Dissection, de la culture, et de l'analyse des

L'objectif général de cette procédure est de préparer une culture primaire de cellules rétiniennes de Xenopus. Cela est réalisé en premier lieu en éliminant les tissus environnants afin d'exposer la rétine. La deuxième étape consiste à exciser le tissu rétinien.

Ensuite, le tissu rétinien est dissocié en cellules individuelles. La dernière étape consiste à ensemencer les cellules rétiniennes dans une boîte UnCloned et à ajouter du fluo 4 à 4 h du matin pour l'imagerie calcique. Enfin, une microscopie confocale est utilisée pour détecter l'activité calcique en culture cellulaire rétinienne.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans les domaines de la biologie du développement, de la neurobiologie et de la biologie cellulaire, telles que le rôle du calcium et de l'activité électrique dans le développement rétinien, ainsi que l'expression génique au niveau d'une seule cellule. En règle générale, les personnes novices dans cette procédure éprouvent des difficultés, car des mouvements moteurs fins sont nécessaires pour effectuer des dissections rapides et précises. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de la dissection sont complexes, étant donné que des mouvements coordonnés main-œil sont indispensables.

Pour commencer cette procédure dans la hotte, préparez et étiquetez les éléments suivants : une boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres contenant 10 millilitres de milieu de culture cellulaire, qui servira de plaque de dissection. De manière facultative, 10 milligrammes de collagénase B peuvent être ajoutés à la plaque de dissection pour obtenir une concentration finale de 1,0 milligramme par millilitre, afin de faciliter la séparation des couches tissulaires lors de la dissection d'embryons au stade 25 ou plus jeune.

Préparez également une boîte de culture de 35 millimètres de long contenant deux millilitres de milieu de culture cellulaire, qui servira de plaque de culture, un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre vide qui servira de tube de dissociation pour explant, et un tube conique de type Falcon de 15 millilitres contenant 15 millilitres.

Milieu de culture cellulaire. Préparez ensuite 2 boîtes de Pétri en plastique de 35 millimètres contenant chacune deux millilitres de solution saline privée de calcium et de magnésium (CMF) pour la dissection, l'une devant servir de plaque de dissociation d'explant, l'autre de plaque de rinçage d'explant à l'extérieur de la hotte. Préparez deux boîtes de Pétri en plastique de 60 millimètres contenant chacune 10 millilitres.

0,1 XMMR, une destinée à servir de plaque de maintien, l'autre comme plaque témoin, et une autre boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres contenant 10 millilitres de 0,1 XMMR plus 0,5 milligramme par millilitre de MS 22. Ensuite, ajouter 40 microlitres de trypsine à 5 % dans du CMF à la plaque de dissociation des explants.

Agiter doucement pour mélanger, puis mettre de côté. Ensuite, procéder à la dissection à l’aide d’un microscope stéréoscopique et de deux paires de pinces fines. Effectuer une incision sagittale médiane sur la face ventrale de l’embryon, en partant de l’extrémité postérieure et en poursuivant à travers la glande cimentaire située dans la partie antérieure de l’embryon.

Ouvrir délicatement l'embryon en écartant les deux côtés de l'incision. Cela permet d'orienter la face dorsale de l'embryon vers la plaque de dissection. Ensuite, ouvrir l'ectoderme ventral pour faire apparaître l'endoderme et le mésoderme.

Ensuite, retirez l'endoderme et le mésoderme, la première et plus grande couche de ce tissu. L'endoderme a un aspect très floconneux, avec de grandes cellules et peu d'organisation apparente. Après avoir retiré cette couche, les somites et Noor deviendront visibles.

Pour un meilleur contraste, transférez l'embryon dans une boîte de Pétri en plastique de 60 millimètres contenant 10 millilitres de milieu de culture cellulaire et 100 microlitres de solution à 1 % de sulfate de bleu de Nile, puis incubez pendant deux à trois minutes. Ensuite, transférez-le à nouveau sur la plaque de dissection. Cela colorera l'ectoderme, les somites et le Noor, facilitant ainsi leur identification et l'orientation.

En vous concentrant sur la portion antérieure de l'embryon, retirez soigneusement le Noor et tout mésoderme résiduel afin d'exposer le cerveau et les vésicules optiques. Une fois le cerveau et les vésicules optiques complètement exposés, utilisez la pince pour sectionner le tube neural et l'ectoderme sous-jacent juste en arrière du cerveau. Retournez cette portion de manière à ce que l'ectoderme se retrouve au-dessus.

Prendre garde de ne pas endommager les vésicules optiques sous-jacentes et retirer soigneusement l'ectoderme. Enfin, séparer les vésicules optiques du cerveau à l’aide de la pince pour disséquer un embryon âgé de plus de la stade 25. Tout d’abord, retirer la portion ventrale de l’embryon à l’aide de la pince dans la plaque d’anesthésie.

Pour un meilleur contraste, transférer l'embryon dans une boîte de Petri en plastique de 60 millimètres contenant 10 millilitres de 0,1 XMMR et 100 microlitres de sulfate de bleu de Nile à 1 % pendant deux à trois minutes afin de colorer l'ectoderme. Puis le transférer sur la plaque de dissection. Ensuite, en maintenant l'embryon en place, retirer soigneusement la rétine ou la vésicule optique située directement sous l'ectoderme recouvrant.

Une fois que la vésicule optique ou la rétine a été disséquée, transférez-la soigneusement vers la plaque de rinçage X explant à l’aide d’une micropipette P100 munie d’une pointe résistante aux aérosols. Veillez à ne pas laisser le tissu toucher les interfaces air-liquide. Laissez ensuite l’explant reposer pendant 30 secondes.

Ensuite, transférez 80 microlitres de trypsine à 0,1 % dans du CMF depuis la plaque de dissociation d'explant vers le tube de dissociation d'explant. Puis, transférez la rétine ou la vésicule optique depuis la plaque de rinçage d'explant vers le tube de dissociation d'explant, en évitant de transférer la solution de rinçage d'explant.

Ensuite, laisser le tissu se dissocier dans le tube de dissociation explantaire pendant une heure à température ambiante. Si plusieurs images des cellules doivent être prises au cours de l'expérience, fixer une grille sur la face inférieure de la plaque de culture à l’aide de petites gouttes de colle superglue. Cela permettra de prendre des images des mêmes cellules dans des orientations identiques à différents moments du protocole de mise en culture des cellules.

Commencez par retirer lentement 40 microlitres de solution du tube de dissociation explantaire et jetez-les. Ensuite, utilisez le P 100 muni d'une pointe résistante aux aérosols pour transférer lentement les cellules dans la plaque de culture. Lors du prélèvement des cellules vers la plaque, pipetez lentement et maintenez les cellules regroupées dans une petite zone au centre de la plaque.

Cette figure montre un exemple d'activité calcique d'une cellule unique sur une heure d'acquisition d'images. Ces figures présentent des résultats représentatifs d'expériences d'imagerie calcique réalisées sur des cellules rétiniennes embryonnaires, analysées à différents stades de développement. En résumé, les résultats indiquent que le calcium est régulé au cours du développement, avec des pics d'activité à l'étape 35 en ce qui concerne la corrélation entre l'activité calcique et les cellules positives pour une sonde spécifique.

Dans les expériences sur les poissons, bien qu'aucune différence statistiquement significative n'ait été observée, on notait une tendance selon laquelle les cellules positives pour un marqueur GABAergique présentaient des niveaux d'activité de pic de calcium plus élevés que les cellules positives pour un marqueur glutamatergique ou pour le gène PT F1 A.A, qui code une facteur de transcription corrélé à la promotion du phénotype GABAergique. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ trois heures et trente minutes pour une plaque, si elle est effectuée correctement. Après cette procédure, d'autres méthodes telles que la culture cellulaire, l'hybridation double hybride ou les enregistrements électrophysiologiques peuvent être utilisées pour répondre à des questions supplémentaires, comme l'identification des cellules exprimant des marqueurs phénotypiques spécifiques ou l'analyse des enregistrements électrophysiologiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de disséquer le tissu rétinien, de dissocier le tissu rétinien et de mettre en culture les cellules rétiniennes.