Name: Mesure quantitative de la réponse immunitaire et le sommeil en Drosophila (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Découvrez comment mesurer l'activité locomotrice et la réponse immunitaire chez Drosophila pendant une infection bactérienne. Cette méthode évalue le sommeil, la survie et l'activation de NFκB en temps réel.

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Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation Grant # 1025627 IOS et par le National Institutes of Health en vertu subvention no 1R21NS078582-01 à JAW

Ce protocole utilise deux configurations (Figure 1) pour l&#39;acquisition de quatre affichages différents recueillies des mouches soumises à une infection bactérienne. Ces sorties comprennent: 1) le sommeil / sillage comportement; résultats de survie 2), 3) la charge bactérienne chez la mouche, et 4) la mesure en temps réel de l&#39;activité du rapporteur NFkB in vivo. En combinaison avec les outils génétiques qui sont disponibles chez la drosophile, ces mesures donnent un aperçu mécanistique sur le lien moléculaire entre la fonction immunitaire et le comportement. 1. Activité locomotrice mesure et hôtels de mouches <ol><li> Le montage utilisé pour mesurer l&#39;activité locomotrice et hôtels de mouches, qui comprend le système de surveillance de l&#39;activité chez la drosophile (DAM2, Trikinetics), incubateurs, chambre noire, et la préparation des animaux de laboratoire et les tubes d&#39;activité, a été décrit précédemment 6. La même approche est utilisée ici, avec quelques modifications mineures. <ol class="lalpha"><li&gt; L&#39;éclairage de l&#39;incubateur est commandé par le même incubateur. Par conséquent, il est important de synchroniser le réglage de l&#39;heure entre l&#39;ordinateur et incubateurs. </li><li> Activité tubes sont nettoyés pour une réutilisation en faisant bouillir sur une plaque chauffante dans de l&#39;eau déminéralisée. Une petite quantité de détergent est ajouté pour la première ébullition, les tubes sont bien rincées et cuites deux fois plus. Si le fil est utilisé pour boucher le tube, les tubes d&#39;activité utilisées (contenant de la nourriture, de la cire, des mouches et fils) peuvent être nettoyés sans démontage préalable du fil. </li></ol></li><li> Avant de lancer une expérience, cultures lieu contenant fin nymphe mise en scène des mouches dans des incubateurs pendant trois à quatre jours pour s&#39;adapter à l&#39;éclairage expérimental et d&#39;autres conditions environnementales. Lumière: des conditions sombres ou constante ont été couramment utilisés pour mesurer le comportement du sommeil. Dans cet exemple, les mouches sont acclimatés à lumière constante pour éliminer l&#39;influence de l&#39;horloge circadienne sur la réponse immunitaire et le comportement 2,7,8. Comme il est décrit à la figure 1A </strong&gt;, charge 1-4 jours d&#39;âge mouches dans l&#39;activité Trikinetics DAM2 moniteurs comme décrit 6, et record pour un minimum de trois jours avant l&#39;infection. </li></ol> 2. Infect mouches avec une souche pathogène de bactéries <ol><li> Le protocole décrit ici est spécifique à S. marcescens, qui sont faciles à cultiver et à entretenir. Les protocoles de stockage à long terme et les conditions de culture pour d&#39;autres espèces bactériennes peuvent varier. S. marcescens sont stockés dans le glycérol 15-50% à -80 ° C. Pour préparer stockage à long terme, mélangez 2 volumes de culture bactérienne pendant la nuit (DO 600 = 0,5 - 1,0) à 1 volume de glycérol à 50% autoclave en 1,5 ml microtubes. Cela se traduira par une concentration de glycérol final de 17%. Conserver les tubes à -80 ° C. Pour préparer une courte durée d&#39;utilisation de source de bactéries, gratter le stock congelé avec une pointe de pipette stérile 200 ul et d&#39;effectuer une série de trois cours sur une plaque de gélose LB. Incuber la plaque pendant la nuit à 37 &amp; dpar exemple, C pour obtenir des colonies isolées. Conservez la plaque à 4 ° C. Un jour avant l&#39;infection prévue, choisissez une seule colonie de la plaque de gélose LB avec une pointe de pipette stérile 200 pi et plonger la pointe dans un tube de culture contenant 5 ml de milieu LB. Cultiver des bactéries pendant la nuit, ou jusqu&#39;à 16 heures à l&#39;intérieur d&#39;un agitateur incubateur à 37 ° C et 250 rpm jusqu&#39;à ce qu&#39;il atteigne la phase de croissance exponentielle. Mesurer la concentration d&#39;un spectrophotomètre à une DO 600. La concentration dans cette phase varie de 0,5 à 1. Si la concentration est trop élevée, repiquer les bactéries et croître pendant encore plusieurs heures pour obtenir une concentration optimale. Effectuez la procédure à proximité d&#39;une source de flamme. Certaines souches bactériennes sont conçus pour la résistance aux antibiotiques et sont cultivées et sélectionnées pour antibiotique approprié ajouté au milieu. S. marcescens (ATCC # 8100) ne sont pas résistants aux antibiotiques et sont donc cultivées dans un milieu stérile sans antibiotique. Pour vérifier une technique stérile, faire une maquette culture sans bactéries en tant que témoin. La solution pour infecter les mouches contient des bactéries (diluée à DO600 = 0,1) et de colorant alimentaire 1% (bleu brillant FCF) dans du PBS. Préparer une solution de contrôle d&#39;injection en ajoutant une quantité équivalente de milieu LB utilisé en solution infection et 1% de colorant alimentaire bleu dans du PBS. Conserver les solutions sur la glace. </li><li> Préparer aiguilles de verre pour injecter les mouches. Tirez capillaires en verre (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) pour une pointe fine à l&#39;aide d&#39;un extracteur micropipette (Narishige). Sous une loupe binoculaire, utilisez une pince fine à rompre la pointe de l&#39;aiguille de sorte que l&#39;ouverture est assez grande pour remplir de fluide d&#39;injection en appliquant une aspiration avec une seringue, mais assez petit pour minimiser les dommages à la volée pendant le processus d&#39;injection. Après avoir brisé la pointe, la taille de la pointe devrait être autour de 40-50 um. L&#39;aiguille de verre est fixée à une seringue en plastique 3 cc avec une longueur de tube. L&#39;écoulement du fluide d&#39;injection est commandée manuellement en appliquant une pression positive ou suction avec la seringue. Éviter de contaminer le tube en caoutchouc avec un fluide d&#39;injection, comme le dispositif de seringue est utilisée pour le contrôle de l&#39;infection et les injections. </li><li> Anesthésier les mouches en les plaçant sur ​​un tapis de CO 2. CO 2 est passé à travers un récipient fermé d&#39;eau pour humidifier le tampon et pour réduire l&#39;électricité statique, ce qui peut compliquer la manipulation de vol sur la plaquette. Injecter mouches par piquer l&#39;aiguille de verre dans la région au-dessus du scutellum du thorax dorsal. Le passage du milieu d&#39;injection dans la mouche est vérifiée par le colorant alimentaire - mouches deviennent bleus comme les spreads de colorants alimentaires à travers le système. La dose de bactéries qui reçoivent les mouches peut être quantifiée comme décrit dans la section 3 ci-dessous. Certains modèles expérimentaux comprennent un groupe témoin qui reçoit une blessure par injection aseptique mouches avec du colorant alimentaire PBS et sans bactéries. </li></ol> 3. Déterminer la charge bactérienne Une approche pour evaluating la réponse immunitaire contre l&#39;infection bactérienne est une infection à déterminer la charge bactérienne après. D. melanogaster est un excellent modèle pour déterminer ce paramètre, car la volée entière peut être homogénéisé afin d&#39;estimer le nombre total de bactéries à l&#39;intérieur d&#39;un individu. La raison d&#39;être de ce protocole est que lorsqu&#39;elle est cultivée sur un milieu solide tel que du bouillon de Luria (LB) agar sur une boîte de Pétri (plaque LB), une seule bactérie forme une colonie visible à distinguer. Par conséquent, en homogénéisant les mouches infectées en milieu liquide LB, générer des dilutions en série de l&#39;homogénat, et d&#39;étalement de l&#39;homogénat dilué sur des plaques LB, le nombre de cellules bactériennes qui infectent une volée peut être déterminée. Un groupe de contrôle de vol d&#39;une injection de PBS et de coloration des aliments sans pour autant les bactéries doivent être utilisées pour vérifier que l&#39;infection n&#39;a pas été contaminé par d&#39;autres espèces bactériennes. Il devrait y avoir aucune colonie sur la gélose LB dans cet état. <ol><li> Autoclaver tous les matériaux qui seront utilisés pour cetteprocédure avant d&#39;effectuer l&#39;étape d&#39;homogénéisation réelle. Cette regroupe plus de 200 embouts de pipette ul coupés avec des ciseaux, des médias, LB et pilons utilisés pour l&#39;homogénéisation. Préparer les plaques en versant autoclavé milieu LB / agar dans des boîtes de 10 cm de Petri stériles au moins 1 jour avant l&#39;homogénéisation des mouches. </li><li> Anesthésier et de recueillir les mouches dans 1,5 ml microtubes et tubes de magasins sur la glace. </li><li> Effectuez l&#39;homogénéisation près d&#39;une flamme pour éviter la contamination. Une homogénéisation de contrôle contenant les mouches sans infection est particulièrement recommandé lors de l&#39;utilisation d&#39;une souche bactérienne telles que S. marcescens, qui ne sont pas résistantes aux antibiotiques. Homogénéiser un minimum de 2 groupes de 10 mouches par chaque état expérimental. Le nombre de mouches utilisés par homogénat est déterminée par l&#39;expérimentateur. Certains groupes ont utilisé une mouche par homogénat, ce qui est utile pour évaluer la variation de la charge bactérienne entre les mouches individuelles 8, tandis que d&#39;autres ont utilisé de 3 à 10 mouches par homogénatà comparer entre génotype ou de la condition expérimentale 9-12. <ol class="lalpha"><li> Ajouter 400 ul de milieu LB à chaque microtube contenant les mouches et homogénéiser à l&#39;aide d&#39;un petit moteur et un pilon (Kontes). </li><li> Utiliser des embouts de pipette stériles coupées, serial dilution de 1:10 homogénat en ajoutant 20 ul LB homogénéisé / milieu bactérien à tube de 1,5 ul contenant 180 ul de milieu LB. Couper des pointes de pipette empêche le blocage des débris voler et veille à ce que le volume approprié est en cours de transfert. </li><li> Facteur de dilution est déterminé de manière empirique et dépend du génotype de la mouche, la souche bactérienne utilisée, et les conditions expérimentales. Pour les mouches de type sauvage infectées par S. marcescens, utiliser des dilutions de 1:10 2 1:10 3 ou pour les mouches homogénéisés immédiatement après l&#39;infection, et des dilutions de 1:10 ou 1:10 4 5 pour les mouches homogénéisé 24 h après l&#39;infection. </li><li> Ajouter 100 ul LB / milieu bactérien du microtubes rocentrifuge contenant la dilution finale et la propagation de la moyenne sur une plaque LB utilisant des billes de verre (VWR) pour assurer une distribution uniforme. </li><li> Jeter des boules de verre dans une solution EtOH à 100%. Placez les plaques de LB dans un incubateur à 37 ° C pendant la nuit. </li><li> En option, utilisez un système d&#39;imagerie à la lumière visible pour obtenir une image des plaques LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Compter le nombre de colonies soit sur la plaque elle-même ou de l&#39;image de la plaque en utilisant l&#39;outil de comptage sur logiciel Photoshop (Adobe Photoshop CS3). </li><li> Calculer le nombre d&#39;unités formant colonie par la mouche selon la formule suivante: [n / (N * D * v)] * V, où n = nombre de colonies cultivées sur la plaque LB, N = le nombre de vol mis en commun dans une microtube, D = facteur de dilution et v = volume de solution étalée sur chaque plaque; V = volume initial de l&#39;homogénat. </li></ol></li></ol> 4. Évaluer sommeil et la durée de survie après l&#39;infection <ol><li> Pourmouches qui ne sont pas exploitées pour mesurer la charge bactérienne, continuer à surveiller le comportement pendant 7-10 jours. Durée de survie est influencée par le génotype des mouches, les conditions environnementales et les espèces bactériennes utilisées pour l&#39;infection. </li><li> Après environ 10 jours, résilier l&#39;expérience, télécharger et traiter les données comportementales telles que décrites précédemment 6. Insomniac2 logiciels sur mesure, qui est basé à Matlab, est utilisé pour analyser les paramètres du sommeil. Il est important d&#39;éliminer les mouches mortes de l&#39;analyse comportementale. Normalement, ce qui limite les analyses à l&#39;intérieur du premier jour après l&#39;infection, selon le type d&#39;infection et le génotype mouche. La mort dans l&#39;essai est indiqué par le temps tous les chefs d&#39;activité ont atteint zéro. Pour faciliter l&#39;analyse de la survie, Drosonex, un logiciel personnalisé écrit en Microsoft Visual C + + 6.0, est utilisé pour traiter les fichiers de données brutes du système de DAM Trikinetics. Les rapports de logiciels sous forme de fichiers Excel, la durée de survie de chaque volée (en heures), compile activité datun ensemble de moniteurs dans une feuille de calcul, et signale l&#39;oiseau survivant pour cent dans le temps fixé par l&#39;utilisateur. Les fichiers Excel sont conçus pour s&#39;intégrer dans d&#39;autres logiciels de statistiques pour une analyse ultérieure. </li></ol> 5. Mesure de l&#39;activité NFKB cours de l&#39;infection en utilisant un dosage rapporteur de la luciférase Transgénique KB-luc les mouches utilisées dans ce test ont été générés précédemment comme décrit dans Kuo et al., 2010 2. En bref, le journaliste KB-luc contient 8 répétitions d&#39;une séquence NFkB contraignant qui ont été insérés dans un promoteur en amont d&#39;un cadre de lecture ouvert luciférase. <ol><li> Ajustez les mouches des conditions d&#39;éclairage expérimentales telles que décrites à la section 1.2. Dans cet exemple, 1-4 jours d&#39;âge KB-luc les mouches sont logés dans des flacons contenant une solution de saccharose à 5%, 2% agar milieu alimentaire et mis en lumière constante (LL) pendant 2 jours pour atteindre le même âge que d&#39;autres mouches lors de l&#39;infection. </li><li> Préparer une microplaque de 96 puits pour les mouches. Chaque puits contient 2 couches de milieu alimentaire (Figure 2), la couche supérieure contient luciférine, le substrat de la luciférase. Ajouter 300 ul d&#39;une solution de saccharose à 5%, solution de gélose à 2% dans chaque puits et laisser se solidifier. Ensuite, ajoutez une couche de 50 ul haut à chaque puits contenant du sucrose 5%, 1% de gélose, et 2 mM de luciférine (Gold Biotechnology, Inc). Luciférine concentrations utilisées pour l&#39;activité du rapporteur de mesure chez la drosophile ont varié dans la littérature, et ont été aussi basses que 100 uM 13. La concentration requise peut être déterminée empiriquement. Entre les couches de distribution des aliments, couvrir la plaque avec un chiffon à maille fine pour faciliter le séchage tout en préservant la stérilité. La plaque devrait être autorisé à sécher, jusqu&#39;à une heure, afin d&#39;empêcher les mouches de se coincer dans les gouttelettes de condensation. Parce que luciférine est sensible à la lumière, éviter d&#39;exposer les plaques à la lumière plus que nécessaire. </li><li> Appliquer un film adhésif transparent (Top-Seal-A; Perkin Elmer) pour une plaque de 96 puits de microtitration et perforer à l&#39;aide d&#39;une aiguille fine à une quantité de 2 trous par puits. Ces trous permettent non seulement un échange d&#39;air dans chaque puits, mais aussi de fournir un moyen d&#39;anesthésier les mouches sur une base individuelle. Utiliser une lame bien aiguisée et d&#39;une règle, d&#39;introduire une coupure entre chaque colonne. Ce sera un moyen facile de charger / décharger les mouches par groupes de 8 à la fois. Pour charger les mouches dans la plaque de microtitration, retirer les flacons de l&#39;incubateur et les mouches anesthésier sur un pad CO 2. Une charge d&#39;oiseau par une à chaque puits colonne par colonne. Si un avion se coincer par inadvertance sur le joint adhésif, laisser la mouche seulement car ils sont souvent en mesure de se libérer sans intervention. Retour à la plaque de microtitration dans l&#39;incubateur pendant 8-24 h LL pour s&#39;adapter à ce nouvel environnement et à consommer le substrat luciférine. </li><li> Bactéries Culture, S. marcescens, et préparer une solution d&#39;infection tel que décrit ci-dessus. </li><li> Anaesthetize til vole à l&#39;aide d&#39;une pointe de la micropipette attachée à une faible pression de CO 2 lignes. Placez la pointe de la micropipette directement au-dessus des trous de ventilation effectués pour chaque puits. Prenez garde à s&#39;assurer que la pression de CO 2 est suffisamment élevée pour anesthésier la volée, mais suffisamment faible pour éviter les blessures à la mouche. Par groupes de huit, individuellement transférer chaque volée à un pad CO 2, et infecter tel que décrit ci-dessus. Après l&#39;infection, retournez chacune à la mouche à son origine bien refermé et la microplaque. </li><li> Luminescence mesure (TopCount NXT-luminescence et compteur à scintillation; Perkin-Elmer). Le compteur de luminescence TopCount contient une cassette d&#39;empilement de plaques, ce qui permet des lectures programmées et automatisées en permanence par incréments souhaités pour toute longueur de temps (habituellement jusqu&#39;à cinq jours). Cette fonction n&#39;est pas disponible sur tous les instruments, et la collecte de données pour les expériences réalisées avec d&#39;autres instruments peuvent donc être moins fréquents. Le compteur de luminescence est logé dans un room avec une température contrôlée et horaire d&#39;éclairage. Lors du chargement des plaques dans la cassette d&#39;empilement, empiler les plaques contenant les mouches claires entre les plaques vierges pour veiller à ce que les mouches recevoir la lumière. Programme du luminomètre selon les spécifications du fabricant de recueillir des lectures toutes les heures pendant un minimum de 24 heures. Dans cet exemple, les détecteurs sont programmés pour lire chaque puits pendant 10 sec et à exprimer le résultat en points (unités arbitraires) par seconde. Cette valeur est une moyenne sur 3 lectures par puits. Exporter les fichiers de données vers un tableur et d&#39;effectuer une analyse standard, la représentation graphique des résultats de luminescence. </li></ol>

<ol><li>Majde, J. A., Krueger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+the+innate+immune+system+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between the innate immune system and sleep.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).</li>
<li>Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+resistance+and+the+adaptive+significance+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parasite resistance and the adaptive significance of sleep.</a> BMC Evol Biol. 9, 7(2009).</li>
<li>Imeri, L., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+%28and+why%29+the+immune+system+makes+us+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How (and why) the immune system makes us sleep.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Signaling+Protease+Required+for+Melanization+in+Drosophila+Affects+Resistance+and+Tolerance+of+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections.</a> PLoS Biol. 6, e305(2008).</li>
<li>Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Locomotor+Activity+to+Study+Circadian+Rhythms+and+Sleep+Parameters+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (43), e2157(2010).</li>
<li>Lee, J. E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Regulation+in+the+Ability+of+Drosophila+to+Combat+Pathogenic+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections.</a> Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).</li>
<li>Stone, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 8, e1002445(2012).</li>
<li>Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+variation+in+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 183, 1477-1491 (2009).</li>
<li>Short, S. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+and+male+genetic+contributions+to+post-mating+immune+defence+in+female+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).</li>
<li>Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+sleep+and+the+immune+response+in+Drosophila%3A+a+role+for+the+NFkappaB+relish%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish.</a> Sleep. 30, 389-400 (2007).</li>
<li>Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Drosophila+immune+response+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Drosophila immune response during aging.</a> Aging Cell. 7, 225-236 (2008).</li>
<li>Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+output+in+Drosophila+mediated+by+neurofibromatosis-1+and+Ras%2FMAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.</a> Science. 293, 2251-2256 (2001).</li>
<li>Hedengren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relish%2C+a+central+factor+in+the+control+of+humoral+but+not+cellular+immunity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).</li>
<li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).</li>
<li>Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Immunity%3A+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159, 189-199 (2001).</li>
<li>Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+is+a+genetically+tractable+model+host+for+Mycobacterium+marinum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum.</a> Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).</li>
<li>Romeo, Y., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+immunity%3A+methods+for+monitoring+the+activity+of+Toll+and+Imd+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways.</a> Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).</li>
<li>Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+arm+of+the+Drosophila+innate+immune+response+requires+an+I%7Bkappa%7DB+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase.</a> Genes Dev. 15, 104-110 (2001).</li>
<li>Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+age-associated+changes+in+sleep%3Awake+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).</li>
<li>Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep%2C+aging%2C+and+lifespan+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep, aging, and lifespan in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Allee, W. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllee%2C+WC+%22The+social+life+of+animals%22">The social life of animals</a>. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).</li>
<li>Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+circadian-regulated+elements+contribute+to+cycling+period+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila.</a> Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).</li>
<li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+analysis+of+behavioral+and+molecular+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signal analysis of behavioral and molecular cycles.</a> BMC Neurosci. 3, 1(2002).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anorexia+in+resistance+and+tolerance+to+infections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000150(2009).</li>
<li>Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li>
<li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li>
<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Ce protocole décrit une approche pour étudier la façon dont le comportement, en particulier dormir, est liée à des paramètres de la réponse immunitaire. Ces paramètres comprennent la charge bactérienne, les résultats de survie et l&#39;activité NFKB, mesurée par un rapporteur luciférase in vivo. Ensemble, ces paramètres fournissent des informations sur la façon dont une mouche peut combattre une infection. Charge bactérienne et les résultats de survie sont des paramètres de la réponse immunitaire qui impliquent...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Incubateurs </td><td> Percival Scientific, Inc </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Tout incubateur capable de faire tourner la lumière programmée / horaires de température est appropriée. </td></tr><tr><td> Drosophila activitiy Moniteurs </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Comme il est décrit ailleurs 6, ce système nécessite une interface informatique, des logiciels, et autres accessoires. </td></tr><tr><td> Pyrex Tubes </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Scintillation pour microplaques et compteur de luminescence </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT Détecteur 12 </td><td> Tout lecteur de microplaque capable de détecter la luminescence peut être utilisé pour ce type de dosage journaliste. TopCount contient plusieurs détecteurs et un empileur automatique, elle est capable d&#39;être programmé pour lire en continu à partir de plusieurs plaques. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Imagerie des cultures bactériennes est facultative; n&#39;importe quel système d&#39;imagerie numérique avec une capacité de lumière visible est suffisante. </td></tr><tr><td> Micropipette Puller </td><td> Tritech Research, Inc </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Provisions </td></tr><tr><td> Borosilicate Glass capillaires </td><td> Mondiale précision Instrument Inc </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> Seringue de 3 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Aiguilles pour seringues </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - couper la pointe de l&#39;aiguille pour éviter d&#39;endommager la tuyauterie. </td></tr><tr><td> Tubulure en silicone, id (0,030 &quot;) od (0,065&quot;) Épaisseur du mur (0,018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Utilisé pour fixer les aiguilles capillaires en verre à une seringue </td></tr><tr><td> Robinet 3 voies </td><td> Société américaine Pharmaseal </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pilon Moteur sans fil </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pilon </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Les billes de verre de 3 mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplaques Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select plaques de 96 puits qui sont appropriés pour la luminescence - ils doivent être opaques. </td></tr><tr><td> TopSeal-A :96-Microplaques ainsi </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplaques Press-On Film d&#39;étanchéité adhésif </td></tr><tr><td> D-luciférine, sel de potassium </td><td> Or Biotechnology, Inc </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Logiciel </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Disponible sur demande auprès des auteurs </td><td> coutume, écrit par Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) </td><td> Logiciel Matlab base qui a été utilisée en routine pour l&#39;analyse du sommeil 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Disponible sur demande auprès des auteurs </td><td> coutume, écrit par Thomas Coradetti (Software trottoir) </td><td> Un PC MSVC6 programme utilisé pour l&#39;analyse de survie à partir des fichiers de données brutes collectées dans leTrikinetics système </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Adobe </td><td></td><td> Utile pour obtenir des numéros de ufc / plaque à partir d&#39;images numériques (en option) </td></tr></tbody></table>

mesure quantitative de la réponse immunitaire et le sommeil en<em&gt; drosophila</em

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Une interaction complexe entre la réponse immunitaire et comportement de l&#39;hôte a été décrit dans un large éventail d&#39;espèces. L&#39;excès de sommeil, en particulier, est connu pour se produire en réponse à l&#39;infection chez les mammifères 1 et a récemment été décrit chez Drosophila melanogaster 2. Il est généralement admis que le sommeil est bénéfique à l&#39;hôte lors d&#39;une infection et qu&#39;il est important pour le maintien d&#39;un système immunitaire robuste 3,4. Cependant, les preuves expérimentales qui soutient cette hypothèse est limité 4, et la fonction du sommeil en excès au cours d&#39;une réponse immunitaire reste incertaine. Nous avons utilisé une approche multidisciplinaire pour s&#39;attaquer à ce problème complexe, et ont mené des études dans le système modèle génétique simple, la mouche du vinaigre Drosophila melanogaster. Nous utilisons un test standard pour mesurer le comportement locomoteur et de sommeil chez les mouches, et de montrer comment ce test est utilisé pour mesurer le comportement des mouches infected avec une souche pathogène de bactéries. Ce test est également utile pour contrôler la durée de survie chez les mouches individuels au cours d&#39;une infection. D&#39;autres mesures de la fonction immunitaire incluent la capacité de mouches pour effacer une infection et l&#39;activation de NFkB, un facteur de transcription clé qui est au cœur de la réponse immunitaire innée chez la drosophile. Résultats à la fois la survie et la clairance bactérienne au cours de l&#39;infection ainsi que des indicateurs de résistance et de tolérance à l&#39;infection. Résistance réfère à la capacité des mouches pour effacer une infection, tandis que la tolérance est définie comme la capacité de l&#39;hôte à limiter les dommages causés par une infection et ainsi survivre en dépit des niveaux élevés d&#39;agents pathogènes au sein du système 5. Surveillance en temps réel de l&#39;activité de NFkB cours de l&#39;infection permet de mieux comprendre un mécanisme moléculaire de survie lors de l&#39;infection. L&#39;utilisation de la drosophile dans ces essais simples facilite les analyses génétiques et moléculaires de sommeilet la réponse immunitaire et la manière dont ces deux systèmes complexes sont mutuellement influencés.

<ol><li> L&#39;infection favorise le sommeil. Dans cet exemple, Canton-S (CS) des mouches de type sauvage et les mouches mutantes dépourvues d&#39;un gène NFkB, relish (Rel E20) 14, ont été chargés dans deux DAM2 moniteurs d&#39;activité (n = 32 pour chaque génotype) et infectées comme décrit ci-dessus. Les mouches ont été maintenus dans une lumière constante pour éliminer l&#39;influence de l&#39;horloge circadienne sur le comportement et l&#39;infection 2,7,8. Les mutants ont été E20 Rel<...

Pour comprendre le lien entre la réponse immunitaire et le comportement, nous décrivons une méthode pour mesurer le comportement locomoteur dans<em&gt; Drosophila</em&gt; Lors d&#39;une infection bactérienne ainsi que la capacité des mouches à monter une réponse immunitaire par la survie de surveillance, la charge bactérienne, et en temps réel l&#39;activité d&#39;un régulateur clé de l&#39;immunité innée, NFkB.

Mesure quantitative de la réponse immunitaire et le sommeil en<em&gt; Drosophila</em

Une interaction complexe entre la réponse immunitaire et le comportement de l'hôte a été décrite chez un large éventail d'espèces. L'excès de sommeil, en particulier, est connu...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'évaluer le sommeil et la fonction immunitaire chez la drosophile. Cela est d'abord réalisé en enregistrant l'activité locomotrice des mouches infectées afin de mesurer le sommeil, puis, dans une deuxième étape après l'infection, les mouches sont homogénéisées, diluées et étalées sur des géloses LB. Le nombre d'unités formant des colonies qui se développent indique la capacité des mouches à éliminer l'infection.Ensuite, des mouches infectées exprimant un transgène contenant le rapporteur NF kappa b luciférase sont ajoutées à une plaque de 96 puits contenant la luciférine, le substrat de la luciférase. La mesure en temps réel de la luciférase kappa b indique l'activation d'une voie de signalisation NF kappa B pendant l'infection, ainsi que le résultat sur la survie et le sommeil. L'élimination bactérienne et l'activité du rapporteur NF KB sont des mesures qui fournissent des éclaircissements mécanistiques sur le lien moléculaire entre la fonction immunitaire et le comportement. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car il faut du temps et de la pratique pour apprendre à infecter manuellement les mouches de manière reproductible. Le principal avantage de la technique utilisant le rapporteur luciférase par rapport aux méthodes existantes, telles que la QPCR, est que l'activité du facteur nucléaire kappa B peut être mesurée en continu, en temps réel, chez des mouches vivantes. Commencez par incuber des cultures de drosophiles au stade pupal tardif pendant trois à quatre jours, afin que les adultes s'adaptent aux conditions environnementales.Ici, les mouches sont placées en lumière constante afin d'éliminer l'influence de l'horloge circadienne sur la réponse immunitaire et le comportement. Ensuite, chargez des mouches âgées d'un à quatre jours dans l'appareil de suivi d'activité. Les moniteurs enregistrent leur activité pendant au moins trois jours avant l'infection, soit un jour avant l'infection programmée.Prélevez une colonie SIA unique à l’aide d’une pointe de pipette stérile et immergez la pointe dans un tube de culture contenant cinq millilitres de milieu LB afin de vérifier la technique stérile. N’oubliez pas de préparer une culture témoin sans bactérie. Faites croître les bactéries toute la nuit jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance exponentielle le lendemain.Mesurez l'absorbance de la culture à 600 nanomètres. Incluez un second Q vet comme témoin. La culture est prête lorsque la concentration se situe entre 0,5 et 1 unité d'absorbance ; effectuez alors un sous-culture ou prolongez le temps de culture selon les besoins.Préparez maintenant la solution bactérienne pour infecter les mouches. Diluez les bactéries avec du PBS pour obtenir une absorbance attendue de 0,1 à 600 nanomètres. Ajoutez ensuite un colorant alimentaire comme témoin d'injection.Remplacez les bactéries par du milieu LB. Conservez les deux solutions sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’un tireur de micropipettes, fabriquez des aiguilles d’injection avec une pointe fine sous un microscope stéréoscopique.Utilisez une pince fine pour briser la pointe de chaque aiguille afin que l'ouverture soit suffisamment grande pour être remplie de liquide d'injection par aspiration, mais suffisamment petite pour minimiser les dommages causés à la drosophile. Fixez une aiguille en verre à une seringue en plastique de trois cm³ à l'aide d'un morceau de tubulure en utilisant la seringue. L'écoulement du milieu d'injection est contrôlé manuellement.Évitez de contaminer le tube en caoutchouc avec le liquide d'injection, car l'appareil à seringue est utilisé à la fois pour les injections infectieuses et les injections témoins. Vérifiez l'écoulement du milieu d'injection à l'aide d'un mouchoir en papier Kim. Deux éléments essentiels pour des injections réussies sont l'utilisation de la taille optimale d'aiguille et l'étanchéité sécurisée entre l'aiguille et la seringue.Une fois le système d'injection entièrement préparé, anesthésiez les mouches à l'aide d'un débit minimal de dioxyde de carbone, puis procédez rapidement afin qu'aucune mouche ne soit anesthésiée plus de cinq minutes. Injectez maintenant les mouches en piquant l'aiguille en verre dans la région située au-dessus du scutellum du thorax dorsal. L'entrée du milieu d'injection dans la mouche est confirmée par le colorant alimentaire, visible lorsque la solution injectée se répand.Avant de commencer, assurez-vous que tous les matériaux utilisés pour cette procédure ont été stérilisés au autoclave au moins un jour à l'avance. Préparez des boîtes de Pétri de 10 centimètres avec du milieu gélosé LV. Le jour de l'expérience, anesthésiez et placez les mouches dans des tubes de centrifugation de 1,5 millilitre.Préparez au minimum deux groupes de 10 mouches chacun par condition expérimentale. Préparez également un groupe témoin de mouches non infectées, en particulier lors de l'utilisation d'une souche bactérienne sans résistance aux antibiotiques. Conservez tous les tubes chargés sur de la glace.Ensuite, ajoutez 400 microlitres de milieu LB dans chaque tube contenant des mouches. Homogénéisez les mouches à l’aide d’un petit broyeur, en travaillant près d’une flamme pour éviter toute contamination. Puis, à l’aide de pointes de pipette coupées, effectuez des dilutions sérielles de l’homogénat par facteurs de 10 dans des volumes de 200 microlitres.Si l'homogénat est préparé immédiatement après l'infection avec sia, effectuez des dilutions allant jusqu'à un sur 1000, mais pour l'homogénat prélevé 24 heures après l'infection, effectuez des dilutions allant jusqu'à un sur 100 000. Ensuite, ensemencez les deux plus fortes dilutions sur des boîtes de 10 centimètres à l'aide de billes de verre afin d'assurer une répartition uniforme, puis incubez les boîtes pendant la nuit. Le lendemain, comptez le nombre de colonies sur la boîte par observation directe ou à l'aide d'un logiciel de comptage de colonies.Ensuite, calculez le nombre d'unités formant des colonies par mouche. Cet essai utilise des mouches transgéniques portant le rapporteur luciférase kappa b au moment approprié. L'essai nécessite également des bactéries cultivées, telles que SCIA, préparées pour injection comme décrit dans la section précédente.Ajustez les mouches aux conditions d'éclairage expérimentales. Dans cet exemple, des mouches transgéniques exprimant la luciférase kappa b âgées d'un à quatre jours sont élevées dans des flacons contenant un milieu alimentaire composé de 5 % de saccharose et de 2 % d'agar, puis placées en lumière constante pendant deux jours. Préparez maintenant une microplaque de 96 puits pour les mouches.Remplir chaque puits de deux couches d'aliment. Ajouter d'abord le milieu, puis 300 microlitres de solution de 5 % de saccharose et 2 % d'agar dans chaque puits. Recouvrir ensuite la plaque d'un tissu fin en maille et laisser sécher complètement pendant une heure maximum.Ensuite, ajoutez une couche supérieure de 50 microlitres dans chaque puits contenant 5 % de saccharose, 1 % d'agar et deux millimolaires de Lucifer. Étant donné que le Lucifer est sensible à la lumière, laissez sécher la plaque à l'obscurité à partir de maintenant. Minimisez l'exposition de la plaque à la lumière.Une fois que l'agar a refroidi, recouvrez la boîte avec un film adhésif transparent. Ensuite, à l'aide d'une aiguille fine, percez le film deux fois au-dessus de chaque puits. Ces trous permettent les échanges gazeux et l'anesthésie par voie aérienne.Ensuite, pour faciliter le chargement des mouches, utilisez une lame bien aiguisée et une règle droite afin de pratiquer une incision entre chaque colonne. Anesthésiez les mouches au dioxyde de carbone et chargez-les une par une dans chaque puits, colonne par colonne. Si une mouche reste collée au film, laissez-lui la possibilité de se libérer avant d'intervenir.Replacer la plaque de microplaque dans l'incubateur sous lumière constante pendant huit à 24 heures. Pour anesthésier les mouches fixées dans les puits, utiliser une pointe de micropipette reliée à une ligne de dioxyde de carbone à basse pression. S'assurer que le gaz est à une pression suffisamment faible pour être inoffensif et placer la pointe de micropipette directement au-dessus des trous de ventilation pour anesthésier les mouches, huit par huit, individuellement.Transférez chaque mouche sur un coussin de CO2 et infectez-les avec des bactéries comme précédemment. Replacez ensuite chaque mouche dans son puits d'origine et refermez hermétiquement la microplaque. Mesurez la luminescence de chaque mouche à l’aide d’un luminomètre placé dans une pièce à température contrôlée et soumise à un cycle lumineux défini.Chargeez les plaques dans la cassette empilable, en veillant à placer les plaques contenant les mouches entre des plaques vierges transparentes. Programmez le luminomètre conformément aux spécifications du fabricant et enregistrez les mesures toutes les heures pendant au moins 24 heures. Dans cet exemple, les détecteurs sont programmés pour lire chaque puits pendant 10 secondes.Une fois terminé, exportez les fichiers de données vers un tableur et effectuez une analyse standard en traçant les résultats sous forme de graphique. Les données d'exemple peuvent être analysées. Remises par seconde moyennées à partir de trois lectures par puits.Des mouches sauvages Canton S et des mouches mutantes relish. E 20 dépourvues du gène NF kappa B ont été placées dans deux moniteurs d'activité en lumière constante et infectées par sia. Dans cet exemple, l'infection a favorisé le sommeil.Il était clair que les mutants relish E 20 présentaient moins de sommeil que les mouches Canton s. témoins après infection. Conformément aux résultats précédents, les mutants relish E 20 succombaient également rapidement à l'infection par rapport aux mouches de type sauvage.La majorité des mouches ont survécu à l'injection contrôle aseptique, indiquant que les mouches sont décédées à cause de l'infection et non de la blessure provoquée par l'injection. Étant donné que les mutants relish sont morts très rapidement, seules les mouches Canton s ont été utilisées pour démontrer la charge bactérienne après l'infection. Sia a continué à proliférer chez la mouche 24 heures après l'infection.L'activité du rapporteur luciférase a montré une grande variation entre les mouches individuelles et entre la réussite des points de données. Bien que le signal provienne de tous les tissus de la mouche, on ne s'attend pas à ce que chaque tissu émette la même quantité de signal, et la visibilité du tissu par rapport au détecteur varierait au fur et à mesure que la mouche se déplace. Dans cet exemple, des mouches ont été infectées et comparées à un groupe témoin manipulé.Les mouches décédées ont été exclues de l'analyse au sein d'un groupe de mouches. L'activité du rapporteur luciférase Kappa b augmente régulièrement après l'infection. L'activité du rapporteur luciférase Kappa b a également augmenté régulièrement après une blessure aseptique.L'activité maximale se situait autour de 12 heures, tant après une lésion qu'après une infection. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment quantifier la fonction immunitaire et le sommeil chez les SSO après une infection. Nous pouvons mesurer le sommeil, la survie, le temps, l'élimination bactérienne et l'activité en temps réel d'un rapporteur de transcription non copié.

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