Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

L’objectif global de cette procédure est d’étudier les fonctions tissulaires spécifiques des voies de signalisation qui sont essentielles à la formation des follicules pileux. Ceci est accompli en isolant d’abord les cellules primaires dermiques et épidermiques de souris nouveau-nées. Ensuite, l’expression des gènes est modifiée en infectant les cellules primaires avec le lentivirus.

La troisième étape consiste à combiner les populations de cellules épidermiques et dermiques dans des chambres fixées à un lit de plaie sur une souris nue. La croissance des cheveux est ensuite surveillée dans le greffon. En fin de compte, l’effet de la manipulation génétique sur la formation du follicule pileux peut être évalué visuellement et par coloration histologique du site de greffe.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme un modèle de souris nacal, est que la greffe peut être réalisée en trois semaines. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que l’impact des facteurs dans un tissu sur la signalisation et le fonctionnement d’un autre. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons voulu disséquer les fonctions tissulaires spécifiques des molécules du plafond dans la formation du follicule pileux après avoir lavé une souris qui avait été euthanasiée par asphyxie.

Coupez chaque membre et chaque queue à la base du torse avec des ciseaux stériles. Ensuite, saisissez fermement le corps à l’aide d’une paire de pinces incurvées et faites une incision le long de la peau dorsale de la tête à la queue à l’aide d’un scalpel. Ne pénétrez pas le fascia sous-jacent.

Maintenant, retirez soigneusement la peau de la ligne médiane de la souris. Saisissez fermement la souris exposée avec le côté long de la pince incurvée et insérez une autre paire de pinces incurvées sous la peau à l’extrémité postérieure de la souris. Maintenant, décollez soigneusement la peau de la souris d’un seul mouvement fluide et jetez la carcasse.

Placez la peau dans le premier plat de solution de lavage avec le derme vers le bas. Étalez la peau dans la solution et agitez-la avec la pince. Laissez ensuite la peau dans la solution de lavage tout en disséquant la peau suivante.

Après avoir placé la peau disséquée suivante dans la première solution de lavage à vaisselle, transférez la peau précédente dans la deuxième solution à vaisselle de lavage. Conservez les peaux dans la deuxième solution de lavage jusqu’à ce que toutes les peaux soient recueillies. Après le lavage final, transférez jusqu’à cinq peaux dans un plat contenant une solution de déchargement froid.

Aplatissez les peaux, côté dermo vers le bas, et laissez-les flotter pendant huit à 16 heures à quatre degrés Celsius. Transférez une peau de dis bays froids dans un nouveau plat. Aplatissez-le, derme vers le bas.

Saisissez l’épiderme à l’aide d’une pince et retirez-le lentement du derme. L’épiderme doit se décoller en un seul morceau, il sera blanc et fin, et le derme doit être brunâtre, plus épais et gélatineux. Triez les deux tissus dans des boîtes de culture distinctes pour commencer l’isolement cellulaire.

Pour isoler les cellules dermiques, coupez le derme en très petits morceaux. Avec deux scalpels. Incuber le tissu dermique haché avec une solution de collagénase fraîchement préparée À 37 degrés Celsius pendant une heure toutes les 10 minutes, agitez doucement le mélange cellulaire lorsque la digestion est terminée.

La suspension doit être principalement composée de cellules uniques, et la solution doit être passée de claire à trouble. Maintenant, ajoutez un volume de 10 % de FBS à la suspension cellulaire. Passez-les dans une cellule de 70 microns, passoires dans des tubes de 50 millilitres.

Recueillir jusqu’à 30 millilitres de débit par tube. Poursuivre l’isolement des cellules cutanées conformément au protocole écrit. Pour isoler les kératinocytes, coupez chaque épiderme en six à huit petits morceaux.

Incuber le tissu tranché avec 0,05 % de doses fraîchement décongelées dans de l’EDTA à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Poursuivez l’isolement des kératinocytes conformément au protocole écrit, anesthésiez une souris nue femelle âgée de sept à 12 semaines à l’aide de kétamine et de xylazine ou d’une méthode préférée. Assurez-vous d’appliquer un lubrifiant pour les yeux et de placer la souris sur un coussin chauffant.

Désinfectez maintenant la peau du dos avec de l’iode, suivi de tampons imbibés d’alcool. À l’aide d’une pince, pincez la peau à la base du cou et percez un trou d’un centimètre de diamètre dans la peau pincée. Placez la chambre sur le lit de la plaie et couvrez les bords de la chambre avec la peau environnante.

Fixez la chambre avec environ six sutures Le long de ses bords, ne fixez qu’une seule chambre par souris. Une fois la chambre sécurisée, vérifiez la suspension cellulaire. S’il est condensé au fond, remettez-le doucement en suspension à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre.

Maintenant, faites tourner doucement la boue cellulaire et aspirez-la dans une aiguille de calibre 23 attachée à une seringue d’un millilitre. Perforez chaque chambre avec l’aiguille et versez lentement les cellules en suspension PBS sur la plaie. Lorsque les souris se remettent de l’anesthésie, placez-les dans des cages d’autoclave propres avec deux souris par cage.

Assurez-vous d’administrer des antibiotiques et du Tylenol par l’eau potable. Après sept à neuf jours, anesthésez la souris nue traitée comme fait précédemment. Désinfectez la peau autour de la chambre avec de l’iode et nettoyez-la avec des tampons imbibés d’alcool.

Coupez soigneusement les points de suture et retirez-les de la chambre. Retirez délicatement la chambre si la nouvelle peau y adhère. Séparez doucement le greffon de la chambre.

À l’aide d’une pince, maintenez le greffon vers le bas. Lors du retrait de la chambre, le greffon doit avoir l’air terne et opaque. Appliquez un tampon non adhérent avec une fine pellicule d’antibiotiques sur la plaie ouverte et suturez-le en place à l’aide de deux points de suture.

Enroulez un bandage autour de la souris pour fixer le coussinet et protéger la plaie. Suturez le bandage en place Après trois jours, retirez les bandages et le tampon. La souris n’a pas besoin d’être anesthésiée pendant cette étape.

Le greffon doit être sec et opaque à brun. Vérifiez périodiquement la croissance des cheveux du greffon, qui devrait commencer à apparaître 16 jours après la greffe. Une inhibition spécifique du gène lissé, qui est un composant essentiel de la signalisation du hérisson sonique, a été réalisée dans des cellules dermiques isolées.

Ces cellules ont été appliquées à des greffes de reconstitution capillaire en utilisant le protocole décrit. Après trois semaines de croissance, les greffons de contrôle positif avec le vecteur lentiviral seul ont montré une croissance robuste des cheveux. Cependant, l’inactivation génique lissée a entraîné une réduction sévère de la croissance des cheveux.

Les greffons de contrôle négatif, en omettant soit les cellules dermiques primaires, soit les kératinocytes, ont permis de récupérer le site de la plaie sans aucun cheveu. De même, la mort cellulaire ou la perte de cellules par l’un des types de cellules du greffon n’a pas non plus entraîné de croissance des cheveux. Il a été déterminé que le vecteur lentiviral avait une bonne efficacité d’infection avant l’expérience de greffe, et il a également été conçu pour produire de la GFP avec ce S-H-R-N-A lissé.

Ainsi, l’observation de la papille dermique des follicules pileux sous optique fluorescente a permis de contrôler utilement la durée de l’expression lentivirale Après trois semaines, la coloration H et D est utilisée pour décrire le stade de croissance des follicules pileux dans le greffon de contrôle et leur stade de développement retardé lorsque l’expression lissée a été renversée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 14 heures sur une période de trois jours si elle est exécutée correctement. Cette technique peut être étendue pour explorer la relation entre la tumeur et le stroma au cours de la progression du cancer dans le domaine de la biologie du cancer.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier la fonction des gènes dans la formation des follicules pileux. Utilisez notre test de reconstitution rapide des cheveux comme une alternative aux knock-outs génétiques traditionnels.