Mesure quantitative de la réponse immunitaire et le sommeil en Drosophila

L’objectif général de l’expérience suivante est d’évaluer le sommeil et la fonction immunitaire chez la drosophile. Ceci est d’abord réalisé en enregistrant l’activité locomotrice des mouches infectées pour mesurer le sommeil et la survie dans un deuxième temps après que les mouches infectieuses sont homogénéisées, diluées et étalées sur des plaques de gélose LB. Le nombre d’unités formant des colonies qui se développent indique la capacité des mouches à éliminer l’infection.

Ensuite, des mouches infectées exprimant un transgène contenant le rapporteur NF kappa b luciférase sont ajoutées à une plaque de 96 puits contenant du luciférian, le substrat de la luciférase. La mesure en temps réel de la kappa b luciférase indique l’activation d’une voie de signalisation NF kappa B pendant l’infection et le résultat de la survie au sommeil. La clairance bactérienne et l’activité du rapporteur NF KB sont des mesures qui fournissent un aperçu mécaniste du lien moléculaire entre la fonction immunitaire et le comportement.

En général, les personnes qui découvrent cette méthode ont du mal à apprendre à infecter manuellement les mouches avec cohérence, car il faut du temps et de la pratique. Le principal avantage de la technique rapportée par Lucifer par rapport aux méthodes existantes telles que la QPCR est que l’activité de NF Kappa B peut être mesurée en continu et en temps réel dans la vie. Mouches Commencez par incuber des cultures de drosophile à un stade tardif pendant trois à quatre jours, afin que les adultes s’adaptent aux conditions environnementales.

Ici, les mouches sont placées sous une lumière constante pour éliminer l’influence de l’horloge circadienne sur la réponse immunitaire et le comportement. Ensuite, chargez des mouches d’un à quatre jours dans l’activité. Les moniteurs enregistrent leur activité pendant au moins trois jours avant l’infection, un jour avant l’infection programmée.

Prélevez une seule colonie SIA avec une pointe de pipette stérile et immergez-la dans un tube de culture contenant cinq millilitres de milieu LB pour vérifier la technique stérile. N’oubliez pas de faire une culture simulée de contrôle sans bactéries. Cultivez des bactéries pendant la nuit jusqu’à ce qu’elles atteignent la phase de croissance exponentielle le lendemain.

Mesurer l’absorbance de la culture à 600 nanomètres. Incluez un deuxième vétérinaire Q en blanc. Il est prêt lorsque la concentration est comprise entre 0,5 et une unité d’absorbance sous-culture, ou prolongez le temps de culture si nécessaire.

Préparez maintenant la solution bactérienne pour infecter les mouches. Diluez les bactéries avec du PBS à une absorbance attendue de 0,1 à 600 nanomètres. Ajoutez ensuite du colorant alimentaire pour le contrôle de l’injection.

Remplacez les bactéries par du milieu LB. Conservez les deux solutions sur de la glace. Ensuite, à l’aide d’un extracteur de micro-pipette, fabriquez des aiguilles d’injection à pointe fine sous un microscope à dissection.

À l’aide d’une pince fine, cassez la pointe de chaque aiguille afin que l’ouverture soit suffisamment grande pour être remplie de liquide d’injection par aspiration, mais aussi assez petite pour minimiser les dommages causés à la mouche. Fixez une aiguille en verre à une seringue en plastique de trois cc avec une longueur de tube à l’aide de la seringue. Le débit du fluide d’injection est contrôlé manuellement.

Évitez de contaminer le tube en caoutchouc avec du liquide d’injection, car l’appareil à seringue est utilisé à la fois pour l’injection infectieuse et l’injection de contrôle. Vérifiez le débit du milieu d’injection à l’aide d’une lingette Kim. Deux détails essentiels pour des injections réussies sont l’utilisation de la taille optimale de l’aiguille et de l’étanchéité sécurisée entre l’aiguille et la seringue.

Une fois que le système d’injection est entièrement préparé, anesthésiez les mouches à l’aide d’un flux minimal de dioxyde de carbone, procédez rapidement afin qu’aucune mouche ne soit anesthésiée pendant plus de cinq minutes. Maintenant, injectez des mouches en enfonçant l’aiguille de verre dans la région au-dessus du tellum oblique du thorax dorsal. Le passage du milieu d’injection dans la mouche est vérifié par le colorant alimentaire, qui peut être vu lorsque la solution injectée se répand.

Avant de commencer, assurez-vous que tous les matériaux utilisés pour cette procédure ont été autoclaves également au moins un jour à l’avance. Préparez des boîtes de Pétri de 10 centimètres avec un milieu de gélose LV. Le jour de l’expérience, anesthésez et placez les mouches dans des tubes à centrifuger de 1,5 millilitre.

Préparez un minimum de deux groupes de 10 mouches chacun par condition expérimentale. Préparez également un groupe témoin de mouches sans infection, en particulier lors de l’utilisation d’une souche bactérienne sans résistance aux antibiotiques. Rangez tous les tubes chargés sur de la glace.

Ensuite, ajoutez 400 microlitres de milieu LB dans chaque tube chargé à la mouche. Homogénéisez les mouches à l’aide d’un petit éclat et faites-le près d’une flamme pour éviter toute contamination. Maintenant, à l’aide des pointes de pipette coupées, diluez en série l’homogénat par des facteurs de 10 dans des volumes de 200 microlitres.

Si l’homogénat est fait immédiatement après l’infection par le sia, faites du dilu jusqu’à un à 1000, mais pendant 24 heures, après l’infection, homogénatez jusqu’à un à 100 000. Ensuite, les deux plus grands dilu sur des plaques de 10 centimètres à l’aide de boules de verre pour assurer une répartition uniforme, incubez les plaques pendant la nuit. Le lendemain, comptez le nombre de colonies sur la plaque par observation directe ou via un logiciel de comptage de colonies.

Calculez ensuite le nombre d’unités formant une colonie par mouche. Ce test utilise des mouches transgéniques porteuses du rapporteur kappa b luciferase au moment opportun. Le test nécessite également des bactéries cultivées telles que le SCIA préparées pour l’injection, comme décrit dans la section précédente.

Adaptez les mouches aux conditions d’éclairage expérimentales. Dans cet exemple, des mouches kappa b luciferase âgées d’un à quatre jours sont logées dans des flacons contenant 5 % de saccharose et 2 % de milieu alimentaire gélosé et placées à la lumière constante pendant deux jours. Préparez maintenant une microplaque de 96 puits pour les mouches.

Remplissez chaque puits avec deux couches de nourriture. Milieu d’abord, ajoutez 300 microlitres de solution de saccharose à 5 %, 2 % de gélose à chacun. Couvrez bien l’assiette avec un chiffon à mailles fines et laissez l’assiette sécher complètement pendant une heure maximum.

Ensuite, ajoutez une couche supérieure de 50 microlitres dans chaque puits contenant 5 % de saccharose, 1 % d’agar et deux millimolaires Lucifer. Parce que Lucifer est sensible à la lumière, laissez la plaque sécher dans l’obscurité et vers l’avant. Minimisez l’exposition à la lumière de la plaque.

Une fois la gélose refroidie, recouvrez la plaque d’un film adhésif transparent. Ensuite, à l’aide d’une aiguille fine, perforez le film deux fois sur chaque puits. Ces trous permettent l’échange d’air et l’anesthésie gazeuse.

Ensuite, pour faciliter le chargement à la mouche, utilisez une lame tranchante et un bord droit pour introduire une coupe entre chaque colonne. Anesthésie les mouches avec du dioxyde de carbone et charge-les une par une dans chaque puits, colonne par colonne. Si une mouche se colle au film, donnez-lui la possibilité de se libérer avant d’intervenir.

Remettez la plaque à micropuits dans l’incubateur sous une lumière constante pendant huit à 24 heures. Pour anesthésier les mouches bien liées, utilisez une pointe de micro-pipette fixée à une ligne de dioxyde de carbone à basse pression. Assurez-vous que le gaz est à basse pression inoffensive et placez la pointe de la micro-pipette directement au-dessus des trous de ventilation pour anesthésier une mouche par groupes de huit individuellement.

Transférez chaque mouche dans un tampon de CO2 et infectez-les avec des bactéries comme précédemment. Remettez ensuite chaque mouche dans son puits d’origine et refermez la microplaque. Mesurez la luminescence de chaque mouche à l’aide d’un luminomètre logé dans une pièce à température contrôlée selon un programme d’éclairage défini.

Chargez les plaques dans la cassette d’empilage, en vous assurant d’empiler les plaques contenant les mouches entre des plaques vierges transparentes. Programmez le luminomètre selon les spécifications du fabricant et collectez les relevés toutes les heures pendant un minimum de 24 heures. Dans cet exemple, les détecteurs sont programmés pour lire chaque puits pendant 10 secondes.

Une fois terminé, exportez les fichiers de données vers une feuille de calcul et effectuez une analyse standard des résultats. Les données d’exemple peuvent être analysées. Les remises par seconde étaient en moyenne de trois lectures par puits.

Canton S mouches de type sauvage et délectation. Des mouches mutantes E 20 dépourvues du gène NF kappa B ont été chargées dans deux moniteurs d’activité en lumière constante et infectées par le sia. Dans cet exemple, l’infection a favorisé le sommeil.

Il était clair que les mutants E 20 savoureux dormaient moins que les mouches de Canton. Conformément aux découvertes précédentes, les mutants Relish E 20 ont également succombé rapidement à l’infection par rapport aux mouches de type sauvage.

La plupart des mouches ont survécu à l’injection de contrôle aseptique, ce qui indique que les mouches ont succombé à l’infection et non à la blessure due à l’injection. Parce que les mutants relish sont morts si rapidement, seules les mouches de Canton ont été utilisées pour démontrer la charge bactérienne après l’infection. Sia a continué à proliférer chez la mouche 24 heures après l’infection.

L’activité de rapporteur de Lucifer a montré une grande variation entre les mouches individuelles et entre le succès des points de données. Bien que le signal soit dérivé de tous les tissus de la mouche, on ne s’attend pas à ce que tous les tissus émettent la même quantité de signal et que la visibilité du tissu pour le détecteur varie à mesure que la mouche se déplace. Dans cet exemple, les mouches ont été infectées et comparées à un groupe témoin manipulé.

Les mouches mortes ont été exclues de l’analyse pour un groupe de mouches. L’activité du rapporteur Kappa b luciferase augmente régulièrement après l’infection. L’activité du rapporteur Kappa b Luciferase a également augmenté régulièrement après une blessure aseptique.

Le pic d’activité était d’environ 12 heures après la blessure et après l’infection. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de quantifier la fonction immunitaire et le sommeil dans le SSO après une infection. Nous pouvons mesurer le sommeil, la survie, le temps, la clairance bactérienne et l’activité en temps réel d’un rapporteur de transcription de copie.