Différenciation isolement, caractérisation et comparative de l'homme dentaires cellules souches de pulpe Dérivé de dents permanentes à l'aide de deux méthodes différentes

L'objectif général de cette procédure est d'isoler, de caractériser et de différencier des cellules souches mésenchymateuses humaines à partir de dents permanentes en utilisant deux méthodes. Cela est réalisé en collectant des dents de sagesse incluses saines, puis en les sectionnant au niveau de la jonction cémento-émailau début. Les cellules souches mésenchymateuses dentaires (D PSCs) sont isolées selon deux méthodes différentes.

Dans la première méthode, les tissus polypes sont digérés enzymatiquement par incubation dans une solution de collagénase de type un et de solution d'espace intervertébral. Nous les appelons ici ed. En ce qui concerne la méthode d'isolement de la deuxième méthode, les tissus palp sont simplement placés dans le flacon sans aucune digestion.

De cette manière, les dpss commencent à migrer du tissu vers le flacon. Ces cellules, appelées OG, font référence à la méthode d'isolement par migration. La deuxième étape de la procédure consiste à identifier les cellules souches à l'aide de la cytométrie en flux.

La troisième étape de la procédure consiste à induire la différenciation des odontoblastes, et la dernière étape est l'évaluation comparative de la différenciation des odontoblastes entre deux groupes par coloration rouge et QBCR. Je suis RA Kde du Département des cellules souches et biologie du développement de l'Institut Rian. Aujourd'hui, je vais vous montrer l'isolement, la caractérisation et la différenciation comparative de cellules souches mésenchymateuses humaines en utilisant deux méthodes.

Bonjour, je suis le Dr. Rezaian de l'Institut Rio. Nous travaillons sur un projet lié aux cellules souches de la pulpe dentaire humaine. Ces cellules sont un type de cellules souches mésenchymateuses, faciles à obtenir avec un minimum de douleur et de morbidité.

Les cellules souches méchys se caractérisent par leur capacité plastique, la formation de colonies et leur potentiel de différenciation multiple. Bonjour, je suis le Dr. Ami du Département des cellules souches. Dans notre institut, nous utilisons cette procédure en laboratoire pour isoler des cellules souches à des fins d'études de recherche et d'applications futures.

Dans le domaine de la médecine régénérative, la toute première étape pour utiliser cette source de cellules souches dans le cadre de futures thérapies cellulaires consiste à choisir le meilleur protocole d'isolement des cellules souches à partir de tissus humains. Pour atteindre cet objectif, il est essentiel d'étudier certains aspects du comportement cellulaire dans différentes conditions d'isolement des cellules souches. Tout d'abord, je vais isoler des cellules souches de la pulpe dentaire humaine soit par dissociation enzymatique de la pulpe, soit par migration des cellules souches à partir d'implants tissulaires.

Ensuite, les caractériser et les différencier en blastule ognique. Commençons donc. Première étape : l'espace et la collagénase de type I, à dissoudre tous deux dans du PBS.

Ensuite, filtrez-les à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 micron. Transférez le tout dans un tube conique. Puis ajoutez du pener et du PBS pour obtenir une concentration finale.

Transférez les dents de sagesse saines au laboratoire dans un milieu basique froid, en condition stérile. Nettoyez la surface de la dent avec de l'éthanol à 70 % avant l'étude. Veillez à éliminer toute impureté de la surface de la dent.

Couper la dent autour de la jonction émail-cément en utilisant un disque dentaire stérilisé afin de mettre au jour la chambre pulpaire. Il convient de procéder lentement lors de la coupe afin de réduire la surchauffe du tissu dentaire. Ensuite, séparer délicatement le tissu pulpaire de la couronne, c'est-à-dire découper le tissu pulpaire en morceaux d'un à deux millimètres à l’aide de la lame de Scarpa.

Transférez de petits morceaux de tissus pulpeux dans un millilitre de solution enzymatique pendant une heure à 37 degrés Celsius, en vortexant toutes les 30 minutes pour aider à la dissociation des tissus pulpeux. Ensuite, éliminez les agrégats volumineux en faisant passer le mélange à travers un tamis cellulaire de 70 microns. Puis ajoutez du PBS contenant du PENER et centrifugez à 1 200 tr/min pendant cinq minutes.

Retirez soigneusement le surnageant. Ensuite, nous suspendons la plaque dans le milieu de prolifération pm, la transférons dans le flacon de culture et ajoutons du milieu. Puis, incubation.

Changer le milieu tous les trois jours jusqu'à ce que la confluence cellulaire soit atteinte pour la méthode d'outwork. Répéter le processus de découpage. Après la coupe, diviser les tissus en fragments d'un à deux millimètres.

Ensuite, placez-les dans la culture. Ajoutez rapidement le milieu de prolifération et incubez. Il faut tenir compte du fait que le volume total du milieu de prolifération doit permettre l'attachement de tous les fragments pour favoriser la migration cellulaire ultérieure.

Changer le milieu après avoir observé la migration, puis tous les trois jours jusqu'à ce que la confluence cellulaire soit atteinte. Pour l'immunophénotypage, incuber les deux types de D PSC avec des anticorps conjugués à la PE ou à la FITC pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius à l'abri de la lumière. Ajouter ensuite du PBS et centrifuger à 1 200 tr/min pendant cinq minutes.

Éliminer le surnageant et resuspendre, suspendre la plaque dans du PBS, puis évaluer finalement les marqueurs de surface à l'aide d'un cytomètre en flux pour la sous-culture, les deux types de CDP sur trois passages. Ensuite, faire une trypsine sur glace et les transférer dans six boîtes de culture rouges à une confluence de 60 %, remplacer le MP par un milieu odontogénique. Trois puits sont conservés comme témoin négatif en ajoutant du MP.

Changer le milieu tous les trois jours. Au 21e jour, laver les cellules avec du PBS. Puis les fixer avec un millilitre par puits de gel de formaldéhyde à 10 % pendant 15 minutes à température ambiante.

Après 15 minutes, retirez soigneusement le fixateur et rincez les cellules trois fois avec de l'eau distillée. Ensuite, remplacez l'eau par un millilitre par puits rouge dans la solution de colorant rouge. Après 20 minutes, éliminez l'excès de colorant et lavez les cellules quatre fois avec de l'eau déionisée.

Ensuite, ajoutez un millimètre d'eau par puits pour éviter que les cellules ne s'assèchent. Après la coloration, vous pouvez observer au microscope que trois rails supérieurs deviennent rouges par rapport aux témoins ; une absorption de la couleur du colorant autour de la cellule peut être observée en fort grossissement afin de quantifier la coloration rouge. Après élimination de l'eau, ajoutez un millilitre par puits d'acide acétique à 10 %, puis incubez pendant 30 minutes sous agitation.

Ensuite, détacher délicatement les cellules de la plaque à l’aide d’un grattoir à cellules. Puis les transférer dans des tubes séparés. VOR agite vigoureusement pendant 30 secondes.

Ensuite, chauffez-les à 85 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour éviter l'évaporation, scellez les tubes avec du ParaView et transférez-les sur de la glace pendant cinq minutes ; puis centrifugez-les à 20 000 ×g pendant 15 minutes. Pendant ce temps, préparez une dilution sérielle standard de rouge d'Alizarine selon le protocole en vigueur.

Après la centrifugation, retirez le surnageant et transférez-le dans de nouveaux tubes. Neutralisez le pH avec de l'hydroxyde d'ammonium à 10 %. Puis ajoutez les étalons ainsi que les échantillons dans une plaque de 96 puits.

Plaquez dans une plaque de culture, puis mesurez l'absorbance à 405 nanomètres et analysez les données selon la dilution sériée standard. Ici, vous pouvez observer des DPC, isolés par dissociation enzymatique aux jours 10, 15 et 18, ainsi que des DPC surcroissants aux jours 5, 10, 13 et 18. Les deux types de dpss au stade trois présentent presque la même taille et la même morphologie. Les résultats d'immunophénotypage montrent la présence de marqueurs de cellules souches mésenchymateuses tels que CD 44, CD 73 et CD 19, ainsi que l'absence de marqueurs hématopoïétiques et endothéliaux tels que CD 34, CD 45 et CD 11 B. Curieusement, l'expression de CD 1 0 5 et de CD 146 est plus élevée dans les d PSCs surcroissants par rapport aux D-P-S-C-E-D. La quantification de la coloration rouge d'enzyme au 21e jour de la différenciation en odontoblastes révèle un dépôt de calcium plus important dans les D-P-S-C-E-D par rapport aux cellules souches sans dentition.

Les résultats de qPCR indiquent également des expressions significativement plus élevées de MEP et d'ALP, en tant que marqueurs de minéralisation, dans les D-P-S-C-D par rapport aux cellules souches dentaires sortantes. Parallèlement, l'expression de ces deux gènes est régulée au cours de la différenciation, et l'expression de DSPP, marqueur odontogénique, augmente également durant ce processus. Toutefois, aucune variation significative n'est observée dans l'expression de DSVP entre les cellules différenciées des groupes ED et OG.

Nous venons de vous montrer comment isoler des cellules souches à partir de tissus dentaires humains en utilisant soit la dissociation enzymatique de la pulpe, soit la migration des cellules souches à partir d’explant tissulaire. Voilà tout. Nous vous souhaitons bonne chance si vous souhaitez appliquer cette procédure dans votre expérience.

Merci.