Name: Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Découvrez une technique de greffe rapide pour étudier les voies de signalisation épithélio-mésenchymateuse dans la formation des follicules pileux chez la souris. Cette méthode permet d'évaluer l'effet de la manipulation génique sur la croissance capillaire en trois semaines.

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Ce travail a été soutenu par le NIH NRSA 1F32CA14208701 (SXA) et des subventions du NIH AR052785 AR046786 et (AEO et W. MW).

1. Préparer 0 à 2 jours Vieux souriceaux nouveau-nés pour la peau Dissection <ol><li> Euthanasier les chiots de souris en utilisant une chambre de CO 2 pendant au moins 20 min. Laisser petits sur la glace jusqu&#39;à une heure jusqu&#39;à ce que la dissection. P0-P2 souris est fortement recommandé que les cellules préparées à partir de souris plus âgées ont réduit la capacité de progéniteurs qui se traduit par une baisse des rendements greffés. Préparer un plat d&#39;éthanol à 70% (pour l&#39;étape 1.3) et trois plats de solution de lavage (pour l&#39;étape 3) lorsque vous êtes prêt à effectuer la dissection peau. Décongeler Solution Dispase et le laisser à 4 ° C. Col de l&#39;utérus disloquer petits après une surexposition CO 2 afin d&#39;assurer l&#39;euthanasie. </li><li> Placez chiots euthanasiés dans une boîte de culture sur la glace et le transfert à une hotte à flux stérile. </li><li> Laver les chiots par une brève immersion dans l&#39;éthanol à 70% et le placer sur boîte de Pétri stérile. </li></ol> 2. Disséquer la peau de souris <ol><li> Couper chaque branche et de la queue à la base du tronc avec des ciseaux stériles. </li><li> Saisir fermement le corps entre une paire de Cupince rved et faire une incision le long de la peau du dos, de la tête à la queue à l&#39;aide d&#39;un scalpel, sans pénétrer le fascia sous-jacent. </li><li> Retirer délicatement la peau loin de la ligne médiane de la souris. </li><li> Saisissez la souris exposée fermement avec le côté long de la pince courbes et insérez une autre paire de pinces courbées sous la peau à l&#39;extrémité postérieure de la souris et tirez doucement la peau sur les hanches vers la moitié ventrale de la souris. </li><li> Retirer délicatement la peau complètement à côté de la souris dans un mouvement fluide et jeter la carcasse. </li></ol> 3. Laver la peau et incuber avec la solution de dispase <ol><li> Placer la peau dans le premier plat de la solution de lavage avec le derme vers le bas. Étaler la peau sur et agiter avec une pince. Laisser la peau dans le premier plat de la solution de lavage tout en disséquant la peau prochaine. </li><li> Après avoir placé la peau à côté découpé dans le premier plat de la solution de lavage, transférer la peau avant le deuxième plat de solution de lavage. Gardez peaux èmesolution e second lavage jusqu&#39;à ce que toutes les peaux sont collectées. Transfert de toutes les peaux pour le lavage final, agiter brièvement. </li><li> Ajouter 10 ml Dispase glacée à une boîte de culture stérile de 10 cm. Transfert peau pour la solution de dispase et aplatir la peau derme vers le bas. </li><li> Float peau pour 8-16 heures à 4 ° C (option alternative: 1 heure à 37 ° C). </li></ol> 4. Derme et de l&#39;épiderme séparé <ol><li> Transfert à la peau une boîte de culture stérile nouveau et aplatir la peau derme vers le bas. Soigneusement maintenez le derme d&#39;un coin avec un scalpel. </li><li> Saisissez l&#39;épiderme avec une pince et lentement se détacher de la derme. Épiderme devrait décoller en une seule pièce. L&#39;épiderme est blanc et fin et le derme doit être brunâtre, épais et gélatineux. </li><li> Séparez les deux tissus distincts dans des boîtes de culture stériles. <ol class="lalpha"><li> Pour effectuer un gène spécifique cutanée knockdown / surexpression du greffon, prenez le derme et l&#39;émincer en très petits morceaux avec tscalpels wo. Jeter épiderme. Le jour de l&#39;infection (étape 7), disséquer une autre série de peaux de souris pour préparer frais, non traités cellules épidermiques à combiner avec lentiviral cellules infectées par voie cutanée. </li><li> Pour faire un épiderme gène spécifique knockdown / surexpression du greffon, couper chaque épiderme dans 6 à 8 petits morceaux. Jeter derme. Le jour de l&#39;infection (étape 7), disséquer une autre série de peaux de souris pour préparer frais, non traités cellules dermiques à combiner avec lentiviral infectées par les cellules épidermiques. </li></ol></li></ol> 5. Dissocier les cellules de souris primaire de la peau (MDC) à partir de tissus hachée <ol><li> Dissocier mDC par incubation de pièces dermiques avec la solution de collagénase fraîchement préparé à 37 ° C pendant 1 heure. Utilisez 10 ml de solution de collagénase par souris nouveau-nés. </li><li> Mélanger doucement le derme solution contenant toutes les 10 min. Vérifiez la mesure de la dissociation sous un microscope; la suspension cellulaire doit être digéré cellules plupart des célibataires. La solution doit passer de clair à nuageux,les cellules dermiques sont dissociés du derme. </li><li> Ajouter FBS à la solution contenant la collagénase derme pour un volume de 10% final de réduire l&#39;activité de la collagénase. </li><li> Passez la suspension de cellules à travers un tamis 70 pm cellule dans un nouveau tube de 50 ml pour éliminer de grandes touffes non digérés et les follicules entiers. Ajouter 10 ml de FBS DMEM/10% par 30 ml de la accréditives afin de diluer la collagénase. </li><li> Tubes à centrifuger contenant derme digéré à 30 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 minutes pour éliminer davantage de follicules entiers. </li><li> Transférer délicatement le surnageant dans un nouveau tube de 50 ml. Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension les cellules avec FBS DMEM/10% (1 ml par chiot) et compter les cellules. Cellules de la plaque avec Amniomax C-100 médias de l&#39;infection (étape 7), ou à combiner avec des lentivirus infectées par KC pour le greffage (étape 9). Rendement typique est de 20 x 10 6 cellules par chiot. </li></ol> 6. Dissocier les kératinocytes primairess (KC) à partir de tissus hachée <ol><li> KC dissociable par incubation avec des morceaux épidermiques fraîchement décongelée 0,05% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 15 min. Utilisez 7 ml de trypsine-EDTA par souris nouveau-nés. </li><li> Solution agiter doucement l&#39;épiderme contenant toutes les 5 min. </li><li> Ajouter un volume égal de solution de neutralisation à Trypsine-EDTA contenant épiderme pour réduire l&#39;activité de la trypsine. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min. Ce tissu non digérée doit flotter sur le dessus. </li><li> Versez délicatement la majeure partie de l&#39;surnageant avec du tissu non digéré. Retirer le surnageant restant avec une pipette de 10 ml sans cellule inquiétant granulés. Resuspendre culot de cellules avec du PBS. En KCs cas ne sont pas complètement granulés, verser la majeure partie du surnageant et répéter jusqu&#39;à ce que la centrifugation plupart des cellules sont culottées. </li><li> Filtrer suspension cellulaire à 70 um tamis cellulaire dans un nouveau tube pour enlever le tissu restant ou grumeaux. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugationà 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules dans CnT-07 des médias ou de PBS (1 ml par chiot) et des cellules de comptage. Utilisez CnT-07 pour étalement des cellules de l&#39;infection (étape 7), utilisez PBS à combiner avec les lentivirus infectés mDC pour le greffage (étape 9). Rendement typique est de 3-10 x 10 6 cellules par chiot. </li></ol> 7. Infecter les cellules primaires avec des lentivirus contenant shRNA ou d&#39;ADNc Le jour de l&#39;infection disséquer un autre ensemble de peaux de souris pour préparer fraîches, non traitées KCs primaires ou PID pour combiner avec les cellules infectées à jour de la greffe (étape 9). <ol><li><ol class="lalpha"><li> Pour mDC, plaque 4 x 10 6 mDC par plaque de 10 cm avec AmnioMAX-C100 médias et incuber à 37 ° C + 5% de CO 2 pour l&#39;infection lendemain à la densité cellulaire de 50%. Plaques habituellement 3-4 de mDC sont utilisés pour générer un greffon, et un total de 10-12 plaques sont nécessaires pour générer trois greffes dans une expérience. Sinon, laissez-mDC attacher et de répandre fou un minimum de 2 heures à 37 ° C + 5% de CO 2 et suivez l&#39;infection, le jour même de placage cellule. mDC aura des fibroblastes-like morphologie. </li><li> Pour KC, plaque de 12 x 10 6 par KC 10 cm plaque avec le CNT-07 médias et incuber à 37 ° C + 5% de CO 2 pour l&#39;infection lendemain. Sinon, laissez-KC fixer et de diffuser un minimum de 2 heures à 37 ° C + 5% de CO 2 et suivez l&#39;infection, le même jour. Plaques habituellement 3-4 de KC sont utilisées pour générer une greffe. Un total de 10-12 plaques sont nécessaires pour générer trois greffes pour une expérience. KCS ont une morphologie pavés. </li></ol></li><li> Préincuber cellules de 5-10 min avec 8 pg / ml Solution Polybrene à 37 ° C + 5% de CO 2. </li><li> Média d&#39;échange et d&#39;ajouter lentivirus + 8 pg / ml Solution Polybrene. Lentiviral titre variera en fonction de la construction utilisé et doit être déterminé avant l&#39;infection. </li><li> Centrifuger les plaques à 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 1 heure à 32 °, C pour infecter des cellules avec des lentivirus. </li><li> Retirer lentivirus contenant médias et ajouter du milieu frais. Pour KC, laver les cellules une fois avec du PBS avant d&#39;ajouter des fichiers multimédia fraîches. Cellules infectées Habituellement récupérer une nuit à 37 ° C + 5% de CO 2. Sinon, attendez au moins deux heures de récupération à 37 ° C + 5% CO 2 avant trypsinisation des cellules pour les greffes. Continuer à la culture une petite partie des cellules infectées pour vérifier l&#39;efficacité infection tel que décrit dans la section Représentant résultats. </li></ol> 8. Préparer les cellules infectées par greffage <ol><li> Isoler frais mDC primaires ou KCS de la peau en utilisant les étapes 4-6. Resuspendre les cellules dans du PBS glacé stérile. Compter les cellules. </li><li><ol class="lalpha"><li> Pour cutanée gène knockdown / surexpression du greffon spécifique, dissocier mDC infectés à partir de plaques en utilisant 0,05% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 8 min. </li><li> Pour épidermique gène knockdown / surexpression du greffon spécifique, dissocier KC infectés à partir de plaques using 0,125% de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 15 min. </li></ol></li><li> Neutraliser l&#39;activité de la trypsine en utilisant FBS DMEM + 10% (MDC) ou d&#39;une solution de neutralisation (KC). Transférer les cellules trypsinisées un tube de 50 ml. </li><li> Sédimenter les cellules par centrifugation à 200 xg sur une centrifugeuse de paillasse pendant 5 min. </li><li> Resuspendre les cellules dans du PBS glacé stérile. Compter les cellules. </li><li> Combinez les cellules infectées par le virus avec le type fraîchement préparé homologue non traitée cellule. Pour une greffe, combiner 7-10 x 10 6 mDC avec 7-10 x 10 6 KCs dans du PBS glacé et stérile culot de la suspension de cellules dans une centrifugeuse de paillasse à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 50 -100 ul glacée PBS stérile. Gardez les cellules sur la glace jusqu&#39;à ce nu / nu souris chambres sont prêtes. </li></ol> 9. Créer lit de la plaie et de la Chambre Fix sur Retour de nu / nu souris Une journée avant la greffe, stériliser les instruments chirurgicaux avec les chambres de silicium autoclave et stérile par trempage dans de l&#39;éthanol à 70%. Remplacer l&#39;étha 70%nol avec du PBS stérile avant d&#39;utiliser les chambres. <ol><li> Anesthetize nu / nu souris (7-12 femelles semaines d&#39;âge) en utilisant la kétamine (8 mg / ml) / xylazine (1,6 mg / ml) par injection intrapéritonéale (100 μl/10 g de poids corporel) ou autre méthode préférée. Appliquer du lubrifiant oculaire. Lieu coussin chauffant sous la souris. </li><li> Désinfecter la peau nue arrière de la souris avec de l&#39;iode et le nettoyer avec des tampons d&#39;alcool. </li><li> Ajouter 1-3 gouttes bupivicaïne 0,25% à site de l&#39;incision par voie topique. Pincer la peau de souris nue de retour à la base du cou avec une pince. </li><li> Découpez un petit trou circulaire (~ 1 cm de diamètre) dans la peau pincée avec des ciseaux stériles. </li><li> Placez chambre stérile sur le lit de la plaie et couvrir les bords de la chambre avec la peau environnante. </li><li> Chambre sécurisée en place avec des sutures le long des bords de la chambre (6 points par chambre) comme indiqué sur la figure 2A. </li><li> Lorsque chambres sont prêtes, doucement suspension de cellules de turbulence et d&#39;élaborer en 23 aiguille de la jauge fixée à une seringue de 1 ml. Si suspension cellulaire a condensé en bas, doucementremettre en suspension avec 1 embout de pipette ml avant de tirer dans l&#39;aiguille. </li><li> Chambre de ponction avec une aiguille et lentement goutte à goutte sur les cellules de la plaie. </li><li> Souris placer dans des cages propres, autoclavés. Maison 2 souris par cage et ajouter des antibiotiques et des Tylenol (3 mg / ml) à de l&#39;eau potable. Dans notre expérience, deux souris femelles par cage n&#39;ont pas abouti à un traumatisme défavorable à la chambre, greffe, ou des animaux. </li><li> Placez le coussin chauffant moins de la moitié de la cage et observer souris jusqu&#39;à ce que l&#39;anesthésie se dissipe. </li></ol> 10. Retirer Chambre Après 7-9 jours <ol><li> Anesthésier chambré nu / nu souris comme à l&#39;étape 9.1. Appliquer du lubrifiant oculaire. </li><li> Désinfectez la peau autour de la chambre avec de l&#39;iode et le nettoyer avec des tampons d&#39;alcool. </li><li> Découpez soigneusement points et retirer de la chambre. </li><li> Retirez délicatement la chambre de la souris. Si de nouveaux bâtons de greffes de peau à la chambre, lever une partie de la chambre et du greffon doucement séparé de la chambre à l&#39;aide de pinces. Maintenir vers le bas lors de l&#39;enlèvement de greffage de la chambre. Greffe devrait toilettesk terne et opaque comme dans la figure 2B. </li><li> Appliquez une compresse non adhérente d&#39;une mince pellicule d&#39;antibiotiques sur la plaie ouverte et suture en place (2 points). </li><li> Enveloppez bandage autour de la souris pour fixer le tampon et protéger la plaie. Suturer pansement en place. </li><li> Les chambres de silicium sont nettoyés en les frottant avec du savon doux et rincer abondamment avec de l&#39;eau déminéralisée. Faire tremper les chambres de l&#39;éthanol à 70% pendant la nuit, l&#39;air sec, et à stocker. </li></ol> 11. Examinez la souris pour la croissance des cheveux <ol><li> Retirer pansements et tampons après 3 jours de retrait de chambre. Greffe doit être sec et opaque à une couleur brune. </li><li> Vérifiez périodiquement souris pour la croissance des cheveux. Les cheveux doivent commencer à montrer moins 16 jours après la greffe. </li></ol> Aperçu des méthodes d&#39; Jour 1 (2-3 h): Sacrifiez les nouveau-nés, enlever la peau, et laissez dispase à 4 ° C pendant la nuit. Jour 2 (2-3 h): Isoler les cellules primaires de la peau etplaque à une densité cellulaire recommandée. Jour 3 (3-4 h): infecter les cellules avec des lentivirus. Enlever la peau d&#39;un autre ensemble de nouveaux-nés et de laisser le dispase à 4 ° C pendant la nuit. Jour 4 (6-8 h): Isoler les cellules primaires de peau, compter, et laisser sur la glace. Récupérer lentivirus cellules infectées par la trypsine et centrifugation, compter, et de combiner 7-10 x 10 6 cellules dermiques et les kératinocytes dans 50-100 pi de PBS par greffe. Créer lit de la plaie sur la souris, fixez chambre, et appliquer le mélange de cellules à lit de la plaie. Procédure Alternative Présente Contours procédure alternative sera de raccourcir la procédure de quatre jours à trois. <ol><li> Combinez les jours 1 et 2 par le traitement des peaux de souris dans la dispase à 37 ° C pendant une heure (h heure 5-7). </li><li> Combinez Jour 2 et Jour 3 par infection de cellules avec des lentivirus après étalement des cellules pendant deux heures (heure de temps estimé 5-7). </li></ol>

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Essais de reconstitution de coiffure fournir un modèle de régénération organe unique d&#39;examiner le mécanisme de la formation de novo follicule pileux. Ici, nous décrivons un essai de chambre modifié cheveux utile pour déterminer la fonction des gènes dans la formation du follicule pileux. Notre test est basé sur l&#39;analyse reconstitution chambre cheveux signalé 5, 6,11, ce qui nous modifiée pour introduire une technique d&#39;expression lentiviral pour atteindre la surexpression du gène ou effet de choc soit dans les types de cellules dermiques ou épidermiques. Notre analyse offre une alternative rapide à générer tissu-spécifique KO génétique. Ce test nous permet de démontrer la fonction des gènes dans la formation des follicules pileux en aussi peu que trois semaines d&#39;infecter les cellules primaires avec des lentivirus à la collecte de greffe. Notre analyse peut être étendue pour traiter les interactions génétiques utilisant combinaison shRNA / livraison ADNc par lentivirus dans un type de cellule 12, ainsi que permet l&#39;examen de la signalisation entre le typ de cellules dermiques et épidermiqueses. Notre analyse des cheveux est le mieux adapté pour la détection de fortes phénotypes de gain ou de perte-de-fonction dans la régénération du follicule pileux, tandis que les défauts subtils sont plus difficiles à observer. Nous avons démontré avec succès la fonction cutanée gène spécifique de quelques gènes à l&#39;aide de notre test régénération des cheveux 1,12. Basé sur le marqueur GFP co-exprimé à partir du vecteur lentivirus exprimant shRNA 10, nous avons démontré que l&#39;expression de shRNA cellules du donneur dermiques persisté dans les greffes de cheveux régénérés. Cellules GFP-positives étaient présents dans la papille dermique (DP) des follicules pileux régénérées (figure 3). Les cellules DP probablement composé de différents niveaux d&#39;inactivation génique comme cellules expriment des niveaux variables de la GFP, donc le phénotype observé cheveux follicule est une gamme de génétique hypomorph à null. Une amélioration pour ce test sera d&#39;établir une sélection rapide et efficace pour les cellules exprimant shRNA élevés avant Grafting telles que l&#39;utilisation FACS pour purifier fortes cellules exprimant la GFP. Une alternative est de remplacer les cellules mutantes déficientes ou conditionnelle dans cet essai 9. D&#39;autre part, un système de culture qui peut préserver la fonction des cellules DP est très utile en tant que puissance DP est progressivement perdue dès que les cellules dermiques primaires sont passées. Systèmes de culture possibles comprennent l&#39;utilisation de biomatériaux dérivés de niche artificielle ou de cultures d&#39;agrégation 2,7,8,13. Une autre amélioration consiste à générer une méthode fiable épidermique gel cellule avec un taux de récupération élevé de cellules car cela permettra de réduire l&#39;utilisation de la deuxième série de souriceaux (étape 7) pour générer des kératinocytes fraîches dans cutanée spécifique de perte ou de gain de études de la fonction. Ce dosage cheveux chambre de produit de densité follicule pileux et une qualité similaire à la peau de souris normale, bien que la croissance des cheveux est légèrement moins synchronisée et l&#39;orientation follicule est plus aléatoire. A quelques limitations du test génétique régénération des cheveux inclus,e l&#39;exigence d&#39;une grande quantité de lentivirus et le nombre de cellules, et c&#39;est un travail très intensif en termes de méthodes chirurgicales par rapport à d&#39;autres formes d&#39;essais de reconstitution de cheveux tels que le patch et analyses rabat 3,4,14. Cependant, la qualité des follicules pileux et le calendrier de détecter la croissance des cheveux est supérieur à d&#39;autres épreuves 4. Notre analyse ciblée régénération des cheveux fournit un compagnon pratique et rapide pour les modèles existants génétiques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170-122 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-065 </td><td></td></tr><tr><td> 0,25% de trypsine-EDTA </td><td> Invitrogen </td><td> 25200-056 </td><td></td></tr><tr><td> Cnt-07 </td><td> Cellule N Tec </td><td> CnT-07 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 </td><td> Invitrogen </td><td> 17001-074 </td><td></td></tr><tr><td> AminoMAX-C100 Supplément </td><td> Invitrogen </td><td> 12556-015 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Invitrogen </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15710-064 </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> Roche </td><td> 4942078001 </td><td></td></tr><tr><td> Collagénase de type 1 </td><td> Sigma </td><td> C-0130 </td><td></td></tr><tr><td> Polybrène </td><td> Sigma </td><td> 107689-10G </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture tissulaire </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772E </td><td></td></tr><tr><td> Ciseaux à dissection </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-999 </td><td></td></tr><tr><td> Forceps </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-275 </td><td> courbe </td></tr><tr><td> Scalpal </td><td> Medex Supply </td><td> GRF-2975 n ° 10 </td><td> Pas de taille. 10 </td></tr><tr><td> 70 coloration cellulaire pm </td><td> VWR </td><td> 21008-952 </td><td></td></tr><tr><td> Tube de 15 ml à centrifuger conique </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 959-49D </td><td></td></tr><tr><td> Tampons imbibés d&#39;alcool </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1368063 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguille de calibre 23 jauge </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14 à 821-13F </td><td></td></tr><tr><td> Lubrifiant oculaire </td><td> CVS </td><td> 8883660 </td><td></td></tr><tr><td> Providone-Lodine tampons </td><td> Fisher Scientific </td><td> NC0116841 </td><td></td></tr><tr><td> Silicon Chambers </td><td> Renner GmbH </td><td> F2U, 30268 </td><td></td></tr><tr><td> Sutures </td><td> Acuderm </td><td> SUP3524 </td><td></td></tr><tr><td> Bandage souple </td><td> Fisher Scientific </td><html><td> 22-363-100 </td><td></td></tr><tr><td> Pansement non-adhérent </td><td> TELFA </td><td> 1050 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Matériels </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Solution de lavage PBS 500 pg / ml de pénicilline / streptomycine 12,5 pg / ml Fungizone 100 pg / ml de gentamycine Solution Dispase HBSS 2,5 mg / ml final Dispase 100 pg / ml de gentamycine Médias neutralisants HBSS 15% (v / v) FBS Solution de collagénase 0,25% (p / v) de la collagénase de type 1 ontenu &quot;&gt; 100 pg / ml de pénicilline / streptomycine 2,5 pg / ml Fungizone 50 pg / ml de gentamycine Solution polybrène HBSS 8 ug / ml (p / v) Polybrène </td></tr></tbody></table>

analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Morphogénèse du follicule pileux, un processus complexe nécessitant l&#39;interaction entre l&#39;épithélium dérivées de kératinocytes et le mésenchyme sous-jacent, est un système modèle intéressant pour étudier le développement d&#39;organes et de tissu-spécifique de signalisation. Bien que le développement du follicule pileux est génétiquement docile, une analyse rapide et reproductible des facteurs essentiels de ce processus demeure un défi. Nous décrivons ici un procédé destiné à générer une surexpression ou à médiation shRNA knockdown utilisant des facteurs de lentivirus de manière spécifique d&#39;un tissu. En utilisant une version modifiée d&#39;un modèle de régénération des cheveux 5, 6, 11, on peut réaliser un gain ou une perte robuste de fonction d&#39;analyse dans des kératinocytes primaires de souris ou des cellules dermiques de faciliter l&#39;étude des cellules épithéliales-mésenchymateuses voies de signalisation qui conduisent à la morphogénèse du follicule pileux . Nous décrivons comment isoler les kératinocytes primaires de souris frais et les cellules dermiques, qui contiennent des cellules de papilles dermiques et de leurs précurseurs, livrer lentivirus contaiNing soit shRNA ou de l&#39;ADNc de l&#39;une des populations de cellules, et de combiner les cellules pour produire des follicules pileux entièrement formées sur le dos des souris nude. Cette approche permet l&#39;analyse des tissus des facteurs spécifiques nécessaires pour générer les follicules pileux dans les trois semaines et fournit un compagnon pratique et rapide pour les modèles existants génétiques.

Dans la figure 1, nous montrons le résultat de la dermo-knockdown shRNA spécifique lentiviral de Smoothened (Smo), une composante essentielle de signalisation Shh, dans une greffe de cheveux de régénération de 3 semaines vieux. Greffes de contrôle à l&#39;aide vecteur lentiviral eux seuls montrent la croissance des cheveux robuste (figure 1A). En revanche, cutanée spécifique knockdown des résultats Smo en perte de croissance des cheveux (figure 1B). Hématoxyline et éosine représente le stade de follicules pileux en matière de contrôle et des conditions expérimentales (figure 1C, D). Le phénotype de croissance des cheveux des traitements similaires peuvent varier en fonction des expériences, y compris le contrôle positif à l&#39;infection par vecteur lentiviral seul. Par conséquent greffes de contrôle positif doit toujours être inclus dans chaque expérience comme une référence de 30% des greffes peut échouer en raison de la cicatrisation ou une pièce jointe incomplète des greffes. Dans le cas du test d&#39;une interaction entre deux facteurs tels que la surexpression d&#39;un facteur d&#39;ADNc à nouveauSCUE shRNA médiation knockdown d&#39;un autre facteur, il faut toujours inclure des greffes knockdown seules à manifester le résultat la perte de fonction dans chaque expérience. Cela fournira une gamme nécessaire pour déterminer comment un gène particulier perturbe la voie de la régénération des follicules pileux et de deux gènes interagissent. Retrait de la chambre (figure 2A) doit être fait avec soin. Le greffon nouvellement créé devrait être légèrement opaque avec une surface mate (figure 2B). La greffe peut s&#39;en tenir à la chambre, donc soulevant délicatement un côté est important de s&#39;assurer que la greffe reste attaché au lit de la plaie. Le greffon est assez stable après trois jours et devrait présenter peu de difficultés lors du retrait du pansement. La croissance des cheveux consistant devrait être observé après trois semaines (figure 2C). L&#39;omission soit mDC ou KCS se traduira par une plaie récupéré sans cheveux (figure 2D) 11. La mort cellulaire ou de perte de cellules dans l&#39;un destypes de cellules se traduit également par pas de cheveux, contrairement à la régénération des cheveux réduite en dermo-Smo knockdown, comme indiqué dans la figure 1B. Afin d&#39;assurer un dosage de succès, il est essentiel pour atteindre plus de 90% infection virale des cellules avec surexpression approprié ou l&#39;efficacité knockdown avant la greffe. En raison des contraintes de temps de la procédure de greffe, nous vous recommandons DÉPANNAGE efficacité d&#39;infection virale avant de commencer une expérience de greffe, et de toujours enregistrer une petite partie des cellules le jour de la greffe procédure pour vérifier perte ou gain de l&#39;expression. Lentiviral titre variera en fonction de la construction utilisé et doit être déterminé avant l&#39;infection d&#39;atteindre une efficacité de 90-100%. Nous surveillons l&#39;efficacité infection virale co-exprimée avec la GFP à partir du vecteur lentiviral. Nous avons régulièrement effectuer une PCR quantitative et / ou Western blot pour déterminer l&#39;étendue de knockdown ou la surexpression. En utilisant deux vecteurs d&#39;expression de marqueurs fluorescents pour marquercellules infectées fournit un moyen de signaler perdurance du signal et le nombre de cellules exprimant nos constructions dans les greffes matures. Nous utilisons GFP dirigée par un promoteur CMV du vecteur lentiviral pSicoR-CMV-GFP 10 en combinaison avec Smo shRNA. Dans la figure 3, on montre une vieille de 3 semaines cutanée du greffon spécifique où la GFP est exprimée en lentivirally-papille dermique du follicule pileux représentant. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;analyse histologique de la croissance du follicule pileux. (A) Voir la régénération de la greffe de cheveux avec le contrôle des cellules dermiques infectées par le vecteur lentiviral vide et kératinocytes non traités. (B) à l&#39;aide shRNA knockdown Smoothened lentiviral dans les cellules dermiques combinée avec les résultats des kératinocytes non traités dans la perte des follicules pileux. (C) hématoxyline et éosine montre f cheveux anagènesollicles dans les greffes de commande s&#39;étendent vers le bas dans le derme et (D) Smoothened follicules pileux knockdown restent chétifs et largement absents. Toutes les images sont trois semaines après la greffe. La barre d&#39;échelle représente 100 um. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4344/4344fig2.jpg" /> Figure 2. Greffe de cellules primaires. (A) nu / nu à la souris avec suturées chambre de logement primaires des cellules dermiques et les kératinocytes. (B) Retrait de la chambre expose nouvellement formé peau est terne et opaque par nature. (C) les poils entièrement cultivées sur l&#39;utilisation du greffon sauvage Primaire cellules dermiques et les kératinocytes à trois semaines après la greffe. (D) Ajout de cellules dermiques primaires sans kératinocytes conduit à aucun cheveu après trois semaines. Des résultats similaires sont observés avec plus de kératinocytes primaires sans cellules dermiques. Figure 3. Maintien de l&#39;expression de la GFP dans papille dermique. Images confocales de papille dermique d&#39;une greffe de 3 semaines régénéré ancienne. GFP a été exprimé dans la population de cellules dermiques à partir d&#39;un vecteur lentiviral et détectés dans la papille dermique (vert). Versican (rouge) délimite la papille dermique et les noyaux étaient étiquette avec Hoechst (bleu). Remarque GFP est exprimé spécifiquement dans les cellules dermiques mais pas dans les kératinocytes environnants. La barre d&#39;échelle représente 20 um.

Tissu-spécifique de l&#39;analyse d&#39;un modèle de régénération des cheveux à l&#39;aide follicule lentivirus de médiation de gain ou de perte de fonction.

Analyse rapide de la génétique des épithélio-mésenchymateuse signalisation lors de la régénération des cheveux

La morphogenèse du follicule pileux, un processus complexe nécessitant une interaction entre les kératinocytes dérivés de l'épithélium et le mésenchyme sous-jacent, est un ...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier les fonctions spécifiques aux tissus des voies de signalisation essentielles à la formation du follicule pileux. Cela est réalisé en isolant tout d'abord des cellules primaires dermiques et épidermiques de souriceaux nouveau-nés. Ensuite, l'expression génique est modifiée en infectant les cellules primaires avec un lentivirus.La troisième étape consiste à combiner les populations cellulaires épidermiques et dermiques dans des chambres fixées sur un lit de plaie chez une souris nue. La greffe est ensuite surveillée pour la croissance des poils. En fin de compte, l'effet de la manipulation génétique sur la formation des follicules pileux peut être évalué visuellement et par coloration histologique du site de greffe.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme le modèle murin nacal, est que la greffe peut être réalisée en trois semaines. Cette méthode permet de répondre à des questions essentielles dans le domaine de la biologie du développement, notamment comment des facteurs présents dans un tissu peuvent influencer la signalisation et la fonction dans un autre tissu. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous souhaitions analyser les fonctions spécifiques aux tissus des molécules de plafond dans la formation du follicule pileux, après avoir lavé une souris ayant été euthanasiée par asphyxie.Couper chaque membre et la queue à la base du tronc à l’aide de ciseaux stériles. Ensuite, saisir fermement le corps entre une paire de pinces courbes et pratiquer une incision le long de la peau dorsale, de la tête à la queue, à l’aide d’un scalpel. Ne pas pénétrer la fascia sous-jacente.Maintenant, retirez soigneusement la peau le long de la ligne médiane de la souris. Saisissez fermement la souris exposée avec le côté long de la pince courbe et insérez une autre paire de pinces courbes sous la peau à l'extrémité postérieure de la souris. Retirez ensuite délicatement la peau entièrement de la souris d'un seul mouvement fluide et jetez la carcasse.Placer la peau dans le premier récipient contenant la solution de lavage, côté derme vers le bas. Étaler la peau dans la solution et l'agiter à l'aide de la pince. Laisser ensuite la peau dans la solution de lavage pendant la dissection de la peau suivante.Après avoir placé le prochain morceau de peau disséqué dans le premier récipient contenant la solution de lavage, transférez le morceau de peau précédent dans le second récipient contenant la solution de lavage. Maintenez les morceaux de peau dans la seconde solution de lavage jusqu'à ce que tous les morceaux soient récoltés. Après le lavage final, transférez jusqu'à cinq morceaux de peau dans un récipient contenant la solution disbe froide.Aplatir les peaux côté derme vers le bas et les laisser flotter pendant huit à 16 heures à quatre degrés Celsius. Transférer une peau depuis les bacs réfrigérés vers un nouveau plat. L’aplatir côté derme vers le bas.Saisir l'épiderme avec une pince et le détacher lentement du derme. L'épiderme doit se détacher en un seul morceau, il sera blanc et mince, tandis que le derme sera brunâtre, plus épais et gélatineux. Répartir les deux tissus dans des boîtes de culture distinctes pour commencer l'isolement cellulaire.Pour isoler les cellules dermiques, hacher finement le derme en morceaux très petits à l’aide de deux scalpels. Incuber le tissu dermique haché avec une solution fraîchement préparée de collagénase à 37 degrés Celsius pendant une heure, en agitant doucement le mélange cellulaire toutes les 10 minutes ; lorsque la digestion est terminée, cesser l’agitation.La suspension doit contenir principalement des cellules isolées, et la solution doit être passée d’un état clair à un état trouble. Ajoutez alors un volume de 10 % de SBF à la suspension cellulaire. Filtrez-les à travers un tamis cellulaire de 70 microns dans des tubes de 50 millilitres.Collectez jusqu'à 30 millilitres d'écoulement par tube. Poursuivez avec l'isolement des cellules dermiques selon le protocole écrit. Pour isoler les kératinocytes, découpez chaque épiderme en six à huit morceaux plus petits.Incuber le tissu tranché avec de la trypsine-EDTA 0,05 % récemment décongelée à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Poursuivre avec l'isolement des kératinocytes selon le protocole écrit, anesthésier une souris nue femelle âgée de sept à douze semaines à l'aide de kétamine et de xylazine ou d'une méthode préférée. Veiller à appliquer un lubrifiant oculaire et placer la souris sur un tapis chauffant.Désinfectez maintenant la peau du dos avec de l'iode, suivie de compresses alcoolisées. À l'aide de pinces, pincez la peau à la base du cou et découpez un trou d'un diamètre d'un centimètre dans la peau pincée. Placez la chambre sur le lit de la plaie et recouvrez les bords de la chambre avec la peau environnante.Fixez la chambre avec environ six points de suture. N'attachez qu'une seule chambre par souris, uniquement le long de ses bords. Une fois la chambre fixée, vérifiez le sursis cellulaire. S’il est condensé au fond, resuspendez-le délicatement à l’aide d’une pipette de un millilitre.Agitez doucement la suspension cellulaire et aspirez-la dans une aiguille de calibre 23 fixée à une seringue d'un millilitre. Percez chaque chambre avec l'aiguille et laissez couler lentement les cellules en suspension dans le PBS sur la plaie. Une fois que les souris se sont remises de l'anesthésie, placez-les dans des cages propres stérilisées par autoclavage, avec deux souris par cage.Veillez à administrer les antibiotiques et le Tylenol par l'eau de boisson. Après sept à neuf jours, anesthésiez la souris nue traitée comme précédemment. Désinfectez la peau autour de la chambre avec de l'iode et nettoyez-la avec des compresses imbibées d'alcool.Coupez soigneusement les points de suture et retirez-les de la chambre. Retirez délicatement la chambre si la nouvelle peau y adhère. Séparez délicatement la greffe de la chambre.À l’aide de pinces, maintenez le greffon vers le bas. Lors du retrait de la chambre, le greffon doit paraître terne et opaque. Appliquez un pansement non adhérent avec un film mince d'antibiotiques sur la plaie ouverte et fixez-le en place à l’aide de deux points de suture.Enroulez un bandage autour de la souris pour fixer le pansement et protéger la plaie. Faites une suture pour maintenir le bandage en place. Après trois jours, retirez les bandages et le pansement. La souris n'a pas besoin d'être anesthésiée durant cette étape.La greffe doit être sèche et de couleur opaque à brune. Vérifiez périodiquement la greffe pour la repousse des poils, qui devrait commencer à apparaître 16 jours après la greffe. Un abaissement spécifique de la derme du gène smoothened, qui est un composant essentiel de la signalisation sonic hedgehog, a été réalisé dans des cellules dermiques isolées.Ces cellules ont été appliquées à des greffes de reconstitution du follicule pileux en utilisant le protocole décrit. Après trois semaines de croissance, les greffes du contrôle positif avec le vecteur lentiviral seul ont montré une croissance pileuse importante. Toutefois, la diminution de l'expression du gène smoothened a entraîné une réduction sévère de la croissance pileuse.Les greffes témoins négatives, auxquelles on avait omis soit les cellules dermiques primaires soit les kératinocytes, ont donné lieu à un site de plaie cicatrisé sans aucun poil. De même, la mort cellulaire ou la perte cellulaire de l'un des types cellulaires dans la greffe a également entraîné une absence de croissance pileuse. On a déterminé que le vecteur rétroviral lentiviral présentait une bonne efficacité d'infection avant l'expérience de greffe, et il a également été conçu pour produire la GFP en association avec cette molécule Smoothened, S-H-R-N-A.Ainsi, l'observation de la papille dermique des follicules pileux en optique fluorescente constituait un contrôle utile pour confirmer la durée de l'expression lentivirale. Après trois semaines, une coloration H et D est utilisée pour représenter le stade de croissance des follicules pileux dans la greffe témoin et leur stade de développement retardé lorsque l'expression de Smoothened est inhibée. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 14 heures réparties sur trois jours, si elle est effectuée correctement. Cette technique peut être étendue afin d'explorer la relation entre tumeur et stroma durant la progression du cancer dans le domaine de la biologie du cancer.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment étudier la fonction des gènes dans la formation des follicules pileux. Utilisez notre test de reconstitution rapide des cheveux comme alternative aux invalidations génétiques traditionnelles.

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