Isoler des cellules mélanocytes comme primaires du Cœur de souris

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des cellules viables de type mélanocyte cardiaque à partir du cœur de souris. Cette isolation est réalisée en prélevant d'abord les cœurs de souris euthanasiées. La deuxième étape consiste à hacher finement les cœurs et à dissocier les cellules à l'aide d'une digestion enzymatique et d'une agitation mécanique.

Ensuite, la suspension cellulaire est centrifugée et le culot contenant les cardiomyocytes et les cellules de type mélanocyte est resuspendu. La dernière étape consiste à ensemencer et cultiver les cellules. Les cellules finalement isolées, de type mélanocyte cardiaque, peuvent être utilisées pour des études en configuration patch ou pour des analyses par puces à ADN afin d'évaluer l'excitabilité cellulaire ou l'état du transcriptome en réponse à un stress pathophysiologique.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes destinées à isoler et cultiver les cardiomyocytes est qu'elle permet d'obtenir une isolation de nombreuses cellules similaires à des mélanocytes cardiaques viables. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons découvert une nouvelle population cellulaire dans le cœur de souris, et que nous avons souhaité étudier sa physiologie. Pour commencer, préparez deux jeux d'instruments chirurgicaux stérilisés, un pour la dissection des cœurs et un autre pour la découpe du tissu.

Ensuite, préparez les suppléments du milieu, mais attendez à les ajouter au milieu de culture qu'immédiatement avant la mise en place des cellules. Après avoir préparé le filtre du milieu de culture afin de stériliser la solution tout en travaillant sous une hotte de culture tissulaire, conservez le milieu à quatre degrés Celsius. Préparez la solution d'ADN numéro un en ajoutant 0,05 gramme d'ADN à 100 millilitres de DPBS contenant 10 % de FBS et des antibiotiques.

Ensuite, préparez une solution de trypsine à 0,5 % en ajoutant 0,5 gramme de trypsine à 100 millilitres de DPBS contenant des antibiotiques. Enfin, rassemblez les autres équipements nécessaires pour réaliser la procédure, notamment des boîtes de Pétri, des tubes coniques de 50 millilitres, des filtres cellulaires de 40 microns, du DPBS avec antibiotiques, ainsi que des boîtes de culture de 60 et 35 millimètres. Après avoir euthanasié des souriceaux néonatals de P0 à P2, nettoyez leur poitrine avec de l’alcool et placez-les dans une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant du DPBS. En travaillant sous un microscope stéréo, ouvrez soigneusement la cavité thoracique et retirez l’ensemble du cœur avec les oreillettes encore attachées.

Lavez les cœurs dans le DPBS et transférez-les dans une nouvelle boîte de Pétri de 10 centimètres. Placez la boîte de Pétri contenant les cœurs excisés dans une hotte de culture tissulaire et suivez une technique stérile pour les étapes suivantes. Commencez par laver les cœurs trois fois dans du DPBS stérile additionné d'antibiotiques.

Placer les cœurs dans une boîte de culture de 60 millimètres et ajouter six à huit millilitres de solution de trips à 0,5 %. Ensuite, couper les cœurs en petits morceaux et les incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Une fois l'incubation terminée, prélever la solution résultante dans la boîte et la transférer dans un tube conique stérile de 10 millilitres.

À l’aide d’une pipette stérile de 10 millilitres, agiter rapidement mais doucement la solution de 30 à 50 fois, filtrer la suspension obtenue à travers un tamis cellulaire de 40 microns dans un nouveau tube conique propre de 50 millilitres. Après centrifugation, aspirer délicatement le surnageant et resuspendre le culot restant dans six à huit millilitres de DPBS stérile. Répéter cette étape deux fois supplémentaires.

Après le troisième rinçage suivant la centrifugation, éliminer soigneusement le solution de lavage par décantation ou aspiration, puis resuspendre le culot dans six millilitres de milieu de culture supplémenté. Ensuite, prélever la solution resuspendue à l’aide d’une pipette de transfert stérile et placer les cellules dans une boîte de 35 millimètres. Prélever les cellules cardiaques isolées provenant de trois souris néonatales après une incubation nocturne, aspirer le milieu de culture ainsi que les cellules non attachées, rincer ensuite les boîtes une fois avec du DPBS, ajouter du milieu frais aux boîtes et renouveler le milieu.

Tous les deux jours, les cellules isolées de cœurs néonatals ou embryonnaires peuvent être conservées en culture jusqu'à trois semaines, tandis que les cellules isolées de cœurs adultes peuvent être maintenues en culture jusqu'à 10 jours. Pour isoler des cellules semblables à des mélanocytes à partir du cœur d'une souris adulte, commencez par laver les cœurs prélevés dans du DPBS stérile contenant des antibiotiques sous une hotte de culture tissulaire. Pressez légèrement le cœur avec des pinces de dissection courbes pour éliminer tout sang résiduel, puis rincez à nouveau le cœur une fois dans du DPBS.

Ensuite, retirez les oreillettes et l'anneau auriculo-ventriculaire des cœurs et placez les échantillons de tissu excisés dans une boîte de 35 millimètres. Coupez les cœurs en petits morceaux à l’aide de ciseaux courbes et de pinces. Ajoutez six à huit millilitres de solution de tripsine 0,5 % dans la boîte et incubez à 37 degrés Celsius pendant 45 à 60 minutes.

Après l'incubation, répétez les étapes montrées précédemment pour obtenir une suspension de cellules cardiaques adultes et les plaquer comme auparavant. Dans cet exemple, la flèche blanche identifie le mélanocyte cardiaque dans les deux panneaux. Notez qu'en l'absence de marqueur fluorescent, il est difficile d'identifier le mélanocyte cardiaque et de le distinguer des myocytes auriculaires attachés à la boîte ; la flèche en pointe bleu clair indique des cellules auriculaires mal attachées à la boîte, illustrées ici, un mélanocyte cardiaque sain isolé du cœur d'une souris néonatale.

Ils ont développé des prolongements dendritiques étendus et ressemblent étroitement aux mélanocytes cutanés. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des cellules mélanocytes viables à partir du cœur.

Ce sera adapté à l'analyse physiologique et moléculaire.