Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l'activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

L’objectif général de cette procédure est de mesurer la concentration de sommeil et de lactate définie par l’EEG pendant la stimulation optogénétique à des coordonnées stéréotaxiques précises. Implantez chirurgicalement les sondes électroencéphalographiques et les canules nécessaires pour un capteur de lactate et un câble à fibre optique. Insérez ensuite le câble à fibre optique et le capteur de lactate pré-calibré dans leurs canules de guidage dans le crâne de l’animal.

Ensuite, ajustez l’intensité du stimulus de lumière bleue pour obtenir la réponse électrophysiologique souhaitée. Ensuite, procédez à la collecte des données électroencéphalographiques, électromyographiques et de concentration de lactate pendant que l’animal est autorisé à se comporter spontanément et/ou à dormir. Par rapport à d’autres méthodes comme les études pharmacologiques de l’EEG, cette approche expérimentale a l’avantage de surveiller la biochimie et l’électrophysiologie du cerveau pendant que l’activité des neurones est manipulée en temps réel sur une échelle de temps inférieure à la seconde.

Le potentiel de production de nouvelles connaissances pour le domaine de la recherche sur le sommeil est donc élevé. Par exemple, on peut identifier les concomitants métaboliques et électrophysiologiques du sommeil à ondes lentes. Ce type d’expérience peut également être appliqué dans d’autres domaines des neurosciences, tels que l’apprentissage et la mémoire, la plasticité synaptique ou les troubles convulsifs.

La technique chirurgicale est techniquement difficile. Cela demande une bonne dose de dextérité, mais cela peut être réalisé par la pratique. Dans cette démonstration visuelle, je vais réitérer les étapes critiques de certaines procédures chirurgicales compliquées qui compléteront la description écrite.

Une fois qu’un animal s’est remis de l’opération, le défi consiste à insérer correctement le capteur de lactate et le câble à fibre optique. Jonathan et moi montrerons comment utiliser une main ferme pour retenir l’animal afin d’insérer ces deux pièces d’équipement délicates. Enfin, nous montrerons comment optimiser la réponse EEG en ajustant l’intensité du stimulus en temps réel.

Pour cette expérience, utilisez des souris transgéniques qui expriment le canal cationique sensible à la lumière bleue. Le canal adopte en deux dans les neurones corticaux cérébraux. Anesthésie d’abord la souris à l’aide de 5 % de fluor et 95 % d’oxygène pour l’induction tout en maintenant l’anesthésie avec 3 % de fluor et 97 % d’oxygène.

Faites une incision médiale sur le dessus du crâne entre les yeux et l’arrière du crâne. Nettoyez le crâne avec du peroxyde d’hydrogène et une solution saline stérile. Localisez et marquez B et Lambda pour déterminer les coordonnées stéréotaxiques des configurations de stimulus optogénétiques des électrodes, amorcez les trous de vis avec une perceuse dentaire à grande vitesse avec une fraise à bille de 0,5 millimètre suivie d’une mèche à bille de 0,7 millimètre.

Insérez les vis de l’électrode kelo gram dans les trous à l’aide d’un tournevis à main plat. Enfoncez-les en quatre à cinq tours environ pour obtenir la profondeur souhaitée. Maintenez les canules guides en place à l’aide d’une canule stéréotaxique, puis fixez-les au crâne et ancrez-les avec du ciment acrylique. Pour maintenir la perméabilité, chaque canule guide doit contenir une canule ou un stylet factice entre le moment de la chirurgie et le moment de l’expérimentation.

Une fois que les EEG et les canules de guidage sont positionnés dans le crâne, collez-les ensemble avec une fine couche de ciment acrylique dentaire. Une fois que le ciment a pris, positionnez le connecteur en plastique au-dessus du monticule de ciment séché vendu aux extrémités des fils émanant de l’EEG et aux contacts du connecteur en plastique au cas où le fil passe dans du ciment. Ensuite, tirez les fils de l’électromyogramme à travers les muscles du nucule en les glissant dans le corps d’une aiguille de calibre 21.

Perpercé à travers le muscle, attachez un double nœud de chirurgien, une suture en nylon à cinq zéros autour de ces fils, juste distales à l’endroit où ils sortent de la suture musculaire, la peau qui a été rétractée pour accéder au tissu musculaire avec des nœuds de chirurgien interrompus à l’aide d’une coupe inversée, d’une aiguille P à trois aiguilles et d’une suture en nylon à cinq zéro. Une fois que l’unité de stimulus mc est programmée, exécutez-la comme un générateur de signaux autonome en tant que signal binaire on-off de cinq volts. Connectez l’unité de stimulus mc à l’unité d’alimentation compatible TTL du laser avec des connecteurs BNC.

Connectez l’unité d’alimentation laser au laser à l’aide d’un câble plat. Connectez également le laser au connecteur FC mâle du câble de raccordement à fibre optique d’origine. Connectez le câble à fibre optique d’origine au joint tournant.

Collecteur Le joint rotatif à fibre optique sert de collecteur. Lorsque l’animal se déplace dans sa cage, le joint rotatif tourne pour éviter la rupture des câbles à fibres optiques due au couple de rotation. À l’aide d’attaches de câble en plastique, fixez le collecteur à un support métallique placé au-dessus de la cage cylindrique dans laquelle l’animal est logé.

Retenez la souris en utilisant une main pour coincer la souris sous une paume en coupe. Orientez la tête entre le majeur et l’index de l’expérimentateur. Dégagez maintenant la canule de guidage des débris, des débris à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 25.

Insérez ensuite le câble à fibre optique à la main et fixez-le à la canule de guidage à fibre optique à l’aide d’un capuchon à vis fileté. Contrôlez la profondeur d’insertion du câble à fibre optique dans le cerveau par un nœud de suture attaché sur le câble à fibre optique à une distance fixe de l’extrémité plate clivée. Le capteur est assimilé à une solution saline tamponnée au phosphate et exposé à trois concentrations de L lactate par étapes.

Conformément aux protocoles du fabricant, insérez le capteur pré-calibré dans la canule de guidage de lactate montée sur le crâne d’une manière identique à la procédure d’insertion du câble à fibre optique. Connectez le capteur de lactate au préamplificateur du biocapteur pinnacle 8, 400 avec connecteurs bipolaires. Fixez ensuite ce préamplificateur au connecteur à huit broches du support de tête implanté chirurgicalement.

Avant de collecter des données, utilisez le bouton de contrôle de l’intensité du laser pour régler l’intensité du stimulus optogénétique. L’amplitude de la réponse EEG variera d’un animal à l’autre en raison de facteurs qui n’ont pas été étudiés systématiquement. Il est donc nécessaire d’ajuster l’intensité du stimulus optogénétique et de vérifier que la réponse EEG est adéquate lorsque la réponse souhaitée est atteinte.

Collectez des données à l’aide du système Pinnacle 8, 400 avec le neuro score. Une interface SEIA permet de classer les états de sommeil par une inspection visuelle du processus de données EEG et EMG. Les données en périodes de dix secondes sont le réveil : mouvements oculaires non rapides, sommeil ou sommeil à mouvements oculaires rapides basés sur l’EEG et l’EMG.

Cette configuration de stimulus optogénétique de biocapteur montre les électrodes EEG implantées chirurgicalement, le capteur de lactate et la canule pour la stimulation optogénétique. En l’absence de stimulation optogénétique, cette souris a subi un sommeil spontané. Les transitions d’état d’éveil pendant que E-E-G-E-M-G et la concentration de lactate cérébral ont été surveillés en permanence : le réveil et les deux sous-types de sommeil.

Les mouvements oculaires rapides et les mouvements oculaires non rapides sont définis sur la base de l’EEG et de l’EMG. Il est intéressant de noter que le courant du biocapteur de lactate augmente en fonction de l’EEG de faible amplitude et diminue en fonction de l’EEG de haute amplitude. Les deux canaux de l’EEG répondent aux stimuli optogénétiques délivrés dans le cortex frontal.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’implanter chirurgicalement une souris pour la manipulation optogénétique simultanée et la mesure de l’électroencéphalogramme, de l’électromyogramme et de la concentration de lactate dans le cerveau. Une fois maîtrisée, cette technique chirurgicale peut être correctement réalisée en 90 à 120 minutes. N’oubliez pas de surveiller constamment la respiration de l’animal comme mesure de la profondeur de l’anesthésie.

Si l’animal respire moins d’une fois toutes les quatre à cinq secondes, l’anesthésie peut être trop profonde. Si l’animal respire plus d’une fois toutes les deux secondes, l’anesthésie peut être trop légère. N’oubliez pas de prendre les précautions de sécurité appropriées lors de l’utilisation de l’agent anesthésique gazeux de fluor.

Assurez-vous d’une ventilation adéquate dans le bloc opératoire pour protéger votre rétine du laser utilisé pour la stimulation optogénétique. Portez des lunettes de protection ou enfermez l’animal dans une armoire étanche à la lumière. Vous voudrez vous entraîner à implanter le biocapteur de lactate et le câble à fibre optique dans une souris complètement éveillée.

Les souris ne respectent pas ces procédures et doivent être immobilisées. Cependant, la contention ne peut pas être assez forte pour blesser l’animal ou empêcher la respiration.