'essai central et envoyé aux laboratoires de traitement afin d'assurer une cohérence entre les sites et permettre de tester les mélanges sur un prélèvement sanguin témoin avant leur utilisation pour la coloration des échantillons d'essai. Chaque anticorps marqué par un fluorochrome est titré séparément, puis les anticorps sont combinés en utilisant des dilutions appropriées pour former un mélange unique avec du tampon de lavage pour cytométrie en flux, contenant du PBS delcos additionné de 2 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur.Le cocktail d'anticorps est étiqueté avec un numéro de lot et une date d'expiration, puis expédié du laboratoire central d'analyse vers les laboratoires de traitement à l'aide d'un système d'emballage qui maintient une température de quatre degrés Celsius pendant le transport. Une fois reçu, le panel de marquage par anticorps peut être conservé à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière pendant jusqu'à huit semaines. La solution BD fax slicing est utilisée après le marquage pour lyser les globules rouges et fixer les colorations par anticorps tout en préservant les leucocytes.La solution est reçue du fabricant à une concentration 10 x et est diluée d'un facteur 10 par le laboratoire central d'analyse à l'aide d'eau déionisée. La solution diluée est ensuite étiquetée avec un numéro de lot et une date d'expiration, puis expédiée à température ambiante vers les laboratoires de traitement dès réception. La solution de marquage Fax est conservée à température ambiante, comprise entre 15 et 30 degrés Celsius, avant le prélèvement sanguin destiné à la coloration pour le comptage absolu.Le laboratoire de traitement doit s'assurer que tous les réactifs appropriés ont été obtenus auprès du laboratoire central d'analyse. Ceux-ci incluent les tubes BD TRU count, le panel d'anticorps combinés et une solution de licence x fax. Le HVTN utilise un système de gestion des données de laboratoire pour enregistrer toutes les informations pertinentes relatives à chaque échantillon.Un code d'identification unique est imprimé sur une étiquette placée sur le tube de comptage exact. Pour suivre l'échantillon tout au long du processus, étiquetez un tube cryogénique afin d'identifier l'échantillon à colorer. Cela inclura généralement un identifiant du patient ou du volontaire, un identifiant de visite et la date de prélèvement du sang. Répartissez la quantité requise de sang dans le tube cryogénique étiqueté en utilisant une technique aseptique.La quantité de sang utilisée pour la coloration dépend du panneau de coloration employé, mais est généralement de 50 ou 100 microlitres par panneau. Le tube cryogénique peut ensuite être mis de côté jusqu'à quatre heures à température ambiante avant la coloration. Une fois de plus, des procédures sensibles au temps sont effectuées sur le sang restant.Vérifiez qu'il y a un culot de billes intact au fond du tube et étiquetez le tube tru count. À l'aide des informations pertinentes concernant l'échantillon, enregistrez les numéros de lot et les dates de péremption de tous les réactifs. Les fiches de travail sont utiles pour suivre ces informations tout au long d'un essai clinique.Le nombre de billes et le numéro de lot du tube tru count sont indiqués sur la face avant du sachet contenant les tubes tru count. Lorsque vous êtes prêt à commencer le processus de marquage tru count, assurez-vous d'avoir tous les matériaux et réactifs prêts à l'emploi dans l'enceinte de sécurité biologique. Ceux-ci comprennent l'aliquot de sang étiqueté tube tru count, le tube du panel d'anticorps combinés pour le marquage, une solution de fixation x fax, des micropipettes de 200 microlitres et 1000 microlitres ainsi que des embouts de pipette, de l'eau de javel, du film d'étanchéité de laboratoire et un minuteur après le marquage.Vous aurez également besoin d'une boîte de spécimens colorés, mais celle-ci n'a pas besoin d'être placée dans la hotte. La quantité de sang et d'anticorps à utiliser varie selon les cellules distinguées par le panel et le nombre de cellules nécessaires pour une analyse correcte. Chaque panel est testé sur des échantillons témoins afin de déterminer la quantité optimale de sang pour la coloration, et la quantité d'anticorps utilisée est égale à la quantité de sang utilisée pour le panel montré dans cette vidéo.100 microlitres de sang et 100 microlitres d'anticorps seront utilisés avant la pipetage. Mélangez le sang en retournant doucement le tube plusieurs fois, puis pipetez doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Pour s'assurer davantage que le sang est bien mélangé.Ensuite, utilisez la pipetage inverse pour prélever avec précision le sang total de l'aliquote et le transférer dans le tube tru count, juste au-dessus du collier métallique. Évitez d'étaler le sang sur la paroi du tube. Remplacez la pointe de pipette entre chaque tube tru count.Il est maintenant temps de colorer le sang avec le panel d'anticorps avant la pipetage. Mélangez le panel de coloration en pipetant doucement plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Ajoutez 100 microlitres du mélange d'anticorps au sang dans le tube de comptage vrai.Ne pas effectuer de pipetage inverse lors de cette étape, car cela gaspillerait un réactif précieux. Boucher le tube et vortexer à faible vitesse pendant environ 15 secondes pour homogénéiser. S'assurer que le culot de billes est complètement dissous.Couvrez le tube avec du papier d'aluminium et réglez une minuterie pour colorer le sang pendant 15 minutes. La quantité de solution de fractionnement 1 x fax nécessaire est neuf fois supérieure à la quantité de sang utilisée dans le test ; ainsi, dans cet exemple, 900 microlitres de solution de fractionnement 1 x fax sont utilisés. Après l'incubation de 15 minutes, ajoutez 900 microlitres de la solution de fractionnement 1 x fax au sang coloré afin de fixer la coloration et lyser les globules rouges.La pipette inversée n'est pas nécessaire lors de cette étape. Boucher le tube et vortexer à faible vitesse pendant environ 15 secondes pour homogénéiser. Enfoncer fermement le bouchon en position de verrouillage et sceller. Avec du film de laboratoire. Conserver les tubes dans une boîte sombre ou entièrement enveloppés de papier d’aluminium à moins 65 à moins 95 degrés Celsius jusqu’à leur expédition vers le laboratoire d’analyse central. À ce jour, les tests ont montré que les échantillons sont stables jusqu’à quatre semaines à cette température. Les échantillons colorés doivent être expédiés en tant que substances biologiques de catégorie B, conformément à l’Association internationale du transport aérien ou IATA.Les échantillons du HVTN sont expédiés hebdomadairement depuis les laboratoires de traitement vers le laboratoire central d'analyse au moyen d'un système d'expédition isolé fourni par Safety Pack Ink, spécialement conçu pour répondre à ces exigences. Lors de l'utilisation de ce système, placez la boîte intérieure brune à l'intérieur du coffre en polystyrène, en la fixant dans l'encoche afin d'éviter tout déplacement. Remplissez complètement le coffre avec de la glace sèche et attendez cinq à dix minutes pour permettre à la boîte de refroidir.Pour préparer les échantillons à expédier, enveloppez complètement chaque tube et feuille de papier d'aluminium, puis placez-les dans la boîte contenant les échantillons colorés. Insérez un matériau absorbant dans un sac en plastique étanche avec la boîte d'échantillons colorés. Retirez l'air excédentaire du sac et scellez-le hermétiquement.Placer le sac en polyéthylène étanche à l'intérieur d'un sac en Tyvek. Là encore, retirer tout l'air du sac avant de le fermer. Placer le colis contenant l'échantillon à l'intérieur de la boîte brune intérieure et fixer solidement le couvercle sur le caisson en polystyrène.Sceller solidement la boîte d'expédition et l'acheminer comme substance biologique de catégorie B, avec les mentions appropriées pour la glace sèche. Suivre les instructions IATA PI 650 dans les essais cliniques multicentriques. Il est important de suivre les échantillons tout au long des étapes de stockage à court terme, d'expédition et de stockage à long terme.Le système de gestion des données utilisé par le HVTN permet la création d'un bordereau d'expédition qui peut être importé dans la base de données d'échantillons du laboratoire central d'analyse, où les échantillons seront stockés et analysés. Cela crée un enregistrement indiquant quand les échantillons ont été expédiés et reçus, où ils ont été stockés définitivement et quand ils ont été prélevés. Pour l'analyse, sortir l'échantillon coloré du congélateur et le laisser décongeler à température ambiante dans une boîte opaque.Pas plus d'une heure avant la collecte sur le cytomètre en flux. Si la collecte de données concerne plusieurs échantillons, décaler le dégel afin que les tubes ne restent pas à température ambiante plus d'une heure. Chaque échantillon doit être analysé à l'aide d'un cytomètre en flux à quatre lasers équipé de filtres appropriés, comme le BD LSR II. Utiliser les méthodes standard de calibration du cytomètre et de compensation de fluorescence pour la collecte des données, si requises par l'instrument. Pour définir un seuil, régler le seuil le plus bas possible sur le canal cyan, puis vortexer le tube d'échantillon pendant cinq secondes avant de le charger sur le cytomètre.Les billes tru count du cytomètre fluorescent fortement dans de nombreux canaux. Gater les billes pendant la collecte en identifiant la population double positive intense. Pour le PE SCI cinq et un PC, notez que les deux couleurs permettant le plus facilement de distinguer les billes des cellules peuvent varier selon l'instrumentation.Sélectionnez la porte des billes tru count comme porte d'arrêt et enregistrez les données jusqu'à ce qu'au moins 20 000 billes soient acquises. Analysez les données à l'aide d'un logiciel approprié, tel que FlowJo. Nous allons maintenant détailler le schéma de sélection utilisé pour l'analyse des principales populations de leucocytes, en utilisant les données d'un prélèvement sanguin contrôle représentatif.Des sous-ensembles cellulaires plus spécifiques peuvent également être distingués à l’aide du panel, comme les cellules NKT ou les neutrophiles, mais ceux-ci ne seront pas montrés dans cet exemple. Tout d’abord, une fenêtre d’inclusion et une fenêtre d’exclusion sont tracées autour des billes de comptage tru count et superposées l’une sur l’autre afin d’obtenir les billes utilisées pour le comptage, tout en les excluant de l’analyse cellulaire. Ensuite, les données cellulaires, après exclusion des billes, sont analysées par fenêtrage pour inclure uniquement les cellules uniques, en utilisant la hauteur de la diffusion avant par rapport à la surface de la diffusion avant.Cette fenêtre exclut également les petits débris. Les cellules positives pour le CD45 sont ensuite sélectionnées, séparant les granulocytes des lymphocytes et des monocytes à l’aide de la diffusion latérale. Les lymphocytes et les monocytes sont ensuite divisés en trois groupes distincts à l’aide du CD14 et de la diffusion latérale.Ces cellules comprennent les lymphocytes CD14 négatifs, toutes les cellules CD14 négatives et les cellules non lymphocytaires ; les cellules issues du porte CD14 négatif sont d'abord divisées en trois groupes : CD3 positif CD19 négatif, CD3 négatif CD19 positif et CD3 négatif CD19 négatif. Les lymphocytes T sont sélectionnés à partir du porte CD3 positif CD19 négatif. Après exclusion des cellules CD56 positives et CD16 positives, les lymphocytes T CD4 positifs et CD8 positifs peuvent être distingués. Les cellules B sont sélectionnées à partir du porte CD3 négatif CD19 positif, après exclusion des cellules CD56 positives et CD16 positives, et les cellules NK sont sélectionnées à partir du porte CD3 négatif CD19 négatif.Après élimination des monocytes éventuellement contaminants à l’aide de CD11c et de CD4, les cellules NK sont divisées en populations CD56 brite, CD56 dim et CD56 négative. Pour distinguer la population de cellules dendritiques, toutes les cellules CD14 négatives sont sélectionnées afin d'exclure les cellules positives pour CD3, CD19, CD56 et CD16. Ensuite, les cellules positives pour HLA-DR sont sélectionnées, et les cellules dendritiques myéloïdes ainsi que les cellules dendritiques plasmacytoïdes peuvent être distinguées selon leur expression de CD11c et de CD123.Enfin, à partir du compartiment non lymphocytaire, les sous-populations de monocytes sont sélectionnées après exclusion des cellules potentiellement contaminantes positives pour CD 56, positives pour CD trois et positives pour CD 19. Les monocytes non classiques, intermédiaires et classiques sont distingués en fonction de leur expression de CD 16 et de CD 14. Une fois les populations d'intérêt sélectionnées, leurs concentrations peuvent être calculées.La comparaison du nombre d'événements dans la fenêtre des billes au nombre total de billes initialement présentes dans le tube permet de déterminer le ratio d'échantillon récupéré, lequel peut ensuite être utilisé pour déterminer la concentration absolue. Nos cellules par microlitre pour chaque population. L'équation indiquée ici peut être utilisée à cette fin.Dans cette vidéo, nous avons démontré la procédure utilisée par les techniciens de laboratoire de traitement du sang pour effectuer la coloration de sang total frais et les étapes nécessaires à l'analyse de ces échantillons colorés dans un laboratoire d'essai central. Dans le cadre d'un essai clinique multicentrique, nous avons montré que l'essai est simple et de durée relativement courte, ce qui le rend réalisable pour les techniciens de laboratoire de traitement du sang, qui peuvent ainsi congeler et transférer les échantillons vers le laboratoire d'essai essentiel pour analyse. La clé pour obtenir des résultats précis et reproductibles consiste à standardiser rigoureusement les étapes critiques du protocole et à utiliser un système de documentation permettant de suivre toutes les étapes, de sorte que toute anomalie détectée puisse être retracée jusqu'à sa source.Les données générées à partir de ce panneau de coloration peuvent être utilisées pour suivre les variations des concentrations de leucocytes au fil du temps et pourraient facilement être approfondies afin d'évaluer les états d'activation de types cellulaires spécifiques d'intérêt.

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