Génération rapide et efficace des neurones à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans un format plaque Multititre

L’objectif général de l’expérience suivante est de différencier les cellules souches pluripotentes humaines ou CSP H en neurones à l’aide d’un format de plaque à titres multiples. Ceci est réalisé en récoltant et en plaquant une suspension unicellulaire de CSP H dans le fond en V 96. Plaques de puits pour former des corps embryonnaires ou EBS pendant la nuit.

Ensuite, les EBS sont transférés dans des plaques d’attache ultra-basses en forme de U contenant un milieu de différenciation pour induire la formation de neuroectodermes. Par la suite, les EBS sont plaqués sur des boîtes enrobées de matrigel pour favoriser la croissance des neurones. On peut obtenir des résultats qui montrent la présence de marqueurs neuronaux typiques vers le huitième jour par immunofluorescence.

Les protocoles de différenciation des cellules souches humaines prépuissantes en neurones sont souvent compliqués et fastidieux. Un peu accidentellement. Nous avons découvert une procédure très simple pour fabriquer des neurones à partir de cellules souches humaines prépuissantes.

D’un point de vue technique, le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu’elle est facile à réaliser, rapide et rentable. Dans le même temps, la présentation de la procédure sera assurée par le Dr MI Z du laboratoire. Préparez le milieu de formation de l’EB et le milieu de différenciation comme indiqué dans le protocole écrit.

Cultivez des CSP dans des conditions exemptes de nourricier, comme un milieu conditionné à la méthamphétamine sur des plaques recouvertes de matrigel, ou en utilisant des systèmes de culture chimiquement définis dans des conditions de croissance active sous-confluentes. À l’aide d’un stéréomicroscope avec une pointe de pipette en plastique stérile, on élimine mécaniquement les colonies spontanément différenciées. Laver les colonies indifférenciées restantes avec du PBS et utiliser Accutane contenant un inhibiteur de roche x pour digérer en cellules uniques.

Granulez les cellules individuelles par centrifugation à 200 G pendant deux minutes et suspendez Resus dans un petit volume de milieu de formation EB. Utilisez un hémocytomètre pour déterminer le titre cellulaire. Ajoutez des cellules supplémentaires au milieu de formation d’EB restant pour arriver à un titre compris entre 40 000 et 80 000 cellules par millilitre.

À l’aide d’une pipette multicanaux, transférez 100 microlitres par puits sur une plaque inférieure de 96 V, ce qui donne 4 000 à 8 000 cellules par puits. Puits. Faites tourner la plaque dans une centrifugeuse à plaques pivotantes à 400 G pendant une minute pour recueillir toutes les cellules au fond des puits. Transférez les cellules dans un incubateur et laissez EBS se former pendant la nuit du lendemain sous le stéréomicroscope.

Recueillir l’EBS et le transférer dans un petit volume dans une boîte bactérienne de 3,5 centimètres contenant deux millilitres de différenciation. Douleur moyenne. Lavez les cellules en tournant doucement le plat. Ajoutez 100 microlitres de milieu de différenciation à chaque puits d’une fixation ultra basse vous.

Plaque inférieure à 96 puits sous un microscope stéréoscopique. Transférez EBS en petits volumes de la vaisselle dans les puits 96 U. Incuber l’EBS pendant quatre jours pour permettre la formation de neuroectoderme le quatrième jour.

Lavez les cellules dans un milieu de différenciation et ensemencez-les une par une dans les puits d’une plaque multi-titres recouverte de matrigel, telle qu’une plaque à 12 puits. Les cellules doivent être réparties uniformément dans les puits pour permettre une croissance non perturbée des neurones. Laissez l’EBS se fixer sans serrer au matrigel pendant environ 10 minutes à température ambiante.

Transférez ensuite délicatement la plaque dans l’incubateur. Les neurones se développeront à partir de l’EBS plaqué de manière radiale dans les quatre prochains jours. Précédemment, nous avons montré que, comme beaucoup d’autres, l’EBS des PSC H pouvait être généré simplement par replacage, agrégats lors de la division régulière des HPC H en paraboles à faible attache.

Cela se traduit généralement par une large distribution de la taille des cellules. Un autre problème est que les EBS maintenus en suspension ont tendance à s’agréger les uns aux autres, ce qui conduit à une hétérogénéité de taille encore plus grande pour contourner ce seul H Les PSC ont été plaidées dans des puits à faible attache, ce qui a entraîné l’absence de formation d’EB et la mort cellulaire. Cependant, la combinaison de la molécule de survie cellulaire, Y 2 7 6 3 2 avec de l’alcool polyvinylique, dont il a été démontré qu’elle améliore la formation d’EB à partir de HSC, a permis à EBS de se former à partir de suspensions HESC unicellulaires pendant la nuit.

De manière pratique, les tailles EB dans ce format de plaque à titres multiples pourraient être étroitement contrôlées en plaçant différents nombres de cellules par puits. Contrairement à l’utilisation de techniques conventionnelles, après transfert de l’EBS sur des plaques 96 U à très faible attachement, la formation de neuroectodermes a été induite à l’aide d’un cocktail de petites molécules composé d’inhibiteurs de F-G-F-E-R-K-T-G, TGF bêta SMA deux et BP SMA un, ce qui a ensuite permis aux cellules d’être plaquées sur du matrigel pour donner naissance aux neurones. L’initiation de la formation d’EB à partir d’environ 8 000 cellules a donné la meilleure capacité de différenciation neuronale, qui se caractérise par des excroissances neuronales prononcées à partir des ebs plaqués.

Réduction des centres EB nécrotiques après le placage et expression élevée des marqueurs sensoriels et neuronaux pannaux tels que B rrn trois A et bêta trois tubuline. L’efficacité globale de la différenciation neuronale semble être comparable à celle de la procédure originale, qui s’applique à la fois aux CSH et aux CSP HI jusqu’à présent. Trois lignées HPSC indépendantes, les cellules HES et HIPS, ont été testées avec succès dans la procédure multi-puits, tandis que la variabilité dépendante des lignées cellulaires et l’efficacité de la différenciation ne peuvent généralement pas être exclues.

Cette figure montre quatre cellules neuroectodermiques dissociées en une seule journée qui ont été présentées comme des cellules uniques et différenciées avec succès à environ 60 % d’efficacité La manipulation de l’EBS dans la plate-forme à titres multiples nécessite un peu d’entraînement au début, mais après un certain temps, vous verrez que c’est assez facile.