Imagerie par résonance magnétique (IRMf) avec une stimulation auditive chez les oiseaux chanteurs

L'objectif général de cette procédure est de démontrer un protocole optimisé permettant une visualisation réussie de la perception et du traitement du son dans les régions auditives et de contrôle du chant du cerveau des oiseaux chanteurs. À l'aide de l'IRM fonctionnelle, cela est réalisé en préparant tout d'abord des stimuli auditifs de bonne qualité, qui peuvent être intégrés dans un paradigme en blocs alternés (on-off) et présentés à l'oiseau pendant l'acquisition d'images par IRM fonctionnelle ou FMRI. La deuxième étape consiste à préparer l'oiseau pour l'exploration en l'anesthésiant d'abord, puis en le positionnant sur un lit animalier adapté, qui est ensuite placé dans le tunnel de l'appareil d'IRM. Ensuite, des images FMRI peuvent être acquises pendant la stimulation auditive.

La dernière étape consiste à prétraiter les données IRM acquises, y compris la normalisation des images à l'atlas du moineau zébré. En fin de compte, une analyse statistique basée sur les voxels est utilisée pour permettre la visualisation des résultats obtenus et localiser les activations cérébrales induites par les stimuli auditifs. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes plus couramment utilisées en recherche sur les nectarinidés, telles que l'électrophysiologie, l'histologie et les techniques de cartographie moléculaire, est que l'IRMf constitue une méthode non invasive in vivo, qui permet d'étudier le même sujet au fil du temps et d'analyser l'ensemble du cerveau simultanément, sans hypothèse préalable sur la localisation des substrats neuronaux impliqués dans le processus étudié.

Les personnes novices dans cette méthode peuvent éprouver des difficultés, car la mise en œuvre de l'IRM fonctionnelle chez les oiseaux est très différente et nettement plus complexe que dans le cas des humains ou des rongeurs. Cela est dû non seulement à la petite taille de leur cerveau, mais aussi au fait que leur crâne comprend de nombreuses cavités aériennes, ce qui induit des artefacts de susceptibilité. En utilisant une séquence d'écho de spin, moins sensible à ces artefacts qu'une séquence en gradient, il est possible d'obtenir une imagerie fonctionnelle de l'ensemble du cerveau du passereau chantant avec une excellente spécificité spatiale. L'intérieur du tunnel de l'appareil d'IRM constitue un espace confiné pouvant déformer les stimuli auditifs.

Par conséquent, pour commencer la préparation de ce protocole, enregistrez les stimuli sonores pendant leur diffusion à l’intérieur du tunnel du système IRM de sept T à l’aide d’un microphone à fibre optique et vérifiez les distorsions propres au système IRM utilisé. Ici, on observe les fréquences amplifiées et atténuées, telles qu’illustrées par les enregistrements d’un bruit blanc réalisés à l’extérieur du scanner et à l’emplacement de la tête de l’oiseau dans le tunnel magnétique. Pour compenser cet effet d’amplification artificielle, appliquez une fonction égaliseur à chaque stimulus à l’aide du logiciel Wave Lab pour le dispositif présenté.

Dans ce protocole, la fonction consiste en un noyau gaussien avec les paramètres affichés à l'écran. Ici, les stimuli sonores doivent être composés de plusieurs motifs individuels de chant d'un oiseau spécifique entrecoupés de périodes de silence ; ajustez la durée de ces périodes de silence afin que la quantité totale de son et de silence soit identique pour tous les stimuli. La durée totale de chaque stimulus est de 16 secondes, ce qui correspond au temps d'acquisition de deux images IRMf.

À l'aide d'un logiciel de préparation, normalisez l'intensité de chaque morceau en fonction de la racine carrée moyenne et appliquez un filtre passe-haut à 400 hertz avant de l'intégrer au stimulus complet. L'expérience peut être conçue à l'aide d'un logiciel de présentation selon un plan expérimental en blocs activé/désactivé, alternant des périodes de stimulation auditive et des périodes de repos. Chaque bloc doit durer 16 secondes, ce qui correspond au temps d'acquisition de deux images ; présentez chaque type de stimulus 25 fois, ce qui permet d'obtenir 50 images par stimulus et par sujet.

L'ordre de présentation des conditions doit être randomisé au sein de chaque sujet et entre les sujets. Configurez également le paradigme expérimental de manière à ce qu'il reçoive des déclencheurs provenant du scanner. Cela garantit qu'au cours de chaque répétition de la séquence IRMf, le logiciel du scanner envoie un déclencheur au logiciel de présentation auditive, qui à son tour enregistre le numéro d'acquisition et exécute la commande correspondante.

Ici, nous présentons un protocole spécifiquement adapté à l'utilisation de moineaux zébrés adultes. Les moineaux zébrés doivent être logés en volière selon un cycle photopériodique de 12 heures de lumière et 12 heures d'obscurité, et avoir accès à nourriture et eau ad libitum tout au long de l'étude. Le nombre minimal d'individus par expérience est de 15.

Ce nombre prend en compte la sensibilité de l'IRM fonctionnelle en écho de spin et la variabilité interindividuelle naturelle des phénomènes biologiques mesurés lors de l'expérience. Pour préparer l'expérience, reliez d'abord le masque buccal au dispositif de contrôle des gaz à l'aide de tubes en plastique et installez-le sur la table d'IRM d'un système IRM de sept T. Ouvrez les bouteilles de gaz oxygène et d'azote et mettez le dispositif de contrôle des gaz sous tension.

Activez également le système à rétroaction contrôlée et le dispositif de flux d'air chaud. Ensuite, anesthésiez le moineau domestique avec 3 % d'isoflurane dans un mélange d'oxygène et d'azote en introduisant son bec dans le masque et en maintenant la tête jusqu'à ce que l'oiseau soit complètement anesthésié. Cela peut être vérifié en tirant doucement sur la patte.

Lorsque l'oiseau est complètement sédaté, la patte ne sera pas rétractée. En outre, les yeux de l'oiseau seront fermés. Introduire une sonde de température cloacale afin de surveiller la température corporelle tout au long de l'expérience et placer un capteur pneumatique sous le ventre pour suivre la fréquence respiratoire.

Ensuite, placer une veste afin de maintenir le corps de l'oiseau immobilisé pendant toute la durée de l'expérience. Maintenir la fréquence respiratoire entre 40 et 100 mouvements respiratoires par minute et conserver la température corporelle constante à 40 degrés. Si la fréquence respiratoire est trop basse ou trop élevée, ajuster le niveau d'anesthésie en conséquence.

Si le problème persiste, l'expérience doit être interrompue et l'animal retiré du dispositif. Pour favoriser la récupération, positionnez des haut-parleurs dynamiques non magnétiques de chaque côté de la tête du diamant mandarin et reliez-les à l'amplificateur. Veillez à ce que les fils des haut-parleurs soient éloignés de la sonde de température, car cela pourrait influencer la mesure de température.

Lorsqu'il est trop proche, placez la bobine RF de surface au-dessus de la tête du diamant mandarin. Positionnez ensuite le diamant mandarin au centre de l'aimant. Enfin, réduisez le niveau d'anesthésie à 1,5 % d'ISO fluoré avant l'acquisition d'images.

Pour commencer la numérisation, déterminez d'abord la position du cerveau dans l'aimant. Acquérez un jeu d'images pilotes à une seule coupe en écho gradient dans les plans sagittal, horizontal et coronal, ainsi que des images pilotes multicoupes utilisées par la suite pour le positionnement des acquisitions fonctionnelles. Ensuite, réduisez le bruit des gradients en augmentant leurs temps de montée à 1000 microsecondes.

Ensuite, préparez une IRMf pondérée en T2 à acquisition rapide améliorée par relaxation, également connue sous le nom de séquence rare. Prescrivez ensuite 15 coupes sagittales couvrant presque tout le cerveau. Sélectionnez maintenant le protocole auditif dans le logiciel de présentation afin de garantir que ce dernier ne manque aucun déclencheur provenant du scanner.

Commencez d'abord le protocole auditif. Ensuite, une fois que le protocole est entièrement chargé, démarrez la séquence IRMf. Chaque expérience d'IRMf doit être précédée de l'acquisition de 10 images factices afin de permettre au signal d'atteindre un état d'équilibre avant le début de la stimulation auditive.

Une fois l'acquisition terminée, remplissez les données jusqu'à 64 par 64. Pour déterminer la qualité des données, examinez préliminairement les résultats à l'aide de l'outil fonctionnel.

Dans le logiciel ParaVision, calculez la réponse bold différentielle entre tous les blocs activés et la ligne de base. Si aucune activation n'est observée dans les zones auditives primaires, il est probable que l'oiseau n'ait pas perçu ou traité les stimuli auditifs en raison de problèmes techniques ou du niveau d'anesthésie. Le dispositif doit être vérifié et la mesure répétée.

Après l'acquisition fonctionnelle, exécuter une séquence anatomique 3D rare T deux pondérée dans la même orientation que les précédents examens IRMf. Ensuite, remplir à zéro ces données jusqu'à 2 56 par 2 56 par 2 56.

Retirez enfin le moineau zébré du lit d'IRM et laissez-le se réveiller de l'anesthésie dans une cage sous une lampe chauffante. Normalement, le réveil d'un moineau zébré après une anesthésie au fluorure d'isoflurane prend moins de cinq minutes. Après quelques minutes seulement, l'oiseau tentera de se tenir debout, et une fois complètement réveillé, il se perchera sur une branche au lieu de rester assis au fond de la cage, marquant ainsi le début du traitement des données.

Tout d'abord, convertir les données IRM au format Analyze ou NIfTI. Ensuite, avant de commencer le traitement des données dans SPM, il est nécessaire d'adapter les données d'IRMf de passereaux en multipliant la taille des voxels par 10. Étant donné que les logiciels d'analyse d'IRMf ont été développés pour traiter des données IRMf acquises chez l'humain, la méthode la plus simple consiste à augmenter artificiellement la taille des voxels des données d'IRMf aviaires à l'aide du logiciel MRI Croc.

Remarquez que ce réglage n'influence pas les données elles-mêmes. Aucun rééchantillonnage ni aucune autre modification n'est appliqué aux données. Ensuite, les données acquises sont prétraitées.

À l'aide de SPM, commencez par réaligner d'abord les données IRMf, puis effectuez la coregistration du jeu de données anatomiques 3D avec la série temporelle IRMf. Ensuite, normalisez les données 3D et la série temporelle IRMf COREGISTRÉE vers l'atlas cérébral du diamant mandarin.

Appliquez la matrice de transformation au jeu de données IRMf et lissez les données avec un noyau gaussien de 0,5 millimètre. Ensuite, effectuez une analyse statistique basée sur les voxels dans SPM8, d'abord au niveau des oiseaux individuels, suivie d'une analyse au niveau du groupe. Enfin, pour visualiser les résultats et localiser les activations fonctionnelles, projetez la carte paramétrique statistique sur l'atlas du diamant mandarin, l'atlas cérébral 3D haute résolution du diamant mandarin, et les coordonnées stéréotaxiques utilisées dans l'analyse décrite des résultats d'IRMf du diamant mandarin, conçus pour cette expérience au laboratoire de bio-imagerie, le jeu de données de l'atlas IRM.

Les délimitations du cerveau et celles des noyaux sont librement disponibles via le site web montré ici. Ici, une vue latérale est présentée, représentant en 3D l'hémisphère gauche avec les structures délimitées de l'atlas projetées sur sa coupe midsagittale. Nous pouvons voir ici un exemple de réponse FMRI au signal BOLD dans le champ L de la région auditive primaire, ainsi que dans les régions auditives secondaires adjacentes, évoquées par différents stimuli auditifs comparés à la condition de repos.

Les valeurs T sont codées par couleur selon l'échelle affichée dans la figure, et seuls les voxels pour lesquels le test T s'est révélé significatif sont affichés. Il s'agit d'un autre exemple d'expérience d'IRMf chez des moineaux zébrés. Les images montrent des réponses sélectives au chant propre de l'oiseau dans les régions cérébrales XMLD et HVC.

Les nombres sous les images indiquent des coordonnées en millimètres à partir de la ligne médiane. Le signe positif indique que les coupes et les résultats statistiques proviennent de l’hémisphère droit. Le protocole décrit dans cette vidéo peut être facilement adapté à des applications chez d'autres oiseaux chanteurs, comme les étourneaux.

Il s'agit d'un exemple de résultats obtenus lors d'une telle expérience d'IRMf. Chez un étourneau, la figure montre les activations induites par des stimuli auditifs par rapport au repos, chez le même individu, au cours des différentes saisons. La mise en œuvre et l'optimisation de l'IRM fonctionnelle chez les oiseaux chanteurs ouvrent de nouvelles perspectives de recherche dans le domaine de l'étude des oiseaux chanteurs.

Il a déjà été démontré comme une technique précieuse pour l'analyse expérimentale des processus sensoriels, moteurs et cognitifs complexes sous-jacents à la communication vocale chez ces modèles animaux. De plus, grâce à son approche non invasive et à l'imagerie cérébrale complète, l'IRMf peut être utilisée comme méthode complémentaire pour éclairer les méthodes locales et invasives plus couramment utilisées. Le nombre croissant d'expériences d'IRMf chez les SUIMBAS montre son applicabilité aux questions de recherche cognitive ; un effort futur devrait être consacré à étendre davantage les expériences d'IRM au-delà du traitement auditif, en utilisant des sujets éveillés habitués au protocole d'imagerie, un processus qui reste actif sous anesthésie.

Cela pourrait offrir de nouvelles possibilités de recherche où les oiseaux peuvent participer activement à des expériences d'interférence électromagnétique et où l'attention des oiseaux peut être contrôlée expérimentalement.