La délétion de gènes dans le génome entier

L'objectif général de cette procédure est de réaliser des délétions génomiques de gènes uniques chez Streptococcus sanguinis par PCR à haut débit. Cela est accompli en obtenant d'abord trois amplicons par amplification PCR à haut débit, incluant le gène de résistance à l'antibiotique ainsi que les séquences d'ADN en amont et en aval du gène cible. La deuxième étape consiste à obtenir l'amplicon linéaire recombinant par PCR en utilisant les trois amplicons PCR comme matrices.

Ensuite, les cellules compétentes de s sanguine sont préparées. La dernière étape consiste à transformer l'amplicon PCR recombinant linéaire dans des cellules compétentes de s sanguineous. Finalement, une amplification PCR de colon A et un séquençage de l'ADN sont utilisés pour vérifier les mutants corrects.

L'avantage principal de cette technique par rapport aux autres méthodes épuisantes comme le knock-out par plasmide suicide est qu'elle permet de créer directement un mutant de délétion à l'échelle du génome en utilisant un criblage à haut débit. Des amorces PCR peuvent être conçues et synthétisées comme décrit dans le protocole écrit, à l'aide de scripts internes basés sur la séquence du génome de Streptococcus sanguinis SK36. Trois jeux d'amorces ont été conçus pour amplifier la séquence amont d'un kilobase du gène cible, le gène ENC codant la protéine de résistance à la kanamycine APHA3, et la séquence aval d'un kilobase du gène cible.

Amorces spécifiques au gène. R un et F trois sont conçues à partir des séquences en 5' et en 3' du gène cible afin d'amplifier en haut débit la région située à un kilobase en amont ou en aval des gènes sanguins cibles. Préparez d'abord un mélange de réaction de PCR sur de la glace dans un tube conique de 15 millilitres.

Voir le texte pour les composants du mélange de PCR contenant l'ADN génomique sanguin ; transférer 23 microlitres du mélange dans chaque puits d'une plaque PCR 96 puits à l'aide d'une pipette multicanal. Pour la séquence amont du gène cible, ajouter un microlitre de chacun des amorces F1 et R1 provenant de plaques d'amorces de travail à 10 micromolaire dans la plaque de PCR à l'aide de la pipette multicanal. Procéder de la même manière avec les amorces F3 et R3 pour amplifier la séquence aval du gène cible. Sceller la plaque de PCR et effectuer l'amplification à 94 degrés Celsius pendant une minute, suivie de 30 cycles à 94 degrés Celsius pendant 30 secondes.

54 degrés Celsius pendant 30 secondes et 68 degrés Celsius pendant 1,5 minute. Après amplification, préparer un gel d'agarose à 1 % contenant du bromure d'éthidium, avec 48 puits adaptés au chargement à l'aide d'une pipette multicanal. Mélanger quatre microlitres du produit de PCR avec un microlitre de tampon de charge d'ADN 5X.

Sur une plaque de 96 puits, déposez les échantillons sur un gel d'agarose à l'aide d'une pipette multicanal de 10 microlitres. Effectuez l'électrophorèse à 135 volts pendant 30 minutes. Examinez les bandes sur le gel à l'aide d'un système de documentation et d'analyse UVP.

Purifiez les produits PCR à l'aide du kit de purification PCR Pure Link 96 en suivant les instructions du fabricant pour l'élution de l'ADN, en utilisant la centrifugation. Ajoutez 40 microlitres d'eau doublement distillée stérile dans chaque puits de la plaque de liaison. Sélectionnez aléatoirement plusieurs amplicons purifiés sur la plaque afin d'examiner les concentrations d'ADN.

À l’aide d’un spectrophotomètre NanoDrop, ajustez la concentration des amplicons sur la plaque à environ 10 nanogrammes par microlitre. Ensuite, utilisez eco R un pour digérer un plasmide contenant la résistance à la kanamycine gisette afin qu’il puisse servir de matrice pour la PCR. Purifiez le plasmide digéré à l’aide du kit de purification rapide kayak PCR et ajustez l’ADN plasmidique linéaire à une concentration finale en ADN de 10 nanogrammes par microlitre.

Constituez un mélange de PCR de 25 microlitres pour l'amplicon du cassette de résistance à la kanamycine, incluant les amorces F deux et R deux telles que listées dans la procédure écrite. En parallèle de cette vidéo, procédez à l'amplification par PCR comme indiqué ici. Pour analyser le produit de PCR, réalisez une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %.

Ensuite, regrouper un ensemble d'amplimères du cassette de résistance à la cany provenant de 10 individus purifiés par PCR. Ajuster la concentration en amplimères à 10 nanogrammes par microlitre. L'aspect le plus difficile de cette procédure consiste à obtenir l'amplicon linéaire compétent final à partir de ses trois amplimères de PCR respectifs.

Pour assurer le succès, les trois amorces de PCR sont ajustées à des quantités quasi équivalentes. Combiner un microlitre de chacune des trois amorces de PCR à 10 nanogrammes par microlitre dans une même plaque de PCR, ainsi que le gabarit d'ADN pour la PCR. Préparer ensuite le mélange de PCR, comprenant les amorces F1 et R3 indiquées dans le protocole écrit.

Ensuite, réalisez une amplification par PCR des échantillons. Analysez les AMPLICONS DE PCR sur un gel d'agarose après purification et quantification des amplicons de PCR. Comme précédemment, congélez les amplicons de PCR recombinés à moins vingt degrés Celsius.

Pour commencer, préparez le milieu Todd Hewitt et sérum de cheval comme indiqué dans la procédure écrite accompagnant cette vidéo ; aliquotez deux millilitres de milieu et 10 millilitres de milieu dans deux tubes coniques de 15 millilitres. Inoculez cinq microlitres de la souche congelée à –80 °C de s. sanguinis SK 36 décongelée dans deux millilitres de milieu. Incubez la culture hermétiquement fermée toute la nuit à 37 °C.

Pré-incuber également le tube de milieu de 10 millilitres dans les mêmes conditions après une incubation nocturne. Transférer 50 microlitres de la culture dans le tube de milieu de 10 millilitres. Incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant trois heures.

Immédiatement après l'incubation, ajouter deux microlitres de 70 nanogrammes de peptide stimulateur de la compétence sanguineux SK 36 et deux microlitres d'amplicon PCR recombinant linéaire dans des tubes einor placés sur un bloc de 96 puits, puis préchauffer à 37 degrés Celsius. Transférer 330 microlitres de la culture de SK 36 incubée pendant trois heures dans chaque tube. Remplacer l'ADN par de l'eau doublement distillée stérile comme témoin.

Incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure après incubation. Placer le bloc sur de la glace, étaler 100 microlitres de chaque transformation sur des boîtes de gélose au bouillon cerveau-cœur ou gélose BHI contenant 500 microgrammes par millilitre de canamycine, puis incuber les boîtes à 37 degrés Celsius pendant deux jours dans des conditions microaérophiles. Pour chaque mutant de remplacement, prélever aléatoirement deux colonies individuelles et inoculer chaque colonie dans cinq millilitres de BHI contenant 500 microgrammes par millilitre de canamycine. Incuber chaque inoculum toute la nuit à 37 degrés Celsius dans des conditions microanaérobies.

Effectuez la cryoconservation de chaque culture dans du glycérol à 30 % à moins 80 degrés Celsius. Pour vérifier si le mutant contient le remplacement génique attendu, réalisez une PCR sur colonies pour chaque mutant en utilisant les amorces F1 et R3 dans une plaque PCR de 96 puits.

Utilisez environ un microlitre de culture de nuit provenant de chaque colonie individuelle comme matrice d'ADN dans une réaction d'amplification PCR de 25 microlitres. Procédez ensuite à l'amplification PCR afin de confirmer le remplacement du gène muté pour identifier précisément les mutants à double bande ou les amplicons PCR contaminants. Analysez l'amplicon PCR par électrophorèse sur gel pendant quatre heures sur un gel de plus de 12 centimètres de longueur.

Gel d'agarose à 2 % avec une coloration au bromure d'éthidium en électrophorèse sur ce gel d'agarose. Tous les amplicons présentant une différence supérieure ou égale à 100 paires de bases peuvent être clairement identifiés. Alternativement, lorsque les bandes résultant de l'amplification de la cassette de résistance à la kanamycine et du gène sauvage sont censées différer de moins de 100 paires de bases, utilisez un primateur interne T1 du gène cible pour déterminer si un gène sauvage peut être détecté par PCR.

Pour confirmer davantage la délétion, purifiez les amplicons à l’aide du kit de purification PCR Pure Link 96 et séquençez avec l’amorce P one, qui se fixe sur le cassette de résistance à la kanamycine. Conservez uniquement les mutants corrects confirmés par séquençage après amplification PCR à l’aide des amorces F1 et R one pour la séquence en amont, et F three et R three pour la séquence en aval. Environ un kilobase en amont et en aval de chaque gène de s. sanguineous a été obtenue en format 96 puits selon les conditions de PCR et avec les amorces conçues.

Un produit spécifique a été amplifié à partir de l'ADN génomique sanguineux lors de chaque réaction de PCR, indiquant que les amorces étaient hautement spécifiques aux cibles de s sanguine par réamplification PCR à l'aide des amorces F1 et R3 et de trois amplicons comme matrices d'ADN. Des constructions de PCR recombinante linéaires ont été créées en haut débit. Sur une plaque de 96 puits composée, dans l'ordre, d'une région en amont de chaque gène cible, d'un cassette cany et d'une région en aval de chaque gène cible, les constructions de PCR recombinante ont ensuite été transformées dans s sanguine SK36 et sélectionnées par cany sur des géloses BHI.

Pour la majorité des transformations, plus de 1000 colonies ont été obtenues sur chaque plaque après une incubation microaérobie de deux jours. Lorsque ces colonies ont été amplifiées par PCR à l'aide des amorces F1 et R3, une seule bande d'ADN correspondant à la taille attendue du mutant a été observée par électrophorèse sur gel lors de tentatives de suppression de gènes potentiellement essentiels. Aucune colonie ne devrait être obtenue dans la majorité des transformations lors de la suppression de certains gènes essentiels.

Cependant, des colonies ont tout de même été obtenues après la transformation, et après amplification par PCR de ces colonies à l’aide des amorces F1 et R3, deux bandes d’ADN 2D correspondant à la taille attendue du mutant et à celle du type sauvage sont apparues, comme révélé par électrophorèse sur gel. Pour certains mutants, la taille attendue du produit d’amplification du mutant et celle du gène de type sauvage étaient trop proches pour être séparées par un gel d’agarose long. Dans ce cas, une amorce interne T1 du gène cible a été conçue à partir de la séquence du gène de type sauvage.

La PCR a été réalisée à l'aide de l'amorce interne T une et de l'amorce F1. La souche sauvage SK 36 a été utilisée comme témoin positif pour cette PCR. Si une bande de la taille attendue était amplifiée à partir du mutant en utilisant l'amorce interne, le gène était identifié comme un gène essentiel.

Étant donné que la présence du cassette de canamycine dans le mutant avait été confirmée précédemment par séquençage de l'ADN à l'aide de l'amorce P one. Selon ce protocole, 2048 mutants de gènes non essentiels de S. sanguineus ont été collectés. En excluant les quatre cadres de lecture situés entièrement à l'intérieur d'autres cadres de lecture.

218 gènes, essentiels à la survie de s sanguine, ont été identifiés dans les conditions expérimentales. Après avoir visionné ces vidéos, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser une analyse à l'échelle du génome. Les ions géniques utilisent la PCR à haut débit.