Name: Les nanoparticules virales pour In vivo Imagerie des tumeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Découvrez le ciblage tumoral in vivo et la biodistribution de nanoparticules virales fluorescentes dans un modèle de xénogreffe murin. Cette méthode permet d'évaluer le potentiel thérapeutique en oncologie.

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Ce travail a été soutenu par le NIH / NIBIB subventions R00 EB009105 (pour NFS) et P30 EB011317 (pour NFS), un NIH / NIBIB bourse de formation T32 EB007509 (à AMW), un Case Western Reserve University interdisciplinaire Alliance Investment Grant (pour NFS), et un cas Comprehensive Cancer Center de subvention P30 CA043703 (pour NFS). Nous remercions les chercheurs de laboratoire Steinmetz étudiants de premier cycle pour leur soutien pratique: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D&#39;Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Alors, et Paul Chariou .

1. VNP (CPMV, BMV, PVX et TMV) Propagation <ol><li> Réglez la chambre de contrôle plante d&#39;intérieur à 15 h du jour (100% de la lumière, 25 ° C, 65% d&#39;humidité) et 9 h de nuit (lumière 0%, 22 ° C, 60% d&#39;humidité). </li><li> Inoculer plantes en fonction de l&#39;échéancier dans le tableau 1. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX, TMV, et BMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> Jour 0: Usine 3 niébé graines / pot. </td><td> Jour 0: Usine ~ 30 N. benthamiana graines / pot. Fertiliser une fois par semaine avec 1 cuillère à soupe d&#39;engrais / 5 L d&#39;eau. </td></tr><tr><td> Jour 14: Re-pot N. benthamiana à 1 plant / pot. </td></tr><tr><td> Jour 10: infecter les feuilles feuilles primaires avec CPMV (5 μg/50 pl / feuille) par inoculation mécanique à l&#39;aide d&#39;une fine couche de carborundum. </td><td> Jour 28: Infect trois à five laisse avec PVX, TMV, ou BMV (5 μg/50 pl / feuille) par inoculation mécanique à l&#39;aide d&#39;une fine couche de carborundum. </td></tr><tr><td> Feuilles de récolte et de stocker à -80 ° C: Jour 20 </td><td> Feuilles de récolte et de stocker à -80 ° C: Jour 42 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Calendrier de plus en plus, l&#39;infection et la récolte des feuilles. Remarque: seule la propagation CPMV est démontrée à titre d&#39;exemple. 2. VNP (CPMV, BMV, PVX et TMV) Purification Remarque: Toutes les étapes sont effectuées sur de la glace ou à 4 ° C. <ol><li> Homogénéiser 100 g de feuilles congelées dans un mélangeur standard à l&#39;aide de 2 volumes de tampon froid (voir le tableau 2). Filtrer à travers 2-3 couches de gaze. </li><li> Pour PVX, ajuster le pH à 6,5 avec 1 M HCl. Ajouter 0,2% (p / v) d&#39;acide ascorbique et 0,2% de sodium (p / v) sulfite. </li><li> Centrifuger homogénat de plante brute à 5500 xg pendant 20 min. Recueillir le surnageant. </li><li> Pour BMV, couche 25 ml de surnageant au-dessus de 5 ml de 10% (p / v) une solution de saccharose. Centrifugeuse à 9.000 g pendant pastilles h et remettre en suspension dans une solution de CsCl 3 38,5% (p / v). Mélanger en agitant pendant 5 heures, puis passez à l&#39;étape 2.12. </li><li> Extraire la matière végétale par ajout de 0,7 volumes de 1:1 (v / v) chloroforme :1-butanol. Incorporer le mélange pendant 30-60 min. </li><li> Centrifuger à 5500 xg solution pendant 20 min. Recueillir la phase aqueuse supérieure. </li><li> Ajouter du NaCl à 0,2 M et 8% (p / v) de PEG (PM 8.000). Pour TMV, ajouter 1% (v / v) de Triton X-100. Agiter pendant au moins 1 heure, puis laisser reposer au moins 1 heure. </li><li> Centrifuger la solution à 15.000 xg pendant 15 min. Resuspendre le culot dans 10 ml de tampon. Pour PVX, ajouter 0,1% β-mercaptoéthanol et de l&#39;urée à 0,5 M. </li><li> Centrifuger à 8000 xg pendant 30 minutes et recueillir le surnageant. </li><li> Ultracentrifugeuse surnageant à 160.000 xg pendant 3 heures. Resuspendre le culot dans 5 ml de tampon overnight. </li><li> Préparer un gradient de saccharose 10-40% en utilisant des volumes égaux de 10%, 20%, 30% et 40% de saccharose dans le tampon (plus lourd en premier). Laissez le gradient de s&#39;équilibrer pendant la nuit à température ambiante. </li><li> Ultracentrifugeuse culot remis en suspension sur gradient de saccharose à 100.000 xg pendant 2 h (24 h pour le BMV). </li><li> Recueillir bande diffusion de la lumière et de dialyser contre du tampon. </li><li> Caractériser les VNPs (ci-dessous) et conserver à 4 ° C. Pour stockage à long terme, stocker à -80 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV et TMV </td><td> 0,1 M de tampon phosphate de potassium (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM de K 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0,5 M tampon borate (pH 7,8) 0,5 M d&#39;acide borique Ajuster le pH avec NaOH </td></tr><tr><td> BMV </td><td> SAMA tampon (pH 4,5) 250 mM d&#39;acétate de sodium MgCl2 10 mM 2 mM de β-mercaptoéthanol (ajouter frais) </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Tampons et leurs recettes pour chaque VNP. Remarque: seule la propagation CPMV est démontrée à titre d&#39;exemple. 3. VNP (CPMV, BMV, PVX et TMV) Caractérisation <ol><li> Effectuer la spectroscopie UV / visible de déterminer la concentration de VNPs. <ol><li> Mesurer l&#39;absorbance de 2 ul d&#39;échantillon à l&#39;aide d&#39;un spectrophotomètre NanoDrop. </li><li> Déterminer la concentration de particules et de colorants à l&#39;aide de la loi de Beer-Lambert (A = εcl, où A est l&#39;absorbance, ε est le coefficient d&#39;extinction, c est la concentration, et l est la longueur du trajet). La longueur du trajet est de 0,1 cm pour le NanoDrop. Les coefficients d&#39;extinction VNP-spécifiques sont les suivants: CPMV: 8,1 cm -1 mg -1 ml (à 260 nm) PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (à 260 nm) TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (à 260 nm) BMV: 5,15 cm -1 mg -1 ml (à 260 nm) </li></ol></li><li> Analyser des particules par chromatographie d&#39;exclusion stérique des protéines liquide rapide (FPLC). <ol><li> L&#39;utilisation d&#39;un Superose 6 exclusion de taille de colonne et l&#39;explorateur ÄKTA, charge de 50 à 100 mg de VNPs dans 200 ul de 0,1 M de tampon phosphate de potassium (pH 7,0). </li><li> Définir détecteurs à 260 nm (acide nucléique), 280 nm (protéines) et la longueur d&#39;onde d&#39;excitation de tous les colorants fixés. </li><li> Fonctionner à un débit de 0,5 ml / min pendant 72 min. </li><li> Le profil d&#39;élution et A260: A280 nm indique si la préparation VNP est pur et si les particules sont intacts et assemblé. L&#39;A260 suivante: 280 ratios indiquent une préparation VNP pur: CPMV: 1,8 ± 0,1 PVX: 1,2 ± 0,1 TMV:1,1 ± 0,1 BMV: 1,7 ± ​​0,1 </li></ol></li><li> Effectuer dénaturant (préfabriqué NuPAGE) Bis-Tris Polyacrylamide électrophorèse sur gel en gradient 4-12% d&#39;analyser la pureté de la préparation et de la conjugaison de protéines d&#39;enveloppe individuels. <ol><li> Ajouter 3 ml de tampon d&#39;échantillon LDS 4x à 10 ug de particules dans 9 pi de tampon phosphate de potassium. Ajouter un supplément de 1 ul de tampon d&#39;échantillon LDS 4x et 3 pl de β-mercaptoéthanol à BMV pour réduire le nombre élevé de liaisons disulfures. </li><li> Incuber dans un bloc chauffant pendant 5 min à 100 ° C. </li><li> Charger les échantillons sur un gel SDS. </li><li> Exécuter des échantillons à 200 V pendant 1 heure dans du tampon MOPS 1x. </li><li> Documenter le gel sous lumière UV pour visualiser les protéines fluorescentes manteau. </li><li> En cas de non-protéine fluorescente, coloration au bleu de Coomassie (0,25% (p / v) de bleu de Coomassie R-250, l&#39;acide 30% (v / v) de méthanol, 10% (v / v) acétique) pendant 1 heure. </li><li> Décolorer avec du méthanol 30%, 10% d&#39;acide acétique pendant une nuit. Change de la solution si nécessaire. </li><li> Documenter le gel sous lumière blanche. </li></ol></li><li> Analyser l&#39;intégrité des particules par microscopie électronique à transmission (MET). <ol><li> Diluer les échantillons à 0,1-1 mg / ml dans 20 pl d&#39;eau DI. </li><li> Placez gouttes de 20 ul des échantillons sur Parafilm. </li><li> Couvrir gouttes avec une grille de MET et laisser reposer pendant 2 min. Évacuent l&#39;excès de solution sur la grille d&#39;un papier filtre. </li><li> Laver la grille en plaçant sur une goutte d&#39;eau DI, puis mèche sèche. </li><li> Tache grille en plaçant une goutte de 20 pl de 2% (p / v) de l&#39;acétate d&#39;uranyle pendant 2 min. Évacuent l&#39;excès tache avec un papier filtre. </li><li> Laver la grille une fois de plus dans l&#39;eau. </li><li> Observez la grille sous un microscope électronique à transmission. </li></ol></li></ol> 4. Conjugaison chimique de VNPs avec le PEG et fluorophores, de purification et de caractérisation <ol><li> Pour les calculs pour les réactions ci-dessous, la masse molaire des VNPs sont: CPMV: 5.6x 10 6 g / mol PVX: 35 x 10 6 g / mol TMV: 41 x 10 6 g / mol BMV: 4,6 x 10 6 g / mol </li><li> Conjuguer les colorants et les lysines PEG à la surface de CPMV et PVX en utilisant une seule étape de N-hydroxy succinimide réaction de couplage: Ajouter 2.500 équivalents molaires (tous les excès molaires se référer à un excès molaire par VNP) de Alexa Fluor 647 ester de succinimidyle et 4.500 équivalents de NHS- PEG (MW 5.000) dissous dans du DMSO à CPMV dans 0,1 M de tampon phosphate de potassium. Lorsque vous travaillez avec le PVX, ajouter un excès molaire de 10.000 NHS-colorant et NHS-PEG. Régler les volumes de tampon et le DMSO tels que la concentration finale de CPMV et PVX est de 2 mg / ml et la teneur en DMSO est 10% du volume réactionnel total. Incuber le mélange réactionnel pendant une nuit à température ambiante à l&#39;abri de la lumière. CPMV et PVX ont 300 et 1270 lysines adressables, respectivement. (Le lecteur est renvoyé aux références suivantes pour en savoir plus surmodification chimique de CPMV et PVX: 13-15). </li><li> Des colorants et des conjugués de PEG à tyrosines du TMV par couplage de diazonium suivi par le cuivre (I)-catalysée azide-alcyne cycloaddition. <ol><li> Préparer sel de diazonium (alcyne) en mélangeant 400 ul de 0,3 M monohydrate d&#39;acide p-toluène, 25 ul de nitrite de sodium 3,0 M et 75 ul de 0,68 M distillée 3-éthynylaniline dissous dans l&#39;acétonitrile à 4 ° C pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 3,3 ml de tampon borate, pH 8,8, contenant 100 mM de NaCl à 1,25 ml de TMV (20 mg / ml de solution mère). </li><li> Réagir à l&#39;TMV 450 ul du sel (alcyne) solution de diazonium dans un bain de glace pendant 3 heures pour ajouter une ligature alcyne poignée de TMV par couplage de diazonium. La solution va se transformer en une couleur brun clair. TMV a 2140 tyrosines disponibles pour la conjugaison. </li><li> Purifier le produit final en utilisant un coussin de sucrose comme décrit à l&#39;étape 4.4. </li><li> Fixez azide fonctionnelle Alexa Fluor 647 et PEG-azide (MW 5000) using de cuivre (I)-catalysée azide-alcyne cycloaddition (CuAAC). Ajouter 2 équivalents d&#39;un colorant et de PEG-protéine d&#39;enveloppe par l&#39;azide et l&#39;incuber avec 1 mM de CuSO 4, 2 mM AMG, et 2 mM de l&#39;ascorbate de sodium à température ambiante pendant 15 min. Régler le volume tampon de telle sorte que la concentration finale de réaction est de TMV 2 mg / ml. (Le lecteur est renvoyé aux références suivantes pour en savoir plus sur la modification chimique des TMV: 16,17). </li></ol></li><li> Conjuguer colorants à lysines et de PEG à cystéines de la cystéine BMV mutant (cBMV): <ol><li> Ajouter 2.000 équivalents molaires de l&#39;Oregon Green 488 succinimidylester dissous dans du DMSO à cBMV dans 0,1 M de tampon TNKM (50 mM Tris base, 50 mM de NaCl, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, pH 7,4). Régler les volumes de tampon et le DMSO tels que la concentration finale de BMV est de 1 mg / ml et la teneur en DMSO est 10% du volume réactionnel total. Incuber le mélange réactionnel pendant une nuit à 4 ° C à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Purifier les particules à l&#39;aide centrifiltres fugue comme décrit à l&#39;étape 4.4. </li><li> Ajouter un excès molaire de 2.000 PEG-maléimide (MW 2.000) en utilisant les mêmes conditions de réaction que précédemment et incuber le mélange réactionnel pendant 2 heures à 4 ° C. cBMV dispose de 180 lysines réactifs et cystéines. (Le lecteur est renvoyé aux références suivantes pour en savoir plus sur la modification chimique de BMV: 18). </li></ol></li><li> Purification: Faire passer la solution à travers un coussin de saccharose à 40% (p / v) à 160.000 xg pendant 2,5 heures. Re-dissoudre le culot dans un tampon. Alternativement, on dialyse contre un tampon approprié en utilisant 10 filtres kDa de spin cut-off. </li><li> Caractérisation: VNPs PEGylées et marquée par fluorescence sont analysées en utilisant les méthodes décrites ci-dessus: UV / visible spectroscopie, électrophorèse sur gel SDS, FPLC, et TEM (non montré, cependant, se référer aux figures 6 et 7). </li></ol> 5. Le ciblage de la tumeur et d&#39;imagerie en utilisant un modèle de xénogreffe de souris<ol><li> Culture HT-29 des cellules humaines de cancer du côlon dans le milieu RPMI supplémenté avec 5% de FBS, 1% de pénicilline-streptomycine et 1% de L-glutamine à 37 ° C dans 5% de CO 2 en utilisant 175 cm 2 flacons de culture cellulaire. </li><li> Laver les cellules deux fois avec du PBS stérile et la récolte par incubation avec 5 ml de trypsine-EDTA à 37 ° C pendant 5 min. Inactiver la trypsine avec 5 ml de milieu RPMI. Recueillir les cellules par centrifugation à 500 xg pendant 5 min. à 4 ° C et remettre en suspension dans RPMI frais à 5x10 6 cellules/50 ul de milieu (déterminer le nombre total de cellules en utilisant du bleu trypan et un hémocytomètre). Mélanger avec un volume égal de matrigel avant l&#39;injection (garder toutes les solutions et les réactifs stériles). </li><li> Achat des vieilles de six semaines NCR souris nu / nu et les maintenir à un régime de luzerne gratuit pendant 2 semaines. [Note:. Toutes les procédures sur les animaux doit être approuvé IACUC] Provoquer des xénogreffes de tumeurs par injection sous-cutanée de 5x10 6 cellules/100 ul / tumeur dans les flancs (2 tumeurs / souris) à l&#39;aide d&#39;une jauge de 18 1/2 stérileaiguille. Surveiller régulièrement les animaux. Mesurer la taille de la tumeur à l&#39;aide des étriers et de permettre aux tumeurs de se développer à un volume moyen de 20 mm 3 (dans les 12 prochains jours). Attribuer des souris à deux groupes différents au hasard: PBS et VNP (n = 3 animaux / groupe / l&#39;heure du point). En utilisant un 1 ml 28 seringue à insuline de calibre, administrer par injection intraveineuse dans la veine caudale 100 pi de PBS stérile ou 10 mg / kg de formulation VNP. </li></ol> Remarque: les expériences de culture de tissus et d&#39;études avec des animaux vivants ne sera pas démontrée. Démonstration pratique sera limitée au traitement des tissus et d&#39;acquisition de données. Pour une référence sur le HT-29 modèle de xénogreffe de tumeur, le lecteur est renvoyé à la réf 19. Trois techniques sont utilisées pour évaluer la tumeur ralliement de VNPs: <ol start="4"><li> L&#39;imagerie par fluorescence à l&#39;aide du système d&#39;imagerie Maestro: Sacrifice souris à différents moments (2, 24, et 72 h) en utilisant le CO 2gaz. Disséquer les animaux et accises tous les principaux organes (cerveau, cœur, poumons, la rate, les reins et le foie) ainsi que les tumeurs sur les flancs, placer les tissus sur du parafilm, et analyser avec l&#39;instrument d&#39;imagerie de fluorescence par excitation jaune et filtres d&#39;émission (800 ms exposition) pour détecter la présence de signaux de fluorescence dans des tissus provenant de A647 (marqueur conjugué à la VNPs). Enregistrez les images et d&#39;analyser les intensités de fluorescence à l&#39;aide du logiciel ImageJ 1.44o ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a> ). Comparez le motif de l&#39;absorption des VNPs dans les tumeurs avec d&#39;autres tissus importants avec le temps. </li><li> Après l&#39;imagerie, couper chaque tissu en deux et incorporez la moitié dans du composé OCT pour l&#39;analyse cryo-coupes et confocale. Recueillir l&#39;autre moitié en pré-pesés cryo-flacons et geler immédiatement les utiliser N 2 liquide. Conserver à -80 ° C jusqu&#39;au moment de transformation. </li><li> Quantification de fluorescence: Recordon tissus poids. Décongeler les tissus congelés à la température ambiante et les placer dans différents tubes Falcon de 50 ml contenant 1 ml de PBS. En utilisant un homogénéisateur de tissus de poche, d&#39;homogénéiser les tissus pour 2-3 min dans du PBS puis transférer le broyat de microtubes. Centrifuger les homogénats pendant 10 min à 13000 xg pour éliminer les tissus non homogénéisé. </li><li> Pipeter 100 ul du surnageant à partir des tissus de chaque groupe (formulations PBS et VNP / points dans le temps) dans une plaque de 384 puits noir UV. Évaluer l&#39;intensité de fluorescence (Ex / Em longueurs d&#39;onde 600/665) en utilisant un lecteur de plaque. Normaliser les valeurs obtenues par les poids fluorescentes tissus. </li><li> Immunohistochimie: cryo-microtome Préparer sections (10 mm) et conserver à -20 ° C. Colorer les coupes de tissus pour les noyaux cellulaires (DAPI) et le marqueur des cellules endothéliales (marqué au FITC anti-souris CD31 anticorps). Effectuer des analyses de microscopie confocale pour cartographier la localisation vasculaire et intra-tumorale marquée par fluorescence de VNPs. </li></ol> Remarque: Cette procédure ne sera pas démontrée, les données représentatives sont présentés dans la figure 8. Pour une référence sur l&#39;immunohistochimie et les méthodes de coloration décrites, le lecteur est renvoyé à la réf 19.

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<li>Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+tobacco+mosaic+virus+with+%22click%22+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry.</a> Chembiochem. 9, 519-523 (2008).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+of+the+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce protocole fournit une approche pour la modification chimique de VNPs et leurs applications pour l&#39;imagerie in vivo de tumeurs. Les techniques d&#39;imagerie de fluorescence des animaux, la quantification de fluorescence, et l&#39;immunohistochimie présentés ici sont utiles pour étudier la biodistribution et l&#39;évaluation de la tumeur de ralliement. Ces techniques fournissent des informations précieuses concernant l&#39;accès des nanoparticules dans la tumeur via l&#39;effet EPR. En combinant ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fort&gt;Production de VNP&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Chambre pour plantes en intérieur</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; graines (California black-eye no 5)</td><td>Burpee</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; graines</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Les graines de N. benthamiana ont été un don de l'Institut Salk. Les graines sont produites par propagation végétative.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Carborundum</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Terreau Pro-mix BX</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fort&gt;Équipement&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>rotor 50.2 Ti</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>rotor SW 32 Ti</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K ultracentrifugeuse</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>rotor SLA-3000</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>rotor SS-34</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Sorvall RC-6 Plus</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Bouteille en polypropylène</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>Pour rotor SLA-3000</td></tr><tr><td>Bouteille en polycarbonate</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Pour rotor SS-34</td></tr><tr><td>Tube ultra-transparent</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Pour gradient de saccharose et rotor SW 32 Ti</td></tr><tr><td>Bouteille en polycarbonate</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>Pour la centrifugation et le rotor 50.2 Ti</td></tr><tr><td>spectrophotomètre NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>Système de gel préfabriqué PowerEase 500</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Colonne de séparation par taille Superose 6 10/300 GL (24 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;KTA Explorer 100 Chromatographe</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>Centrifugeuse de table</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; système d'imagerie</td></tr><tr><td>Tissue-Tearor</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>Microscope électronique à transmission</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>microscope confocal à balayage laser FluoView</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fort&gt;Produits chimiques et réactifs&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-éthynylaniline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plaque noire 384 puits</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>Gel SDS-PAGE NuPAGE Bis-Tris 4-12 %</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOÎTE</td><td></td></tr><tr><td>Tampon d'échantillonnage LDS 4X</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>azide Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>acide carboxylique Alexa Fluor 647, ester succinimidyle</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Filtres centrifuges Amicon Ultra-0,5 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>coupure à 10 kDa</td></tr><tr><td>Aminoguanidine chlorhydrate</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Papier filtre</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>Qualité P5</td></tr><tr><td>FITC anti-souris CD31</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de chèvre</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>sel de sodium de l'acide L-ascorbique</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Lames à microscope</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Couvercle de lame de microscope</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>tampon MOPS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocs</td><td>PG1-ML-2k</td><td>MW 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>Nanocs</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>PM 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>Nanocs</td><td>PG1-SC-5k</td><td>PM 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 succinimidylester *isomère 6*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>acide p-toluènesulfonique monohydraté</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate dibasique de potassium</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate monobasique de potassium</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>acétate de sodium</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Nitrite de sodium</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>Sulfite de sodium</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>grille de MET</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>base de Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;éthanol</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fort&gt;Culture de tissus&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>sérum de veau fœtal</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>Cellules HT-29</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Flacons de culture cellulaire</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Bleu de trypan</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,05 % (1X) avec EDTA 4Na, liquide</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;fort&gt;Études sur les animaux&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Régime alimentaire pour rongeurs contenant 18 % de protéines</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>Régime sans luzerne</td></tr><tr><td>Seringue à insuline</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>aiguille de calibre 28</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>Matrice Matrigel de membrane basale</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>Souris NCR nu/nu</td><td></td><td></td><td>École CWRU&lt;br/&gt; du Centre de médecine sur animaux athymiques et de xénogreffes</td></tr><tr><td>Seringue stérile</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18 1/2 gauge</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

les nanoparticules virales pour<em&gt; in vivo</em&gt; imagerie des tumeurs

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

L&#39;utilisation des nanomatériaux a le potentiel de révolutionner la science des matériaux et de la médecine. À l&#39;heure actuelle, un certain nombre de différentes nanoparticules sont étudiés pour des applications en imagerie et la thérapie. Nanoparticules virales (VNPs) dérivés de plantes peut être considérée comme auto-assemblées bionanomatériaux avec les tailles et formes définies. Les virus des plantes à l&#39;étude dans le laboratoire Steinmetz comprendre des particules icosaédriques formés par virus de la mosaïque du niébé (CPMV) et virus de la mosaïque de Brome (BMV), qui sont tous deux à 30 nm de diamètre. Nous développons également des structures en forme de tige et filamenteux provenant des virus végétaux suivants: virus de la mosaïque du tabac (TMV), qui forme des tiges rigides avec des dimensions de 300 nm 18 nm par le virus de la pomme de terre, et X (PVX), qui forment des particules filamenteuses 515 nm de longueur et de 13 nm de largeur (le lecteur est renvoyé aux refs. 1 et 2 pour de plus amples informations sur VNPs). <p class="jove_content"&gt; Du point un scientifique des matériaux de vue, VNPs sont des éléments attractifs pour plusieurs raisons: les particules sont monodisperses, peut être produit avec facilité sur une grande échelle dans la plante, sont exceptionnellement stable et biocompatible. En outre, VNPs sont «programmables» des unités, qui peuvent être spécialement conçus en utilisant des méthodes de modification génétique ou bioconjugaison chimiques 3. La structure de VNPs est connu pour une résolution atomique, et des modifications peuvent être effectuées avec une précision spatiale à l&#39;échelle atomique 4, un niveau de contrôle qui ne peut pas être réalisé en utilisant des nanomatériaux synthétiques actuels avec state-of-the-art technologies. Dans cet article, nous décrivons la propagation de CPMV, PVX, TMV, et BMV en Vigna ungiuculata et Nicotiana benthamiana. Protocoles d&#39;extraction et de purification pour chaque VNP sont donnés. Méthodes de caractérisation des purifiées et chimiquement VNPs marqués sont décrits. Dans cette étude, nous nous concentrons sur chétiquetage des emical VNPs avec fluorophores (par exemple Alexa Fluor 647) et de polyéthylène glycol (PEG). Les colorants de faciliter le suivi et la détection des VNPs 5-10, et PEG réduit immunogénicité des nanoparticules protéiques tout en améliorant leurs propriétés pharmacocinétiques 8,11. Nous démontrons tumeur ralliement de VNPs PEGylées aide d&#39;un modèle de xénogreffe de tumeur de souris. Une combinaison de l&#39;imagerie de fluorescence des tissus ex vivo avec une carte Maestro du système d&#39;imagerie, la quantification de fluorescence dans les tissus homogénéisés et la microscopie confocale est utilisée pour étudier la biodistribution. VNPs sont effacées par le système réticulo-endothélial (RES); tumeur homing est atteint passive par une perméabilité accrue et de rétention (EPR) Effet 12. La nanotechnologie VNP est un puissant plug-and-play à l&#39;image de la technologie et de traiter les sites de la maladie in vivo. Nous développons davantage VNPs d&#39;effectuer des cargaisons de drogue et des fragments d&#39;imagerie clinique pertinents, ainsi que des ligands spécifiques d&#39;un tissu àcibler des récepteurs moléculaires surexprimés dans le cancer et les maladies cardiovasculaires.

<img alt="Analyse comparative de la croissance des plantes ; installation expérimentale, étude de la variation de la couleur des feuilles, méthode de chlorose." src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 Figure 1. Plantes infectées par un virus végétal. Plantes de Vigna unguiculata infectées par le CPMV (A). Plantes de Nicotiana benthamiana infectées par le PVX (B), le TMV (C) et le BMV (D)....

Nanoparticules virales végétales (VNPs) sont prometteurs plates-formes pour des applications dans le domaine biomédical. Ici, nous décrivons les procédures pour les installations VNP propagation, la purification, la caractérisation et la bioconjugaison. Enfin, nous montrons l&#39;application de VNPs prise d&#39;origine tumorale et d&#39;imagerie en utilisant un modèle de xénogreffe de souris et l&#39;imagerie de fluorescence.

Les nanoparticules virales pour<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie des tumeurs

L'utilisation de nanomatériaux a le potentiel de révolutionner la science des matériaux et la médecine. Actuellement, un certain nombre de nanoparticules différentes sont en cours de...

L'objectif général de cette procédure est d'étudier in vivo le ciblage tumoral et la biodistribution de nanoparticules virales marquées par fluorescence. Dans des modèles de tumeur chez la souris, commencez par propager et purifier le virus, puis conjuguez les colorants et le PEG aux particules. Après avoir caractérisé les particules fonctionnalisées, procédez à leur injection chez des souris porteuses de xénogreffes tumorales.Les résultats issus de l'imagerie maestro, de la mesure de l'intensité de fluorescence, de l'homogénéité tissulaire et de l'immunofluorescence montrent la localisation des nanoparticules virales dans la tumeur et divers organes à travers le corps. Plateforme. Les nanoparticules ou les BMP constituent des plateformes prometteuses pour des applications en biomédecine. Nous décrivons ici les protocoles pour le VMP de PLA, la propagation, la purification, la caractérisation et la conjuguaison intestinale.Enfin, nous montrons l'application des Vmps pour le ciblage tumoral et l'imagerie, en utilisant un modèle de greffe malino et l'imagerie par fluorescence. Actuellement, un certain nombre de nanoparticules différentes sont en cours d'évaluation pour des applications en imagerie et en thérapie. Les principaux avantages de l'utilisation de nanoparticules d'origine biologique par rapport à des matériaux synthétiques tels que les métaux ou les nanomatériaux polymériques sont que les BMP provenant de plantes sont monodispersées et que leurs structures sont connues avec une résolution atomique.Les virus végétaux peuvent être produits à grande échelle par agriculture moléculaire et sont susceptibles d'être modifiés à la fois par ingénierie génétique et chimique. Dans cette démonstration, nous montrons la modification chimique de nanoparticules virales à l'aide de Fluor fours et de PEG. Les Fluor fours seront utilisés pour améliorer l'imagerie, tandis que le PEG servira à améliorer la pharmacocinétique.Les modifications chimiques peuvent être étendues afin de charger des nanoparticules virales avec des thérapies et des agents de contraste pour l'imagerie clinique, comme l'IRM. Ici, nous avons démontré l'étude de la biodistribution de nanoparticules virales modifiées, de manière similaire à d'autres nanoparticules. L'accumulation tumorale des NPSV repose sur la perméabilité et la rétention accrues, phénomène décrit comme un ciblage passif des tumeurs.Nous avons récemment découvert que les profils de biodistribution de différents virus végétaux sont distincts. Pour cette démonstration, nous utiliserons le virus de la mosaïque du tabac, considéré comme la référence en matière de technologie virale des nanomatériaux. Nous nous intéressons particulièrement à la conception, à l'ingénierie et à l'étude des nanomatériaux dérivés de virus végétaux.Notre laboratoire cherche à comprendre fondamentalement comment le virus de la mosaïque du haricot Ed, le virus de la mosaïque en bâtonnet, le virus de la mosaïque en forme de roche et le virus X de la pomme de terre filamenteux interagissent avec le système mammalien. Plus précisément, nous souhaitons étudier comment la forme et la flexibilité influencent les propriétés des EVO et comment les adapter au mieux pour des applications telles que l'imagerie ciblant des tissus spécifiques ou la délivrance de médicaments. Ce manuscrit décrit la préparation du virus de la mosaïque kalp, du virus X de la pomme de terre, du virus de la mosaïque brune et du virus de la mosaïque du tabac.À partir de Vic, Gil et Nicotiana, nous décrivons leur fonctionnalisation et leur application dans un modèle murin préclinique. Dans cette démonstration, nous utiliserons le virus de la mosaïque du tabac dans une chambre d'incubation intérieure. Plantez trois graines de virus de la mosaïque du tabac par pot.Au jour 10, infecter chaque feuille avec 0,1 microgramme par microlitre de CPMV par inoculation mécanique en utilisant une légère saupoudrage de carum suivi d'un léger frottement des feuilles. Après 10 jours, récolter les feuilles et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Dans un mixeur standard, homogénéiser 100 grammes de feuilles congelées dans deux volumes de tampon froid de phosphate de potassium 0,1 molaire, pH 7, filtrer l'homogénat à travers trois couches de gaze et centrifuger à 5 500 ×g pendant 20 minutes.Recueillir le surnageant, puis effectuer une extraction organique du matériel végétal avec 0,7 volume de chloroforme-butanol à un pour un, en agitant le mélange pendant au moins 30 minutes. Après centrifugation de la solution à 5 500 ×g pendant 20 minutes, récupérer la phase aqueuse supérieure et procéder à une ultracentrifugation.Ajouter 160 000 g pendant trois heures. Ensuite, resuspendre le culot dans cinq millilitres de tampon phosphate et incuber l'échantillon à quatre degrés Celsius toute la nuit. Préparer également un gradient de saccharose de 10 à 40 % en utilisant un volume égal de saccharose à 10, 20, 30 et 40 % dans le tampon.Placer l'élément le plus lourd en premier afin d'équilibrer le gradient pendant toute la nuit à température ambiante. Déposer délicatement la palette RÉSUSPENDUE sur le gradient de saccharose et centrifuger à 100 000 ×g pendant deux heures. Recueillir la bande diffusant la lumière et dialyser contre un tampon afin de conjuguer les colorants et le PEG aux résidus de lysine de surface à raison de 2 500 équivalents molaire de Fluor et de 4 500 équivalents de NHS-PEG par CPMV.Après avoir purifié la réaction, mesurer le spectre d'absorbance de deux microlitres d'échantillon à l'aide du nano drop, en notant les valeurs à 260, 280 et 651 nanomètres. Procéder à l'analyse des particules par taille, exclusion, chromatographie liquide rapide de protéines par exclusion sur colonne super oh six, et l'ACTA Explorer charger 50 à 100 microgrammes de l'échantillon VNP dans 200 microlitres de tampon phosphate de potassium 0,1 molaire.pH 7,0, régler les détecteurs à 260 nanomètres pour les acides nucléiques et à 280 nanomètres pour les protéines. Régler également la longueur d'onde d'absorbance de toutes les colorations attachées. Effectuer la séparation à un débit de 0,5 millilitre par minute pendant 72 minutes.Le profil Ellucian dans le rapport 2 62 80 indique si la réaction est pure et si les VNP sont entièrement assemblées et intactes. Ensuite, préparez une électrophorèse SDS dénaturante pour analyser la conjugaison aux protéines de capside individuelles. Pour chaque échantillon, ajoutez trois microlitres de tampon échantillon quatre XLDS à 10 microgrammes de particules dans neuf microlitres de tampon phosphate de potassium, puis dénaturez au bloc chauffant pendant cinq minutes à 100 degrés Celsius.Chargez les échantillons sur un gel SDS et faites-les migrer à 200 volts pendant une heure. Dans un tampon de migration X mops, documentez le gel sous lumière blanche. Après coloration, ces nanoparticules virales sont désormais prêtes à être utilisées pour le ciblage tumoral et l'imagerie à l'aide d'un modèle murin xénogreffé.Généralement, nous utilisons une injection par voie intraveineuse dans la veine de la queue pour administrer ces particules afin d'évaluer l'homing tumoral des VN ps. Analyser les tissus à l'aide de l'appareil d'imagerie de fluorescence Maestro. Utiliser des filtres d'excitation et d'émission jaunes avec une exposition de 800 millisecondes pour détecter la présence de signaux fluorescents provenant de la marque A 6 47 conjuguée aux VN PS, en vue de la quantification de la fluorescence.Homogénéisez les tissus pendant deux à trois minutes dans du PBS. Ensuite, transférez l'homogénat dans des tubes de centrifugation, pour chaque formulation de PBS et de VNP par point temporel, transférez 100 microlitres d'échantillon Senna dans une plaque UV noire de 384 puits. Mesurez l'intensité de fluorescence en utilisant des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de six et 665 nanomètres.La propagation réussie des VNP peut être déterminée par l'apparition de symptômes en mosaïque sur les feuilles environ une semaine après l'inoculation mécanique. La spectroscopie visible-UV peut être utilisée pour évaluer la pureté des particules. L'absorbance à 260 nanomètres est proportionnelle à la concentration en acides nucléiques et celle à 280 nanomètres est proportionnelle à la concentration en protéines.Ces profils d'élution par exclusion de taille des PS VN ont été obtenus en utilisant une colonne Superos six et un purificateur ACTA. Comme pour les spectres UV-visible, le rapport A deux cent soixante à deux cent quatre-vingts peut être utilisé pour évaluer la pureté des préparations de VNP. En outre, le profil d'élution peut être utilisé pour déterminer la pureté des particules.L'électrophorèse sur gel SDS sépare les sous-unités de la protéine de la capside dénaturées. Les particules de CPMV sont constituées de deux protéines, une grande protéine de 42 kilodaltons et une petite protéine de 24 kilodaltons. Remarque. La protéine plus petite présente deux formes électrophorétiques dans ces images de particules virales au MET.Les réseaux de MET ont été colorés négativement avec de l'acétate d'urane à 2 %, de sorte que les particules apparaissent claires sur un fond sombre. Les particules de CPMV ont une taille de 30 nanomètres. Les V NPS peuvent ensuite être fonctionnalisées par des chimies de bioconjugaison.Par exemple, les CPMV possèdent des lysines qui peuvent réagir avec des esters de NHS fonctionnalisés afin de confirmer la fonctionnalisation lors de la caractérisation des VN ps par les mêmes méthodes que celles utilisées précédemment pour les particules purifiées. Il s'agit de données représentatives de VN ps marqués de manière fluorescente et PEGylés. Les particules fonctionnalisées peuvent ensuite être utilisées dans des applications en aval, telles que l'étude de la biodistribution et du ciblage tumoral à l'aide de VN ps PEGylés et marqués sur cuisse.Ici, la biodistribution du CPMV est évaluée chez des souris nues porteuses de xénogreffes humaines HT 29 ; la biodistribution et le ciblage tumoral sont analysés par imagerie Maestro des tissus. Aucune fluorescence n’a été observée ex vivo dans le contrôle au PBS. En revanche, pour le CPMV conjugué au 6 47 et au PEG, une fluorescence importante était présente dans le foie et, dans une moindre mesure, dans la rate, en raison de l’élimination par le système réticuloendothélial.La fluorescence marquée dans la tumeur indique un ciblage tumoral par l'effet de perméabilité et de rétention améliorées. Ces données quantitatives ont été obtenues par mesure de fluorescence de tissus homogénéisés, normalisée par rapport au poids des tissus. Comme prévu, les données indiquent l'élimination du CPMV par le foie et la rate.Le CPMV est également détecté dans la tumeur. Une localisation intratumorale supplémentaire, réalisée par coloration immunohistochimique de tissus cryosectionnés, montre la localisation intratumorale du CPMV. Le CPMV apparaît en rouge.Le bleu correspond aux noyaux, et le vert représente un vaisseau sanguin marqué avec l'anticorps anti-CD31. Le CPMV a été principalement observé à proximité de la vascularisation de la tumeur. Les techniques décrites ont élargi l'applicabilité à divers systèmes de nanoparticules biologiques.Le laboratoire Stein étudie les particules nanostructurées virales, telles que le virus de la mosaïque des bovins, le virus de la mosaïque du chou, le virus X de la pomme de terre et le virus de la mosaïque du tabac. Toutefois, les méthodologies pourraient être appliquées à toute autre nanoparticule virale ou structure nanostructurée protéique, comme les protéines de choc thermique. Après cette procédure, des méthodes supplémentaires telles que la R-T-P-C-R ou le Western blot peuvent être réalisées comme méthodes indépendantes.La cryodésection et l'immunohistochimie peuvent être utilisées pour obtenir des informations supplémentaires sur la localisation intratumorale des vps et sur une éventuelle colocalisation avec les macrophages associés aux tumeurs ou d'autres organites. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de propager, purifier, fonctionnaliser et caractériser les nanoparticules virales, ainsi que d'étudier leur distribution in vivo à l'aide d'un modèle de souris tumorale.

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