Name: Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte Drosophila Rétines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Découvrez la dissection et l'immunohistochimie de rétines de Drosophila aux stades larvaire, nymphal et adulte. Cette méthode permet de visualiser l'expression protéique et d'étudier la différenciation des photorécepteurs au niveau cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par une bourse Ehrman à HY. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund pour la recherche médicale postdoctorale bourse de JJR, des subventions du NIH F32EY016309 au format DV, Bourse de Thèse Université de New York doyen de DJ, NIH GrantR01 EY13010 de CD et une bourse de recherche DFG à JR (RI 2208/1- 1). Nous remercions Nina Vogt et Pamela Boodram des commentaires sur le manuscrit.

1. Introduction Dans cette vidéo, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes de développement définis: le troisième stade larvaire, la midpupal et le stade adulte. Bien que notre protocole fonctionne aussi pour d&#39;autres stades nymphal (pour plus de détails sur les étapes précédentes, voir 16), nous avons choisi la scène midpupal, comme il est optimal pour l&#39;imagerie tous les PR dans un plan focal et leurs noyaux sont facilement identifiables, ce qui facilite la visualisation des les modèles d&#39;expression de facteurs de transcription. La dissection des rétines fin nymphe est très similaire à la dissection des rétines adultes. Tout d&#39;abord, nous montrer comment recueillir les larves et les nymphes aux étapes souhaitées. Ensuite, nous expliquons comment obtenir des dissections optimales de larves 17-18, midpupal et rétines adultes. Deuxièmement, nous démontrons comment visualiser développement PR à ces étapes en utilisant la microscopie confocale et immunohistochimie. La période de développement des insectes est dépendant de la température. Afin de faciliter la mise en scène reproductible des larves et des nymphes, nous vous recommandons de soulever tous les stocks de mouche à 25 ° C sous un 12 h/12 ​​h de lumière / obscurité cycle. Troisième stade larvaire: Environ 96 heures après la ponte (à 25 ° C), à la fin du troisième stade d&#39;arrêt d&#39;alimentation des larves et se promener sur les parois du flacon alimentaire, où ils finissent par se nymphosent. Utilisez une brosse douce ou une pince pour enlever délicatement une errance de troisième stade larvaire de la paroi du flacon de nourriture. Pupes de 50% («midpupae &#39;) sont observées environ 48 heures après la nymphose. Pour timing exact, vous pouvez entourer juste formé pupes blanc avec un marqueur sur le flacon de nourriture. Vous pouvez également déplacer les pupes blanc à un nouveau flacon pour obtenir un flacon de mise en scène uniforme (pour la stadification des pupes à l&#39;aide des critères morphologiques, voir 19). Après 48 heures, bien réelsove l&#39;midpupae du flacon à l&#39;aide d&#39;une pince. Les mouches adultes: anesthésier les mouches adultes jeunes (2-5 jours après l&#39;éclosion) sur un pad CO 2. Enlever les têtes à l&#39;aide d&#39;une pince et de les stocker dans un verre bien plat froid contenant du PBS 1x. 3. Procédure Dissection (À propos de 1-2 heures par expérience) Après la collecte du spécimen, les placer dans une goutte de PBS froid sur un plat de dissection Sylgard. Disséquer environ 10-15 rétines par génotype. S&#39;il vous plaît consulter les fiches signalétiques ainsi que la santé environnementale de votre institution et sécurité pour la manipulation des réactifs et du matériel (voir les tableaux à la fin de ce protocole). 1. Disques yeux larvaires Imaginal <ol><li> Localiser l&#39;extrémité antérieure de la larve, qui contient les crochets buccaux. Utilisez une pince à appuyer sur la partie centrale de la larve doucement contre le fond du plat Sylgard. Utilisez another Pince pour saisir les crochets buccaux et tirez doucement et lentement loin du corps. Jeter la partie principale du corps et utiliser les pièces buccales pour maintenir la partie antérieure afin d&#39;éliminer les tissus étrangers à partir des disques imaginaux qui restent attachées au cerveau. </li><li> Transfert du cerveau avec des disques imaginaux en saisissant les crochets buccaux avec une pince à 1x PBS dans une cuve en verre de trois puits. Effectuez l&#39;étape de fixation (étape 4.1.). </li><li> Après fixation, enlever les glandes salivaires, le tissu adipeux et tirez le cerveau loin du disque œil-antennaire imaginale. Pour améliorer l&#39;accessibilité des anticorps &quot;difficiles&quot;, la membrane peripodial, qui se trouve sur la surface de l&#39;épithélium, peut être enlevé en appuyant sur la partie du disque antennaire et le pelage de la membrane de distance avec une broche de dissection. Ensuite, effectuez l&#39;immunohistochimie (étape 5.1.). </li></ol> 2. 50% nymphose / Midpupal Rétines <ol><li> Tenez extrémité postérieure de la coque de nymphose avec une pince.Retirez délicatement la surface antérieure de la coque de nymphose en saisissant la cuticule avec un autre pince et tirer lentement loin de la pupe. Décollez cuticule résiduelle pour exposer la tête. </li><li> Utilisez les conseils forceps »pour percer le sous-jacent, sac mou dans la région dorsale antérieure. Ceci permet d&#39;accéder à la tête. Séparez délicatement la tête du thorax par aspirer lentement la tête avec une pipette P20. Expulser la tête de la pointe de la pipette dans du PBS frais froid 1x et enlever l&#39;excès de tissu; saisir la cuticule tête et retirer trompe. Passez à l&#39;étape de fixation (étape 4.1.). </li><li> Percer le lobe optique avec une broche de dissection pour stabiliser le tissu. Insérer la goupille d&#39;autres dissection entre la lame et la rétine de séparer la rétine de la lame / lobe optique. Effectuer immunohistochimie (étape 5.1.). </li></ol> 3. Yeux adultes <ol><li> Prenez le centre de la capsule postérieure de la tête avec une pince et retirer des pièces buccales (trompe), Tiss graisseue et trachées. </li><li> Prenez la cuticule dorsale tête avec une pince et utiliser l&#39;autre pour séparer les yeux du tissu cérébral en tirant doucement sur le côté. Dans la plupart des cas, la lame, une gaine mince et transparente des neuropile cerveau, restera attaché à la rétine. Il est plus facile d&#39;enlever la lame après fixation. </li><li> Retirer cuticule à la marge œil, mais laisser un petit morceau arrière pour faciliter le transfert de la rétine à des solutions différentes. Effectuer la fixation (étape 4.1.). </li><li> Retirer la lame en le saisissant sur un côté avec une pince et tirant légèrement sur le côté avec les pinces autres sans nuire à la rétine. Retirer cuticule résiduelle, car il pourrait se replier sur la rétine lors du montage. Ces deux étapes sont essentielles pour la visualisation de photorécepteurs, qui, autrement, seraient masqués par la lame et reste de la cuticule pendant le processus d&#39;imagerie. Passez à l&#39;immunohistochimie (étape 5.1.). </li></ol> 4. Fixation et Washing (environ 1 h) <ol><li> Stocker les rétines disséqués dans du PBS 1x dans un plat en verre de trois puits placé sur la glace tout en préparant le fixateur frais (dilué 40 microlitres de solution de formaldéhyde à 37% avec 360 ul de PBS 1x, vortex et stocker de la glace). Nous vous recommandons de procéder à la fixation de protocole et d&#39;éviter les longues périodes d&#39;entreposage sur glace (&gt; 15 min). </li><li> Remplacer 1x PBS avec 200 pi de solution de formaldéhyde à 3,7%. Assurez-vous que le tissu est immergé dans un fixateur. Cela est essentiel, car il ne peut être autrement fixé correctement. Si nécessaire, enlever les bulles d&#39;air et les trachées avec la pince. </li><li> Incuber sur agitateur pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Remplacer fixateur avec 1x PBS et rincer deux fois avec du PBS 1x. Continuer lavage dans du PBS pendant 30 min (le shaker, à la température ambiante). </li><li> Remplacer PBS avec du PBST. Rincer deux fois avec du PBST. </li><li> Procéder à l&#39;enlèvement de la membrane peripodial de disques yeux larvaires (3.1.3.) Et les lamelles de midpupal / adulte rétines &lt;strong&gt; (3.2.3., 3.3.4.). </li></ol> 5. Immunohistochimie <ol><li> Blocage: Remplacer PBS avec 200 pi de sérum normal de 5% dans du PBST et incuber rétines pendant 20 min sur agitateur à température ambiante. </li><li> Remplacer la solution de blocage avec une solution d&#39;anticorps primaire. Sceller le plat de trois puits avec du parafilm et incuber une nuit sur agitateur à température ambiante. </li><li> Remplacer la solution avec du PBST et rincer 3 fois. Continuer lavage avec PBST pour un minimum de 1 heure sur agitateur à température ambiante. </li><li> Transfert dans une solution d&#39;anticorps secondaire et incuber dans un plat en verre scellé parafilm et le shaker nuit à température ambiante. </li><li> Remplacer solution d&#39;anticorps avec PBST et rincer trois fois. Continuer lavage avec PBST pour un minimum d&#39;une heure sur agitateur à température ambiante. Les échantillons peuvent être conservés dans du PBST pendant plusieurs jours, mais il est essentiel d&#39;ajouter PBST frais au moins une fois par jour pour les empêcher de se dessécher. </li></ol> 6. Montage <ol><li> Pour le montage rétines larvaires et midpupal, utilisez la P20 pour transférer les rétines au centre d&#39;une lame de verre propre. Retirer l&#39;excès PBST. Utiliser une pince à aligner la rétine en vue de faciliter l&#39;imagerie. </li><li> Ajouter 10 ul de milieu de montage sur le dessus de la rétine. Recouvrez-les délicatement avec un glissement 24x40-1 couvercle et le joint avec du vernis à ongles transparent. </li><li> Pour montage rétines adultes, préparer des «ponts» 20: Ajoutez deux gouttes 5 ul de glycérol à 50% sur les deux extrémités d&#39;un côté verre et recouvrez-les avec des lamelles de 22x22-1 (0,13 à 0,17 mm d&#39;épaisseur). </li><li> Retirez le PBST avec une pipette P20, assurez-vous que les rétines ne se dessèchent pas. Ajouter 20 ul de milieu de montage pour le bien. Utilisez un milieu de montage pour transférer les rétines avec le P20 à la diapositive «pont» en verre. </li><li> Utilisez une pince à orienter (lentilles doivent faire face à la lame de verre) et aligner la rétine afin de faciliter l&#39;imagerie. Si nécessaire, retirer les bulles d&#39;air à la P20. </li><li> Lentementglissement lieu 24x40-1 couvercle (0,13 à 0,17 mm d&#39;épaisseur) d&#39;un côté sur le dessus et sceller les bords avec vernis à ongles ou du scotch. Conserver les échantillons à 4 ° C dans une boîte lame de microscope économiseur (garder dans le noir). </li></ol> 7. Les résultats représentatifs A titre d&#39;exemple de l&#39;application de ce protocole, nous montrons des résultats représentatifs pour visualiser la différenciation des photorécepteurs dans les trois stades de développement dans la vidéo. Une larve eye-antennaire disque et une rétine midpupal ont été colorés avec des anticorps qui étiqueter types différents photorécepteurs au cours de leur développement (figure 1A, B) et une rétine adulte a été coloré avec des anticorps Rhodopsin deux sous-types de visualiser deux photorécepteurs (figure 1C).

<ol><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li>
<li>Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardie%2C+RC+%22Sensory+Physiology%22">Sensory Physiology</a>. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).</li>
<li>O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ninaE+gene+encodes+an+opsin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ninaE gene encodes an opsin.</a> Cell. 40, 839-850 (1985).</li>
<li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+structure+of+a+rhodopsin+gene+from+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster.</a> Cell. 40, 851-858 (1985).</li>
<li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li>
<li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Drosophila+opsin+reveals+specific+patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells.</a> Neuron. 17, 1101-1115 (1996).</li>
<li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells+of+Drosophila%3A+evidence+for+induced+and+default+cell-fate+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification.</a> Development. 126, 607-616 (1999).</li>
<li>Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rhodopsin+in+R8+photoreceptors+of+Drosophila%3A+evidence+for+coordinate+expression+with+Rh3+in+R7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells.</a> Development. 124, 1665-1673 (1997).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li>
<li>Roignant, J. Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).</li>
<li>Tsachaki, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+mechanisms+underlying+the+formation+of+the+Drosophila+compound+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye.</a> Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).</li>
<li>Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+analysis+of+Drosophila+eye+development%3A+sevenless%2C+bride+of+sevenless+and+rough%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough.</a> Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).</li>
<li>Basler, K., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+cell+fate+in+the+developing+eye+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila.</a> Bioessays. 13, 621-631 (1991).</li>
<li>Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+fly+eye%3A+terminal+differentiation+events+of+the+retina%2C+corneal+lens%2C+and+pigmented+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia.</a> Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).</li>
<li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li>
<li>Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4715(2007).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Morante, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+optic+lobes+at+different+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
<li>Stowers, R. S., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+method+for+generating+Drosophila+eyes+composed+exclusively+of+mitotic+clones+of+a+single+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype.</a> Genetics. 152, 1631-1639 (1999).</li>
<li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li>
<li>Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+De-repression+of+Rhodopsins+in+Single+Photoreceptors+of+the+Fly+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002357(2012).</li>
<li>Johnston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlocked+feedforward+loops+control+cell-type-specific+Rhodopsin+expression+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye.</a> Cell. 145, 956-968 (2011).</li>
<li>Jukam, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+regulation+of+Hippo+pathway+by+Merlin%2FNF2%2C+Kibra%2C+Lgl%2C+and+Melted+specifies+and+maintains+postmitotic+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate.</a> Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).</li>
<li>Vasiliauskas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+from+rhodopsin+controls+rhodopsin+exclusion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors.</a> Nature. 479, 108-112 (2011).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

1. Dépannage D&#39;après notre expérience, les dissections requièrent de la pratique (plusieurs semaines) et sont facilitées par atteindre une position confortable à la main 21 par reposer les coudes et les avant-bras sur la table et avec les doigts en contact avec le plat de la dissection. De cette façon, les doigts, les pouces seulement, index et le majeur effectuer des mouvements subtils. Retrait de la lame sans endommager les photorécepteurs est proba...

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Tampon phosphate salin (PBS1x, pH 7,4) </td><td> Sigma </td><td></td><td> Préparer la solution mère 10x 20. Diluer avec de l&#39;eau distillée pour obtenir PBS 1x et stocker à température ambiante. Laisser refroidir dans la glace avant dissections. </td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> 9002-93-1 </td><td> Attention: Irritant Porter des gants. Préparer 50 ml 1xPBS avec 0,3% de Triton X-100 (PBST). Conservez-la à température ambiante. </td></tr><tr><td> Solution de formaldéhyde à 37% </td><td> Fisher Scientific </td><td> F75P1GAL </td><td> Attention: toxique, cancérogène probable pour l&#39;homme Porter des gants. Avant l&#39;étape de fixation, fraîchement préparer une solution à 3,7% dans une hotte en diluant avec du PBS, magasin sur la glace. </td></tr><tr><td> 5% de sérum normal de cheval </td><td> Jackson Immuno Research </td><td> 008-000-001 </td><td> Préparer 5% v / v de dilution dans du PBST. Conservez-la à quatre degrés. </td></tr><tr><td> Les anticorps primaires et secondaires (p. ex âne anti-mouton Alexa Fluor 488, Donkey anti-lapin Alexa Fluor 555, âne anti-souris Alexa Fluor 647) </td><td> Les sondes moléculaires Invitrogen </td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> Diluer Anticorps secondaires 1:800 dans du PBST et conserver à quatre degrés. </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 Phalloidin </td><td></td><td> A12379 </td><td> Diluer à 1:100 dans une solution d&#39;anticorps secondaire. </td></tr><tr><td> Réactif Slowfade Antifade Or </td><td> Les sondes moléculaires Invitrogen </td><td> S36936 </td><td> Milieu de montage. Conserver à -20 degrés. </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Fisher Scientific </td><td> G31-1 </td><td> Pour le montage. Préparer 10 ml de dilution à 50% avec de l&#39;eau, magasin distillée à la température ambiante. </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td> Pour anesthésier les mouches adultes. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Deux pinces pointues (Dumont # 55) </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11255-20 </td><td></td></tr><tr><td> Sylgard 184 Kit élastomère silicone </td><td> Dow Corning </td><td></td><td> Préparer plat dissection Sylgard en remplissant un plat de Petri en plastique avec le mélange Sylgard. </td></tr><tr><td> Trois puits plats dissection de verre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 21-379 </td><td></td></tr><tr><td> Two broches minuties de dissection (0,1 mm de diamètre) et deux pinholders (12 cm) </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td><td> Insérer une broche de minuties dans chacun des deux pinholders et plier une des repères pour former un crochet. </td></tr><tr><td> Lamelles de microscope (22x22-1 et 24x40-1) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td> Lames de microscope (25x75x1.0 mm; préalablement nettoyé) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes de 1,5 ml microtubes </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Effacer vernis à ongles ou du scotch </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agitateur orbital </td><td> Bellco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Boîte de support de diapositives </td&gt; <td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> Bemis </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> Pinceau mince </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20 et P200 micropipette et de </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscope à dissection </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Petit seau avec de la glace </td><td></td><td></td><td> Pour refroidir les plaques de verre, ainsi disséquées rétine et les solutions. </td></tr></table>

dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; drosophila</em&gt; rétines

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

L&#39;œil composé de Drosophila melanogaster est constitué d&#39;environ 750 ommatidies (yeux unitaires). Chaque ommatidie est composé d&#39;environ 20 cellules, dont les cellules sécrétrices cône lentille, les cellules pigmentaires, une cellule poils et huit photorécepteurs (PR) R1-R8 2. Les bénéficiaires principaux ont des structures spécialisées, les microvillosités rhabdomeres, qui contiennent des pigments sensibles à la lumière, les Rhodopsins (ERS). Les rhabdomeres de six PN (R1-R6) forment un trapèze et contiennent Rh1 3 4. Les rhabdomeres de R7 et R8 sont positionnées en tandem dans le centre du trapèze et partager le même chemin de lumière. R7 et R8 PR stochastique exprimer différentes combinaisons de Rhs en deux sous-types principaux 5: Dans le sous-type &#39;p&#39;, p RH3 en R7s est couplé avec RH5 en p R8S, alors que dans le sous-type &#39;y&#39;, y Rh4 dans R7s est associée à rh6 en y R8S 6 7 8. Spécification précoce des PR et le développement des ommatidies commence dans les larves des yeux antennaire disque imaginal, une monocouche de cellules épithéliales. Une onde de différenciation balaie le disque 9 et déclenche l&#39;ensemble de cellules indifférenciées en ommatidies 10-11. R8 La «cellule fondateur est spécifiée en premier et recrute R1-6 et R7 12-14. Par la suite, au cours du développement nymphal, la différenciation PR conduit à d&#39;importantes modifications morphologiques 15, y compris la formation rhabdomere, la synaptogenèse et d&#39;expression finalement rh. Dans ce protocole, nous décrivons les méthodes de dissection de la rétine et immunohistochimie à trois périodes déterminées du développement de la rétine, qui peuvent être appliquées pour traiter une variété de questions concernant la formation de la rétine et les voies de développement. Ici, nous utilisons ces méthodes pour visualiser la différenciation progressive proportionnelle au niveau unicellulaire en tout montage des larves, adultes et midpupal rétines ( <strong&gt; Figure 1).

La<em&gt; Drosophila</emRétine&gt; est un réseau cristallin de type composé d&#39;un petit nombre de types de cellules qui sont produites d&#39;une manière stéréotypée<sup&gt; 1</sup&gt;. De la perméabilité à l&#39;analyse génétique sophistiquée permet l&#39;étude des programmes complexes de développement. Ce protocole décrit les dissections et immunohistochimie de rétines à trois stades de développement distincts, en mettant l&#39;accent sur la différenciation des photorécepteurs.

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte<em&gt; Drosophila</em&gt; Rétines

L'œil composé de Drosophila melanogaster se compose d'environ 750 ommatidies (unités visuelles). Chaque ommatidie est composée d'environ 20 cellules, notamment...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir des dissections optimales de rétines de drosophile et de visualiser les protéines exprimées dans la rétine en développement. Premièrement, les dissections de rétine sont démontrées à trois stades de développement : le stade larvaire, le stade pupal et le stade adulte. Les étapes suivantes sont la fixation et l'immunohistochimie.Dans la dernière étape, les rétines sont montées sur des lames pour être visualisées par microscopie confocale. En définitive, ce protocole illustre le développement et la différenciation des cellules rétiniennes au niveau de la cellule unique. Historiquement, la rétine de drosophile a constitué un système idéal pour aborder un large éventail de questions en biologie du développement et pour étudier les mécanismes génétiques régulateurs sous-jacents.Ici, nous vous présentons des techniques permettant de visualiser les cellules de la rétine en développement, depuis un stade pluripotent jusqu'à un état différencié terminal. Je vais vous montrer comment disséquer des larves ou des rétines. Je démontrerai les dissections sur des rétines au stade milieu de la pupille, car les noyaux des photorécepteurs se trouve

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Préparation de développement et de l&#39;adulte Drosophile Cerveaux et la rétine d&#39;imagerie en temps réel

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Simple Drosophile Dissection ommatidie et imagerie

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Préparation des adultes Drosophile Yeux pour la coupe mince et analyse microscopique

L&#39;immunohistochimie drosophile Abdomen Nymphe

Cette vidéo décrit comment disséquer et isoler le complexe œil-cerveau des pupes de drosophile. Le protocole présenté démontre la procédure permettant d’obtenir des tissus de haute qualité, compatibles, par exemple, avec l’immunomarquage, ainsi qu’avec d’autres expériences d’expression génique.

Dissection du complexe œil-cerveau à partir de pupes de mouches : une méthode pour isoler le tissu rétinien

L’immunomarquage est une technique efficace pour visualiser des types de cellules et des protéines spécifiques dans les tissus. En utilisant la sonication, le protocole décrit ici réduit la nécessité de disséquer les tissus de Drosophila melanogaster des embryons et des larves à un stade avancé avant l’immunomarquage. Nous fournissons une méthodologie efficace pour l’immunomarquage des larves de montures entières fixées au formaldéhyde.

Sonication facilitée immunofluorescence de phase tardive embryonnaire et larvaire<em&gt; Drosophila</em&gt; tissus<em&gt; In Situ</em

Les structures adultes de la drosophile sont dérivées de structures en forme de sac appelées disques imaginaux. L’analyse de ces disques donne un aperçu de nombreux processus de développement, notamment la détermination des tissus, l’établissement des limites des compartiments, la prolifération cellulaire, la spécification du destin cellulaire et la polarité cellulaire planaire. Ce protocole est utilisé pour préparer des disques imaginaux pour la microscopie optique/fluorescente.

Dissection et Immunocoloration Imaginal disques de Drosophila melanogaster

L’objectif de cette technique est de permettre aux chercheurs d’effectuer la dissection, l’immunocoloration et le montage de disques oculaires nymphaux de Drosophila melanogaster de tout âge.

Dissection et de montage de<em&gt; Drosophila</em&gt; pupes disques yeux

Ce protocole décrit la dissection et immunostaining des adultes Drosophila melanogaster tissus du cerveau. Plus précisément, ce protocole met en évidence l’utilisation de Drosophila champignon corps et photorécepteur neurones comme des sous-ensembles neuronale exemple qui peuvent être utilisés avec précision afin de découvrir les principes généraux de nombreux aspects du développement neuronal.

Dissection et immunofluorescence souillant de champignon corps et photorécepteur de neurones dans le cerveau adulte Drosophila melanogaster

Cet article présente une méthode chirurgicale dissection Drosophila pupes rétines ainsi que de protocoles pour le traitement du tissu pour l’immunohistochimie, l’Ouest analyse et extraction de l’ARN.

Dissection de la rétine de pupes de drosophile pour immunohistochimie, analyse occidentale et isolement d’ARN

Ce protocole décrit trois étapes pour préparer les lobes optiques de la drosophile larvaire et adulte à l’imagerie : 1) dissections cérébrales, 2) immunohistochimie et 3) montage. L’accent est mis sur l’étape 3, car des orientations de montage distinctes sont nécessaires pour visualiser des structures spécifiques du lobe optique.

Dissection, immunohistochimie et montage de cerveaux de drosophiles larvaires et adultes pour la visualisation du lobe optique

Découvrez la dissection et l'immunohistochimie de rétines de Drosophila aux stades larvaire, nymphal et adulte. Cette méthode permet de visualiser l'expression protéique et d'étudier la différenciation des photorécepteurs au niveau cellulaire.

Dissection et immunohistochimique de larve, de nymphe et adulte

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