Enregistrement simultané intracellulaire d'un motoneurone lombaire et la force produite par l'unité de moteur chez la souris adulte

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les propriétés électrophysiologiques et contractiles d'une unité motrice unique chez la souris en réalisant des enregistrements intracellulaires de motoneurones in vivo. Cela est accompli en exposant d'abord la moelle épinière et le muscle d'intérêt. Ensuite, un transducteur de force est fixé au tendon du muscle.

Le neurone moteur suivant est stimulé à l’aide d’une électrode intracellulaire, provoquant ainsi la contraction de l’unité motrice enregistrée. En fin de compte, les propriétés électrophysiologiques du neurone moteur peuvent être caractérisées en même temps que les propriétés contractiles de son unité motrice. La démonstration visuelle de cette technique est essentielle, car les étapes de microchirurgie sont très difficiles à apprendre en raison de la petite taille de l’animal.

Pour commencer la procédure, anesthésiez une souris en injectant du pentobarbital sodique ou un mélange de kétamine et de xylazine par voie intrapéritonéale. Vérifiez que la souris n'a pas de réflexe de retrait plantaire. Ensuite, effectuez une incision au-dessus de la trachée à l'aide d'une paire de ciseaux contondants et écartez la peau des deux côtés.

Ensuite, déchirez la glande salivaire à l'aide d'une paire de pinces contondantes. Pour exposer les deux muscles fins recouvrant la trachée, séparez ces deux muscles afin de révéler la trachée. À l'aide d'une paire de pinces Dumont n°7.

Faites glisser deux brins de suture en soie aut de quatre sous la trachée. Ensuite, effectuez une incision transversale dans la trachée entre deux anneaux cartilagineux. Mais attention à ne pas sectionner complètement la trachée.

Insérez maintenant le tube trachéal dans la trachée. Fixez les deux côtés de l'ouverture d'insertion en nouant les fils de suture par-dessus. Ensuite, reliez le tube trachéal à un ventilateur pour souris et à un capnographe.

Ensuite, connectez le ventilateur à l'oxygène pur à l'aide d'un ballon de compliance. Ajustez les paramètres du ventilateur de manière à ce que la souris ne lutte pas contre la ventilation artificielle et que la pression partielle de dioxyde de carbone en fin d'expiration reste stable entre 4 et 5 %. À cette étape, exposez la veine jugulaire d'un côté du cou en utilisant des techniques de dissection émoussée.

La veine jugulaire se divise en deux troncs principaux, les veines faciales antérieure et postérieure. Séparez soigneusement la veine de son tissu conjonctif environnant. Ensuite, glissez deux fils de suture en soie aut n°6 sous la veine, en les espaçant au maximum le long de la veine.

Ensuite, placez une pince hémostatique sur la partie proximale de la veine et ligaturez la partie distale de la veine. À l’aide de ciseaux à iris très fins, pratiquez une petite incision transversale dans la veine. Veillez à ne pas sectionner complètement la veine.

Ensuite, insérez un cathéter prérempli de calibre français dans l'ouverture jusqu'au clip vasculaire maintenant la veine et le cathéter ensemble. Retirez soigneusement le clip vasculaire. Puis poussez le cathéter de quelques millimètres supplémentaires dans la veine. Fixez le cathéter en le ligaturant avec des fils de suture des deux côtés de l'insertion.

Ensuite, reliez l'un des cathéters à une seringue ou à une pompe à seringue pour injecter des doses supplémentaires d'anesthésiques tels que le pentobarbital, le sodium ou la xylazine-kétamine. Répétez la procédure pour une autre veine et reliez l'autre cathéter à une pompe à seringue pour une perfusion intraveineuse lente d'une solution de glucose à 4 % contenant du bicarbonate de sodium à 1 % et du plasmon à 14 %. À la fin, fermez la peau du cou avec une aiguille et du fil de suture.

Ensuite, remettez la souris en position prone. Effectuez maintenant une incision depuis le haut de la cuisse jusqu'au tendon d'Achille. Séparez la peau des muscles sous-jacents et veillez à ne pas endommager les vaisseaux sanguins.

Ensuite, identifiez le bord antérieur du biceps fémoral, qui apparaît comme une ligne blanche descendant le long de la cuisse. Puis, ouvrez soigneusement le long de cette ligne depuis le genou jusqu'à l'os de la hanche. Séparez les muscles afin d'exposer le nerf sciatique situé sous le biceps fémoral.

Dissez soigneusement le biceps fémoral et retirez-le. Pour exposer le nerf sciatique et les muscles tricipitaux surépiers, identifiez le nerf tibial situé entre les nerfs fibulaire commun et sural. Parmi les différentes branches du nerf tibial, distinguez les branches innervant le triceps sural de celles qui pénètrent plus en profondeur.

À l'aide de huit fils de soie OTT, attachez ensemble toutes les branches du nerf tibial tout en préservant intactes les branches innervant le triceps sural. Sectionnez le nerf tibial aussi loin que possible du nœud. Identifiez les vertèbres T13 et L1, T13 étant la dernière vertèbre à laquelle sont attachées des côtes.

Ensuite, immobilisez la colonne vertébrale à l’aide des pinces vertébrales Cunningham placées de chaque côté de T13 et L1. Veillez à ne pas comprimer la moelle épinière, mais appliquez une légère tension sur l’axe longitudinal. Assurez-vous que la colonne vertébrale est bien fixée en l’appuyant doucement vers le bas à l’aide de la pince à forceps.

À l'aide des pinces fines, retirez les apophyses épineuses, puis la lame au-dessus de T13 et L1 pour exposer la moelle épinière. Ensuite, placez un bain en plastique sur mesure autour de la moelle épinière. Après cela, fixez le bain en place à l'aide d'un fil de soie de calibre 4.

Enfin, assurez-vous que le bain est étanche en le scellant avec un mastic à prise rapide. Une fois que le mastic est sec, retirez le coton qui recouvre la moelle épinière et remplissez le bain d’huile minérale. Utilisez un autre clamp vertébral pour fixer un processus épineux de la région sacrée.

Afin de soutenir la région dorsale de l'animal, utilisez un troisième clamp pour immobiliser la patte postérieure droite et la cheville fléchie à un angle de 90 degrés au niveau du genou, la patte étant pliée à 90 degrés au niveau du genou et de la cheville. Retirez le pansement en gaze recouvrant la zone de la patte postérieure. Disséquez le tendon d'Achille du tissu environnant.

Prélevez le triceps aussi complètement que possible en le séparant des tissus environnants à l’aide d’une aiguille enfilée. Passez un fil de soie de calibre 6 à travers le tendon d’Achille et faites un nœud triple autour du tendon. Placez ensuite le transducteur de force près du nœud.

Ensuite, fixez le tendon au transducteur de force à l'aide du fil de soie et coupez la partie distale du tendon. Puis, insérez deux fils en acier inoxydable sous la fascia des muscles triceps suraux. Ces fils sont reliés à un amplificateur extracellulaire à courant alternatif.

Pour l'enregistrement EMG, placez le nerf sural du triceps sur la cathode d'une électrode en crochet, l'anode étant en contact avec un muscle voisin. Ensuite, stimulez le nerf sural du triceps à l'aide d'une impulsion carrée de 50 microsecondes d'intensité croissante et à faible fréquence, jusqu'à l'observation de l'amplitude maximale du tétanos. Puis, stimulez à nouveau le nerf sural du triceps à l'aide d'une impulsion carrée de 50 microsecondes d'intensité croissante et à faible fréquence, jusqu'à ce que l'amplitude maximale du tétanos soit observée.

Ces figures montrent comment identifier un motoneurone du groupe sural tricipital. Après pénétration à faible intensité de stimulation, seul un EPSP monosynaptique peut être observé à une intensité plus élevée. L'EPSP peut être suffisamment important pour déclencher un potentiel d'action orthodromique à une intensité de stimulation encore plus élevée, de manière tout-ou-rien.

L'onde de choc antidromique apparaît avec une latence plus courte que le PEPS monosynaptique. Si un courant suffisant est injecté via l'électrode microscopique pour déclencher un potentiel d'action, une activité EMG peut être enregistrée sur le muscle après un court délai, suivi d'un tressaillement musculaire.

Après l'identification du motoneurone, ses propriétés électrophysiologiques peuvent être caractérisées. Par exemple, cette figure illustre comment la résistance d'entrée peut être mesurée à l'aide d'impulsions de courant hyperpolarisantes et dépolarisantes, en traçant les variations du potentiel membranaire en fonction de la quantité de courant injecté. Les propriétés contractiles de l'unité motrice peuvent également être étudiées à l'aide de divers protocoles de stimulation.

Par exemple, la relation entre la force et la fréquence peut être obtenue en injectant de brèves impulsions de courant à différentes fréquences dans le motoneurone. La force en régime permanent peut ensuite être tracée en fonction de la fréquence des impulsions de courant afin de révéler une courbe sigmoïde de la relation force-fréquence. Une fois la chirurgie maîtrisée, une partie de cette technique peut être réalisée en trois heures, si elle est effectuée correctement.