Name: La délétion de gènes dans le génome entier Streptococcus sanguinis Par PCR à haut débit (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Découvrez une méthode de délétion de gènes à haut débit par PCR dans Streptococcus sanguinis. Cette technique permet d'étudier les fonctions géniques bactériennes avec efficacité.

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Ce travail a été soutenu par des subventions R01DE018138 de la National Institutes of Health (PX) et en partie par la Virginia Commonwealth University Research Programme d&#39;encouragement présidentielle (PRIP) 144602-3 (PX). Nous remercions les Drs. Lei Chen, Yuetan Dou et Xiaojing Wang pour aider à la construction de mutants du génome entier. Nous remercions également le Core Facility l&#39;ADN à l&#39;Université Virginia Commonwealth pour le séquençage de l&#39;ADN.

1. Conception Primer <ol><li> Les amorces sont conçues à l&#39;aide de scripts maison basé sur le S. séquence du génome sanguinis SK36. Trois ensembles d&#39;amorces, F1/R1, F2/R2, F3/R3 et sont conçus pour l&#39;amplification de la séquence 1-kb en amont du gène cible, la résistance aphA-3 du gène codant pour la kanamycine (Km r), et la protéine 3 1 -kb de séquence en aval du gène cible, respectivement (figure 1). Parmi ces amorces, F1 et R3 sont conçus à l&#39;aide de la suite ePrimer3 EMBOSS de programmes ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) pour amplifier des régions flanquantes en amont ou en aval de la cible gène. Amorces spécifiques de gènes, R1 et F3, sont conçus en fonction de la 5 &#39;et 3&#39; des séquences du gène cible. R1 et F3 amorces contiennent les séquences d&#39;adaptateur 25-BP à leur extrémité 5 &#39;qui sont complémentaires de la aphA-3gène. Les températures de fusion de chacune des amorces ont été conçues pour être aussi proche que possible de 60 ° C pour permettre l&#39;utilisation d&#39;une température de recuit uniforme pour toutes les réactions de PCR en format de 96-puits. </li><li> F1, R1, R3 F3 et les amorces sont synthétisées dans des plaques 96 puits sur la base d&#39;un ordre des gènes. Chaque plaque contient un type d&#39;amorces dans l&#39;ordre même gène. Diluer les amorces en plaque de 96 puits d&#39;amorce de travail à une concentration finale de 10 pM pour l&#39;amplification PCR à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. </li></ol> 2. À haut débit amplification par PCR et purification <ol><li> Pour amplifier à haut débit de 1 kb en amont ou en aval de la cible S. gènes sanguinis, assembler un mélange cocktail PCR sur de la glace dans un tube conique de 15 ml contenant 1640 pi ddH 2 O, 250 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul de 10 mM de dNTP mélange, 100 ul de 50 mM MgSO 4, 100 pi de 10 ng / ul S. l&#39;ADN génomique SK36 sanguinis et 10 pl Platinum Taq ADN polymerase de haute fidélité et de transfert 23 ul du mélange dans chaque puits de plaque de 96 puits PCR à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux. Transférer 1 ul de chaque F1 et R1 (ou F3 et R3) à partir de 10 uM de travail plaques d&#39;amorces pour la plaque PCR en utilisant une pipette multicanaux. Sceller la plaque PCR et l&#39;amplification à 94 ° C pendant 1 min et 30 cycles de 94 ° C pendant 30 secondes, 54 ° C pendant 30 secondes et 68 ° C pendant 1,5 min. </li><li> Préparez 1% gel d&#39;agarose contenant du bromure d&#39;éthidium à 48 puits multicanal chargement pipette raccord. Mélanger 4 ul produit PCR avec 1 pi de tampon de chargement 5xDNA sur plaque de 96 puits et de charger les échantillons sur un gel d&#39;agarose à l&#39;aide d&#39;une pipette multicanaux 10 pi. Exécuter électrophorèse à 135 V pendant 30 min. Examinez la bande sur un gel de la documentation en vertu UVP et d&#39;analyse. </li><li> Purifier produits de PCR par 96 PureLink kit de purification PCR en utilisant la centrifugation conformément aux instructions du fabricant. Pour l&#39;élution de l&#39;ADN, ajouter 40 ul stériles ddH 2 O pour le bien de la bROUVER plaque. </li><li> Choisir au hasard plusieurs amplicons purifiés sur la plaque d&#39;examiner les concentrations d&#39;ADN en utilisant un spectrophotomètre NanoDrop. Ajuster la concentration d&#39;amplicons sur la plaque à ~ 10 ng / ul. </li><li> Un plasmide contenant la cassette kilomètres r est digéré par EcoRI comme matrice de PCR. Le plasmide digéré est purifié par le kit QIAquick PCR purification et l&#39;ADN plasmidique linéaire est ajustée à la concentration finale d&#39;ADN à 10 ng / ul. Monter 25 ul de mélange amplicon km cassettes r dont 16,4 ul O ddH 2, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM de dNTP mélange, 1 ul de 50 mM de Mg SO 4, 1 pl de 10 uM F2, 1 pl de 10 R2 uM, 1 pi d&#39;ADN plasmidique linéaire et 0,1 ul fidélité Platinum Taq ADN polymérase haute. Effectuer une amplification PCR à 94 ° C pendant 1 min, et 30 cycles de 94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 1 min. Examiner le produit de PCR par électrophorèse sur gel d&#39;agarose 1%. Poola majeure partie de l&#39;amplicon km cassettes r de 10 individus PCR purifié par le kit QIAquick PCR purification. Ajuster la concentration amplicon à 10 ng / ul. </li><li> Pour obtenir le dernier linéaire amplicon de PCR recombinant, trois amplicons PCR sont combinés les uns avec les pl 1 (en des quantités à peu près égales molaire) dans une plaque de PCR ainsi que la matrice de PCR. D&#39;autres composants PCR est ajouté dont 14,4 ul O ddH 2, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM de dNTP mélange, 1 ul de 50 mM de Mg SO 4, 1 ul de 10 uM F1, 1 pl de 10 uM R3, 0,1 pi d&#39;ADN Platinum Taq polymérase haute fidélité. L&#39;amplification par PCR est effectuée à 94 ° C pendant 2 min, 30 cycles de 94 ° C pendant 30 sec à 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 3,5 min, et enfin 68 ° C pendant 4 min. </li><li> Examinez le amplicons PCR sur gel d&#39;agarose. Purifier et quantifier les amplicons de PCR comme décrit ci-dessus. Geler les amplicons PCR recombinés à -20 ° C. </li></ol> 3. Comcompétente Préparation des cellules <ol><li> Bouillon Todd Hewitt est préparé, pH ajusté à 7,6 avec du NaOH 10 N, on chauffe à ébullition, puis refroidi à température ambiante et on stérilise à l&#39;aide de polystyrène 0,22 um filtre 4. Ajouter 300 ul cheval inactivé par la chaleur sérums (concentration finale de 2,5%) à 11,7 ml de bouillon Todd Hewitt dans 15 ml tube conique de rattraper TH + support HS. TH + HS aliquote milieu dans 2 ml et 10 ml dans des tubes. </li><li> Inoculer 5 ul de stock S. sanguinis SK36 congelé à -80 ° C en 2 TH ml + support HS et incuber la culture d&#39;une nuit avec le plafonnement bien à 37 ° C, accompagnée de pré-incubation de 10 ml-TH + HS tube. </li><li> Après une nuit, transférer 50 ul culture dans 10 ml TH + HS et incuber le tube à 37 ° C pendant 3 heures (correspondant à DO 660 de 0,07 à 0,08), immédiatement à l&#39;aide d&#39;une transformation. </li></ol> 4. Transformation cellulaire et de sélection des antibiotiques <ol><li> Ajouter 2 ul de 70 ng S. sanguinis SK36 compétence peptide stimulant (CSP) et 2 pi linéaire recombinant amplicon de PCR (~ 50 ng) pour tubes Eppendorf de 96 puits à bloc et préchauffer les à 37 ° C. Transfert 330 ul de 3 h-incubé SK36 la culture dans chaque tube. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Remplacer l&#39;ADN avec O stérile ddH 2 comme contrôle. </li><li> Placez le bloc sur la glace et se propager 100 ul de chaque transformation sur bouillon coeur-cervelle (BHI) plaque de gélose avec 500 ug / ml de kanamycine. Incuber les plaques à 37 ° C pendant 2 jours dans des conditions micro-aérobies. </li></ol> 5. Confirmation mutant et de stockage <ol><li> Pour chaque mutant remplacement, au hasard, relever 2 colonies individuelles, inoculer la colonie dans 5 ml de BHI contenant 500 ug / ml de kanamycine et incuber l&#39;inoculum microaérobie une nuit à 37 ° C. Cryoconservation de chaque culture dans du glycérol 30% à -80 ° C </li><li> Afin de déterminer si le mutant contenant le gène de remplacement prévu, effectuer une PCR sur colonie pour chaque mutant en utilisant F1 et R3amorces dans plaque de 96 puits PCR. Environ 1-pi culture d&#39;une nuit de colonie individuelle est utilisée en tant que matrice d&#39;ADN dans le 25-pl réaction d&#39;amplification par PCR. La PCR est réalisée à 94 ° C pendant 5 min, 35 cycles de 94 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 3,5 min, et enfin 68 ° C pendant 4 min. </li><li> Pour identifier avec précision double bande mutants ou contaminant amplicons PCR, d&#39;examiner l&#39;amplicon PCR par électrophorèse pendant 4 heures sur&gt; 12 cm de long 2% gel d&#39;agarose avec coloration au bromure d&#39;éthidium. Sous cette condition électrophorèse sur gel d&#39;agarose, les amplicons avec ≥ 100 pb différence ont été clairement identifiés. Lorsque des bandes résultant de l&#39;amplification de la cassette de r km et le gène de type sauvage sont prévus pour différer par &lt;100 pb, une amorce T1 interne est utilisée pour déterminer si un gène de type sauvage peut être détecté par PCR. </li><li> Pour confirmer la suppression, les amplicons sont purifiés par PureLink 96 PCR purification kit et séquencé en utilisant l&#39;amorce P1 quise lie à la cassette r km. Ne garder que les mutants correctes confirmés par séquençage. </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Pour minimiser les effets possibles polaires du remplacement d&#39;un gène ciblé avec le gène exogène antibiotiques sur les gènes voisins, deux mesures sont prises en amorce initiale de conception. Pour la plupart des gènes délétés, la amorces R1 et F3 sont conçus pour supprimer de la région codante de 6 pb après le codon d&#39;initiation de 30 pb avant le codon stop. Les 30 dernières paires de bases sont conservées pour protéger le potentiel du site de liaison ribosomique utilisé par le gène adjacent en aval. La région...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Noms des</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strong&gt; Catalogue</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commentaires (optionnel)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer F2</td&gt;<td&gt; Integrated DNA Technologies</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATG<br/&gt; GCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdR2 Primer&gt;</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA<br/&gt; CAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdPrimer&gt; F2p</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdP1 Primaire&gt;</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdP2 Primer&gt;</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primer 5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt; Ibid</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; Séquence: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdADN polymérase&gt;</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt; Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EcoRI</td&gt;<td&gt; New England Biolabs Inc</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<tdDes enzymes de restriction&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agar</td&gt;<td&gt; Bioanalytique américain</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agarose</td&gt;<td&gt; Promega</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt; Brain Heart Infusion</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sérum de cheval</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt; Sérum de cheval</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KM</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt; Kanamycine</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TH bouillon</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt; Bouillon Todd Hewitt</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR purification kit</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAquick</td&gt;<td&gt; Qiagen</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; Kit QIAquick PCR purification</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Filtre</td&gt;<td&gt; Corning</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt; Filtre de 0,22 um polystyrène</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Système Anoxomat</td&gt;<td&gt; Mart Microbiology BV</td&gt;<td&gt; Anoxomat Mark II</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Centrifugeuse de paillasse</td&gt;<td&gt; Thermo Scientific</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt; Sorvall Legend RT plus microplaque rotor</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdDocumentation&gt; Gel</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDoc-It 210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Incubateur</td&gt;<td&gt; Fisher Scientific</td&gt;<td&gt; 11-690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Labnet Gel XL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; Labnet Gel XL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrifugeuse</td&gt;<td&gt; Eppendorf</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt; Microcentrifugeuse 5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdPipettes multicanaux&gt;</td&gt;<td&gt; Thermo Scientfic</td&gt;<td&gt; 4661040, 4661020</td&gt;<td&gt; Finnpipette F1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermocycleur</td&gt;<td&gt; Applied Biosystems Inc</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt; GeneAmp PCR System 9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

la délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; streptococcus sanguinis</em&gt; par pcr à haut débit

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenèse et un seul gène suppression ya deux méthodes appliquées dans inactivation du gène du génome entier dans 1,2 bactéries. Bien mutagenèse par transposon prend moins de temps, moins coûteux, et ne nécessite pas l&#39;information du génome terminée, il ya deux faiblesses de cette méthode: (1) la possibilité d&#39;une mutants disparates dans la bibliothèque mixte mutant qui contre-sélectionne les mutants où la concurrence est diminué; et (2) la possibilité d&#39;inactivation partielle de gène par lequel les gènes ne sont pas entièrement perdent leur fonction après l&#39;insertion d&#39;un transposon. Analyse par deletion seul gène peut compenser les inconvénients liés à la mutagenèse par transposon. Pour améliorer l&#39;efficacité de l&#39;ensemble du génome délétion du gène unique, nous essayons de mettre en place une technique à haut débit pour l&#39;ensemble du génome délétion du gène unique à l&#39;aide sanguinis Streptococcus comme organisme modèle. Chaque délétion du gène construire dans S. sanguinis génome est conçu pour comporter 1Kb en amont du gène ciblé, le gène aphA-3, codant pour la protéine de résistance à la kanamycine et le 1-ko aval du gène ciblé. Trois ensembles d&#39;amorces F1/R1, F2/R2 et F3/R3, respectivement, sont conçues et synthétisées dans un format de plaque à 96 puits pour PCR des amplifications de ces trois composantes de chaque suppression construire. R1 et F3 amorces contiennent 25-pb des séquences qui sont complémentaires de régions de la aphA-3 du gène à leur extrémité 5 &#39;. A grande échelle amplification par PCR du gène aphA-3 est effectuée une fois pour toutes les constructions de deletion création d&#39;un seul gène. Le promoteur de gène aphA-3 est initialement exclu de réduire au minimum l&#39;effet potentiel polaire de cassette kanamycine. Pour créer les constructions de deletion du gène à haut débit amplification par PCR et la purification sont effectuées dans un format de plaque à 96 puits. Un amplicon PCR recombinante linéaire pour chaque délétion du gène sera constitué par quatre réactions PCR en utilisant l&#39;ADN polymérase haute fidélité. Le expon initialephase de croissance préférentiel de S. sanguinis cultivées en bouillon Todd Hewitt supplémenté avec 2,5% de sérum de cheval inactivé est utilisé pour augmenter la compétence pour la transformation de la PCR recombinante constructions. Sous cette condition, jusqu&#39;à 20% de S. sanguinis cellules peuvent être transformées en utilisant ~ 50 ng d&#39;ADN. Sur la base de cette approche, 2.048 mutants avec un seul gène de suppression ont finalement été obtenus à partir des gènes chez S. 2270 sanguinis l&#39;exclusion des quatre ORF du gène entièrement contenue dans d&#39;autres ORF de S. SK36 sanguinis et 218 gènes potentiels essentielles. La technique sur la création de constructions de deletion du gène est un débit élevé et pourrait être facile à utiliser dans l&#39;ensemble du génome délétions de gènes uniques pour toutes les bactéries transformables.

Après amplification par PCR en utilisant des amorces F1 et R1, R3 et F3 et, approximativement 1-kb en amont et en aval de chaque S. sanguinis gène ont été obtenus dans le format 96-puits, respectivement (figure 2A). Dans nos conditions de PCR utilisant des amorces conçues et, un produit spécifique a été amplifié à partir de S. sanguinis ADN génomique dans chaque réaction PCR. Ce résultat indique les amorces étaient très spécifiques à la cible de S. sanguinis. Par PCR ré-amplif...

Une échelle du génome unique efficace méthode de mutation du gène a été établie à l&#39;aide<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Comme organisme modèle. Cette méthode a réalisé via PCR à haut débit recombinantes et des transformations.

La délétion de gènes dans le génome entier<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Par PCR à haut débit

La mutagenèse par transposons et la délétion d'un gène unique sont deux méthodes appliquées pour l'inactivation génique à l'échelle du génome chez les bactéries 1,2. Bien que la mutagenèse par transposons soit...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser des délétions génomiques de gènes uniques chez Streptococcus sanguinis par PCR à haut débit. Cela est accompli en obtenant d'abord trois amplicons par amplification PCR à haut débit, incluant le gène de résistance à l'antibiotique ainsi que les séquences d'ADN en amont et en aval du gène cible. La deuxième étape consiste à obtenir l'amplicon linéaire recombinant par PCR en utilisant les trois amplicons PCR comme matrices.Ensuite, les cellules compétentes de s sanguine sont préparées. La dernière étape consiste à transformer l'amplicon PCR recombinant linéaire dans des cellules compétentes de s sanguineous. Finalement, une amplification PCR de colon A et un séquençage de l'ADN sont utilisés pour vérifier les mutants corrects.L'avantage principal de cette technique par rapport aux autres méthodes épuisantes comme le knock-out par plasmide suicide est qu'elle permet de créer directement un mutant de délétion à l'échelle du génome en utilisant un criblage à haut débit. Des amorces PCR peuvent être conçues et synthétisées comme décrit dans le protocole écrit, à l'aide de scripts internes basés sur la séquence du génome de Streptococcus sanguinis SK36. Trois jeux d'amorces ont été conçus pour amplifier la séquence amont d'un kilobase du gène cible, le gène ENC codant la protéine de résistance à la kanamycine APHA3, et la séquence aval d'un kilobase du gène cible.Amorces spécifiques au gène. R un et F trois sont conçues à partir des séquences en 5' et en 3' du gène cible afin d'amplifier en haut débit la région située à un kilobase en amont ou en aval des gènes sanguins cibles. Préparez d'abord un mélange de réaction de PCR sur de la glace dans un tube conique de 15 millilitres.Voir le texte pour les composants du mélange de PCR contenant l'ADN génomique sanguin ; transférer 23 microlitres du mélange dans chaque puits d'une plaque PCR 96 puits à l'aide d'une pipette multicanal. Pour la séquence amont du gène cible, ajouter un microlitre de chacun des amorces F1 et R1 provenant de plaques d'amorces de travail à 10 micromolaire dans la plaque de PCR à l'aide de la pipette multicanal. Procéder de la même manière avec les amorces F3 et R3 pour amplifier la séquence aval du gène cible. Sceller la plaque de PCR et effectuer l'amplification à 94 degrés Celsius pendant une minute, suivie de 30 cycles à 94 degrés Celsius pendant 30 secondes.54 degrés Celsius pendant 30 secondes et 68 degrés Celsius pendant 1,5 minute. Après amplification, préparer un gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium, avec 48 puits adaptés au chargement à l'aide d'une pipette multicanal. Mélanger quatre microlitres du produit de PCR avec un microlitre de tampon de charge d'ADN 5X.Sur une plaque de 96 puits, déposez les échantillons sur un gel d'agarose à l'aide d'une pipette multicanal de 10 microlitres. Effectuez l'électrophorèse à 135 volts pendant 30 minutes. Examinez les bandes sur le gel à l'aide d'un système de documentation et d'analyse UVP.Purifiez les produits PCR à l'aide du kit de purification PCR Pure Link 96 en suivant les instructions du fabricant pour l'élution de l'ADN, en utilisant la centrifugation. Ajoutez 40 microlitres d'eau doublement distillée stérile dans chaque puits de la plaque de liaison. Sélectionnez aléatoirement plusieurs amplicons purifiés sur la plaque afin d'examiner les concentrations d'ADN.À l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop, ajustez la concentration des amplicons sur la plaque à environ 10 nanogrammes par microlitre. Ensuite, utilisez eco R un pour digérer un plasmide contenant la résistance à la kanamycine gisette afin qu’il puisse servir de matrice pour la PCR. Purifiez le plasmide digéré à l’aide du kit de purification rapide kayak PCR et ajustez l’ADN plasmidique linéaire à une concentration finale en ADN de 10 nanogrammes par microlitre.Constituez un mélange de PCR de 25 microlitres pour l'amplicon du cassette de résistance à la kanamycine, incluant les amorces F deux et R deux telles que listées dans la procédure écrite. En parallèle de cette vidéo, procédez à l'amplification par PCR comme indiqué ici. Pour analyser le produit de PCR, réalisez une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %.Ensuite, regrouper un ensemble d'amplimères du cassette de résistance à la cany provenant de 10 individus purifiés par PCR. Ajuster la concentration en amplimères à 10 nanogrammes par microlitre. L'aspect le plus difficile de cette procédure consiste à obtenir l'amplicon linéaire compétent final à partir de ses trois amplimères de PCR respectifs.Pour assurer le succès, les trois amorces de PCR sont ajustées à des quantités quasi équivalentes. Combiner un microlitre de chacune des trois amorces de PCR à 10 nanogrammes par microlitre dans une même plaque de PCR, ainsi que le gabarit d'ADN pour la PCR. Préparer ensuite le mélange de PCR, comprenant les amorces F1 et R3 indiquées dans le protocole écrit.Ensuite, réalisez une amplification par PCR des échantillons. Analysez les AMPLICONS DE PCR sur un gel d'agarose après purification et quantification des amplicons de PCR. Comme précédemment, congélez les amplicons de PCR recombinés à moins vingt degrés Celsius.Pour commencer, préparez le milieu Todd Hewitt et sérum de cheval comme indiqué dans la procédure écrite accompagnant cette vidéo ; aliquotez deux millilitres de milieu et 10 millilitres de milieu dans deux tubes coniques de 15 millilitres. Inoculez cinq microlitres de la souche congelée à –80 °C de s. sanguinis SK 36 décongelée dans deux millilitres de milieu. Incubez la culture hermétiquement fermée toute la nuit à 37 °C.Pré-incuber également le tube de milieu de 10 millilitres dans les mêmes conditions après une incubation nocturne. Transférer 50 microlitres de la culture dans le tube de milieu de 10 millilitres. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant trois heures.Immédiatement après l'incubation, ajouter deux microlitres de 70 nanogrammes de peptide stimulateur de la compétence sanguineux SK 36 et deux microlitres d'amplicon PCR recombinant linéaire dans des tubes einor placés sur un bloc de 96 puits, puis préchauffer à 37 degrés Celsius. Transférer 330 microlitres de la culture de SK 36 incubée pendant trois heures dans chaque tube. Remplacer l'ADN par de l'eau doublement distillée stérile comme témoin.Incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure après incubation. Placer le bloc sur de la glace, étaler 100 microlitres de chaque transformation sur des boîtes de gélose au bouillon cerveau-cœur ou gélose BHI contenant 500 microgrammes par millilitre de canamycine, puis incuber les boîtes à 37 degrés Celsius pendant deux jours dans des conditions microaérophiles. Pour chaque mutant de remplacement, prélever aléatoirement deux colonies individuelles et inoculer chaque colonie dans cinq millilitres de BHI contenant 500 microgrammes par millilitre de canamycine. Incuber chaque inoculum toute la nuit à 37 degrés Celsius dans des conditions microanaérobies.Effectuez la cryoconservation de chaque culture dans du glycérol à 30 % à moins 80 degrés Celsius. Pour vérifier si le mutant contient le remplacement génique attendu, réalisez une PCR sur colonies pour chaque mutant en utilisant les amorces F1 et R3 dans une plaque PCR de 96 puits.Utilisez environ un microlitre de culture de nuit provenant de chaque colonie individuelle comme matrice d'ADN dans une réaction d'amplification PCR de 25 microlitres. Procédez ensuite à l'amplification PCR afin de confirmer le remplacement du gène muté pour identifier précisément les mutants à double bande ou les amplicons PCR contaminants. Analysez l'amplicon PCR par électrophorèse sur gel pendant quatre heures sur un gel de plus de 12 centimètres de longueur.Gel d'agarose à 2 % avec une coloration au bromure d'éthidium en électrophorèse sur ce gel d'agarose. Tous les amplicons présentant une différence supérieure ou égale à 100 paires de bases peuvent être clairement identifiés. Alternativement, lorsque les bandes résultant de l'amplification de la cassette de résistance à la kanamycine et du gène sauvage sont censées différer de moins de 100 paires de bases, utilisez un primateur interne T1 du gène cible pour déterminer si un gène sauvage peut être détecté par PCR.Pour confirmer davantage la délétion, purifiez les amplicons à l’aide du kit de purification PCR Pure Link 96 et séquençez avec l’amorce P one, qui se fixe sur le cassette de résistance à la kanamycine. Conservez uniquement les mutants corrects confirmés par séquençage après amplification PCR à l’aide des amorces F1 et R one pour la séquence en amont, et F three et R three pour la séquence en aval. Environ un kilobase en amont et en aval de chaque gène de s. sanguineous a été obtenue en format 96 puits selon les conditions de PCR et avec les amorces conçues.Un produit spécifique a été amplifié à partir de l'ADN génomique sanguineux lors de chaque réaction de PCR, indiquant que les amorces étaient hautement spécifiques aux cibles de s sanguine par réamplification PCR à l'aide des amorces F1 et R3 et de trois amplicons comme matrices d'ADN. Des constructions de PCR recombinante linéaires ont été créées en haut débit. Sur une plaque de 96 puits composée, dans l'ordre, d'une région en amont de chaque gène cible, d'un cassette cany et d'une région en aval de chaque gène cible, les constructions de PCR recombinante ont ensuite été transformées dans s sanguine SK36 et sélectionnées par cany sur des géloses BHI.Pour la majorité des transformations, plus de 1000 colonies ont été obtenues sur chaque plaque après une incubation microaérobie de deux jours. Lorsque ces colonies ont été amplifiées par PCR à l'aide des amorces F1 et R3, une seule bande d'ADN correspondant à la taille attendue du mutant a été observée par électrophorèse sur gel lors de tentatives de suppression de gènes potentiellement essentiels. Aucune colonie ne devrait être obtenue dans la majorité des transformations lors de la suppression de certains gènes essentiels.Cependant, des colonies ont tout de même été obtenues après la transformation, et après amplification par PCR de ces colonies à l’aide des amorces F1 et R3, deux bandes d’ADN 2D correspondant à la taille attendue du mutant et à celle du type sauvage sont apparues, comme révélé par électrophorèse sur gel. Pour certains mutants, la taille attendue du produit d’amplification du mutant et celle du gène de type sauvage étaient trop proches pour être séparées par un gel d’agarose long. Dans ce cas, une amorce interne T1 du gène cible a été conçue à partir de la séquence du gène de type sauvage.La PCR a été réalisée à l'aide de l'amorce interne T une et de l'amorce F1. La souche sauvage SK 36 a été utilisée comme témoin positif pour cette PCR. Si une bande de la taille attendue était amplifiée à partir du mutant en utilisant l'amorce interne, le gène était identifié comme un gène essentiel.Étant donné que la présence du cassette de canamycine dans le mutant avait été confirmée précédemment par séquençage de l'ADN à l'aide de l'amorce P one. Selon ce protocole, 2048 mutants de gènes non essentiels de S. sanguineus ont été collectés. En excluant les quatre cadres de lecture situés entièrement à l'intérieur d'autres cadres de lecture.218&nbsp;gènes, essentiels à la survie de s sanguine, ont été identifiés dans les conditions expérimentales. Après avoir visionné ces vidéos, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser une analyse à l'échelle du génome. Les ions géniques utilisent la PCR à haut débit.

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