La délétion de gènes dans le génome entier Streptococcus sanguinis Par PCR à haut débit

L’objectif global de cette procédure est de faire des délétions d’un seul gène à l’échelle du génome chez le streptocoque sanguin par PCR à haut débit. Ceci est accompli en obtenant d’abord trois amplicons par amplification PCR à haut débit, y compris le gène de résistance aux antibiotiques, ainsi que les séquences d’ADN en amont et en aval du gène cible. La deuxième étape consiste à obtenir l’amplicon PCR recombinant linéaire en utilisant trois amplicons PCR comme matrices.

Ensuite, les cellules sanguines compétentes sont préparées. La dernière étape consiste à transformer l’amplicon linéaire recombinant de la PCR en cellules sanguines compétentes. En fin de compte, l’amplification PCR du côlon A et le séquençage de l’ADN sont utilisés pour vérifier les bons mutants.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes épuisées comme l’inactivation du plasmide suicide, est que cette méthode peut créer le mutant de délétion à l’échelle du génome directement en utilisant un débit élevé. Les amorces PCR peuvent être conçues et synthétisées comme décrit dans le protocole écrit à l’aide de scripts internes basés sur la séquence génomique du streptocoque sanguin SK 36. Trois ensembles d’amorces ont été conçus pour l’amplification de la séquence d’un kilobase en amont du gène cible, du codage ENC à trois gènes A PHA, de la protéine de résistance à la kanamycine et de la séquence d’un kilobase en aval du gène cible.

Amorces spécifiques aux gènes. R un et F trois sont conçus sur la base des cinq séquences premières et trois séquences premières du gène cible pour amplifier à haut débit la région d’une kilobase en amont ou en aval des gènes sanguins cibles. Assemblez d’abord un mélange de cocktail PCR sur de la glace dans un tube conique de 15 millilitres.

Voir le texte pour les composants du mélange PCR contenant le transfert d’ADN génomique sanguin de 23 microlitres du mélange dans chaque puits d’une plaque PCR de 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux pour la séquence amont du transfert de gène cible d’un microlitre de F1 et d’un microlitre de R, un de 10 plaques d’amorce de travail micromolaire à la plaque de PCR à l’aide de la pipette multicanaux. Faites de même avec les amorces F trois et R trois pour amplifier la séquence en aval du gène cible. Scellez la plaque PCR et effectuez une amplification à 94 degrés Celsius pendant une minute, suivie de 30 cycles à 94 degrés Celsius pendant 30 secondes.

54 degrés Celsius pendant 30 secondes et 68 degrés Celsius pendant 1,5 minute. Après amplification, préparer un gel à 1 % d’aros contenant un bromure d’ajustement avec un chargement de pipette multicanaux à 48 puits. Mélangez quatre microlitres du produit PCR avec un microlitre de cinq tampons de chargement XDNA.

Sur une plaque de 96 puits, chargez les échantillons sur un gel aros à l’aide d’une pipette multicanaux de 10 microlitres. Faites fonctionner l’électrophorèse à 135 volts pendant 30 minutes. Examinez la bande sur gel dans le cadre d’un système de documentation et d’analyse UVP.

Purifiez les produits PCR à l’aide du kit de purification PCR pure link 96 par centrifugation conformément aux instructions du fabricant pour l’élimination de l’ADN. Ajoutez 40 microlitres d’eau stérile double distillée dans chaque puits de la plaque de liaison. Choisissez au hasard plusieurs amplicons purifiés sur la plaque pour examiner les concentrations d’ADN.

À l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop, ajustez la concentration d’amplicons sur la plaque à environ 10 nanogrammes par microlitre. Ensuite, utilisez eco R one pour digérer un plasmide contenant la gisette de résistance à la kanamycine afin qu’il puisse servir de modèle PCR. Purifiez le plasmide digéré à l’aide du kit de purification PCR rapide kayak et ajustez l’ADN plasmidique linéaire à la concentration finale d’ADN de 10 nanogrammes par microlitre.

Assembler un mélange PCR de 25 microlitres pour la résistance à la kanamycine Cassette amplicon, y compris les amorces F deux et R deux comme indiqué dans la procédure écrite. Accompagnant cette vidéo, procédez à l’amplification PCR comme indiqué ici. Pour examiner le produit PCR, effectuez une électrophorèse sur gel sur un gel à 1 %.

Ensuite, mettez en commun une grande partie des amplicons de la cassette de résistance cany provenant de 10 individus purifiés par PCR. Ajustez la concentration d’amplicon à 10 nanogrammes par microlitre. L’aspect le plus difficile de cette procédure est d’obtenir le dernier demandeur PCR linéairement compétent à partir de ses trois candidats PCR t.

Pour assurer le succès, les trois candidats au PCR sont ajustés à un nombre presque égal. Combinez un microlitre chacun des trois aons PCR de 10 nanogrammes par microlitre dans une plaque PCR, ainsi que le modèle PCR. Préparez ensuite le mélange PCR, y compris les amorces F1 et R trois comme indiqué dans la procédure écrite.

Ensuite, effectuez une amplification PCR des échantillons. Examiner les AMPLICONS PCR sur un gel après purification et quantification des amplicons PCR. Comme précédemment, congelez les amplicons PCR recombinés à moins 20 degrés Celsius.

Pour commencer, préparez le sérum de Todd Hewitt et de cheval comme indiqué dans la procédure écrite accompagnant cette vidéo aliquote deux millilitres de milieu et 10 millilitres de milieu dans deux tubes coniques de 15 millilitres. Inoculez cinq microlitres de sanguine SK 36 décongelée qui avait été congelée à moins 80 degrés Celsius dans deux millilitres de milieu. Incuber la culture bien coiffée pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Pré-incubez également le tube moyen de 10 millilitres dans les mêmes conditions après une nuit d’incubation. Transférez 50 microlitres de la culture dans le tube moyen de 10 millilitres. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant trois heures.

Immédiatement après l’incubation, ajoutez deux microlitres de 70 nanogrammes de peptide sanguin SK 36 stimulant la compétence et deux microlitres d’amplicon PCR recombinant linéaire à des tubes einor sur un bloc de 96 puits et avant-guerre à 37 degrés Celsius. Transférez 330 microlitres de la culture SK 36 incubée pendant trois heures dans chaque tube. Remplacez l’ADN par de l’eau stérile double distillée comme contrôle.

Incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure après l’incubation. Placez le bloc sur de la glace, étalez 100 microlitres de chaque transformation sur des plaques de perfusion cerveau-cœur ou de gélose BHI avec 500 microgrammes par millilitre de mycine en conserve, incubez les plaques à 37 degrés Celsius pendant deux jours dans des conditions micro-aérobies pour chaque mutant de remplacement, prélevez au hasard deux colonies individuelles et inoculez chaque colonie dans cinq millilitres de BHI contenant 500 microgrammes par millilitre de cany. Incuber chaque inoculum pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans des conditions micro-anaérobies.

Cryoconservez chaque culture dans 30 % de glycérol à moins 80 degrés Celsius. Examiner si le mutant contient le remplacement de gène attendu. Effectuez une PCR de colonie pour chaque mutant à l’aide de trois amorces F1 et R dans une plaque de PCR à 96 puits.

Utilisez environ un microlitre de culture nocturne de chaque colonie individuelle comme matrice d’ADN dans une réaction d’amplification PCR de 25 microlitres. Procédez à l’amplification PCR pour confirmer le remplacement du gène mutant afin d’identifier précisément les mutants à double bande ou l’amplicon PCR contaminant. Examinez l’amplicon PCR par électrophorèse sur gel pendant quatre heures sur une longueur supérieure à 12 centimètres.

Gel 2 %aros avec une coloration au bromure sous cette condition d’électrophorèse en gel Agros. Tous les amplicons dont la différence est supérieure ou égale à 100 paires de bases peuvent être clairement identifiés. Par ailleurs, lorsque l’on s’attend à ce que les bandes résultant de l’amplification de la cassette de résistance à la kanamycine et du gène de type sauvage diffèrent de moins de 100 paires de bases, utilisez une amorce interne T un du gène cible pour déterminer si un gène de type sauvage peut être détecté par PCR.

Pour confirmer davantage la délétion, purifiez les amplicons à l’aide du kit de purification PCR pure link 96 et séquencez la séquence à l’aide de l’amorce P one, qui se lie à la cassette de résistance à la kanamycine, ne conservez que les mutants corrects confirmés par séquençage après amplification PCR à l’aide des amorces F1 et R un pour la séquence amont et F trois et R trois pour la séquence aval. Environ une kilobase en amont et en aval de chaque gène sanguin a été obtenue dans 96. Format du puits dans les conditions de PCR et à l’aide des amorces conçues.

Un produit spécifique a été amplifié à partir de l’ADN génomique sanguin dans chaque réaction de PCR, ce qui a indiqué que les amorces étaient très spécifiques aux cibles de la sanguine par réamplification par PCR en utilisant les amorces F1 et R trois et trois amplicons comme matrices d’ADN. Des constructions PCR recombinantes linéaires ont été créées avec un débit élevé. Sur une plaque à 96 puits composée d’une région en amont de chaque gène cible, d’une cassette cany et d’une région en aval de chaque gène cible dans cet ordre, les constructions PCR recombinantes ont ensuite été transformées en SK 36 sanguin et sélectionnées par cany sur des plaques de gélose BHI.

Pour la majorité des transformations, plus de 1000 colonies ont été obtenues sur chaque plaque après une incubation micro-aérobie de deux jours. Lorsque ces colonies ont été amplifiées par PCR à l’aide de F1 et R trois, une seule bande d’ADN correspondant à la taille attendue du mutant a été observée par électrophorèse sur gel lors d’une tentative de suppression de gènes essentiels potentiels. Aucune colonie ne doit être obtenue dans la majorité des transformations pour la délétion de certains gènes essentiels.

Cependant, des colonies ont tout de même été obtenues après transformation après amplification PCR de ces colonies à l’aide de trois bandes NA 2D F1 et R correspondant à la taille de mutant attendue et la taille de type sauvage apparue comme révélé par électrophorèse sur gel. Pour certains mutants, la taille attendue du mutant et la taille de type sauvage de l’amplicon PCR étaient trop proches pour être séparées par un long gel agros. Dans ce cas, une amorce interne T one du gène cible a été conçue sur la base de la séquence du gène de type sauvage.

La PCR a été réalisée à l’aide de l’amorce interne T one et de l’amorce F1. Le type sauvage SK 36 a été utilisé comme souche témoin positive pour cette PCR. Si une bande de la taille attendue était amplifiée à partir du mutant à l’aide de l’amorce interne, le gène était identifié comme un gène essentiel.

Depuis que la présence de la cassette de mycine peut chez le mutant a été confirmée précédemment par le séquençage de l’ADN à l’aide de l’amorce P one. Sur la base de ce protocole, 2048 mutants non essentiels du gène sanguineux S ont été collectés. À l’exclusion des quatre cadres de lecture ouverts entièrement contenus dans d’autres cadres de lecture ouverts.

218 gènes, essentiels à la survie sanguine, ont été identifiés dans les conditions expérimentales. Après avoir regardé ces vidéos, je pense que vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de rendre le génome large. Les ions gènes utilisent la PCR à haut débit.