En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l'évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs

Le but de cette procédure est d’évaluer les défauts de guidage axonal dans le tube neural du poulet après avoir régulé à la baisse l’expression des gènes d’une manière traçable spécifique au type de cellule. Ceci est accompli en préparant des œufs de poule fécondés pour l’électroporation innovo en découpant une fenêtre dans la coquille de l’œuf. La deuxième étape consiste à injecter et à électro-opérer des constructions d’ADN codant pour des microARN dans le tube neural.

Ensuite, les moelles épinières électro-évaluées sont disséquées et fixées dans des préparations à livre ouvert à montage plat. La dernière étape consiste à injecter un colorant fluorescent pour visualiser les projections axonales. En fin de compte, la microscopie fluorescente est utilisée pour montrer à la fois les cellules subissant un silençage génique et pour évaluer les effets ultérieurs sur le guidage axonal commiss

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est le silençage des gènes spécifique au type de cellule. Pour fabriquer les plasmides, vérifiez le protocole écrit pour les instructions : incubez les œufs à 38,5 degrés Celsius et à environ 45 % d’humidité jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soit atteint. Pour étudier le guidage axonal des neurones commissurals, incubez les embryons pendant environ trois jours jusqu’à ce qu’ils atteignent les stades 17 à 18 de Hamburger et de Hamilton.

Une fois que le stade de développement souhaité est atteint et avant que la protéine d’intérêt ne s’accumule dans l’embryon, retirez les œufs de l’incubateur et placez-les dans une position horizontale stable pendant 20 minutes pour repositionner l’embryon sur le jaune sur la face supérieure de l’œuf. Une fois que les embryons se sont repositionnés sur le jaune, sortez les œufs de l’incubateur et essuyez-les avec de l’éthanol à 70 %. Ensuite, placez une bande de ruban adhésif le long de l’axe long de l’œuf et utilisez un scalpel pour faire un petit trou dans l’extrémité émoussée de l’œuf et un autre dans le coin de la zone à fenêtre.

Insérez ensuite une seringue munie d’une aiguille de calibre 18 dans le trou à l’extrémité émoussée de l’œuf à un angle de 45 degrés et aspirez environ trois millilitres d’albumine en prenant soin de ne pas endommager le jaune. Utilisez de petits ciseaux tenus horizontalement pour couper la fenêtre dans l’œuf sans endommager l’embryon. Scellez ensuite la fenêtre à l’aide du ruban adhésif.

Enfin, utilisez un pinceau pour appliquer de la cire de paraffine fondue pour sceller le trou à l’extrémité émoussée de l’œuf et sceller les fissures de l’œuf de la même manière. Remettez ensuite l’œuf dans l’incubateur. Répétez le processus avec tous les œufs à électroporer.

Retirez le ruban adhésif de l’un des œufs fenêtrés et stadifiez l’embryon selon hamburger et Hamilton. Ensuite, utilisez des pinces pour soulever les membranes embryonnaires supplémentaires de la moitié cordale de l’embryon dans la région où les principales veines de la ligne des viters droite et gauche. Entrez dans le tronc, déchirez ou coupez doucement les membranes avec des ciseaux à ressort et versez-les vers la queue.

Utilisez maintenant une aspiration douce pour charger le mélange d’ADN à électroporer dans un microcapillaire en verre avec un tube attaché. Insérez le microcapillaire dans le canal central du tube neural juste au-dessus des membres postérieurs et injectez la solution d’ADN en contrôlant le volume d’injection par la bouche. Le colorant bleu doit s’étendre de l’extrémité de la queue jusqu’au ventricule du cerveau en développement.

Ajoutez quelques gouttes de PBS stérile sur le dessus de l’embryon et placez les électrodes parallèlement à l’axe antérieur et postérieur de l’embryon sans toucher l’embryon ou les vaisseaux sanguins. Maintenez ensuite les électrodes immobiles et électro-purate. Après l’électroporation, retirez les électrodes et rincez rapidement à l’eau stérile pour éliminer les protéines dénaturées du blanc d’œuf.

Enfin, déposez un peu plus de PBS stérile sur l’embryon, puis refermez l’œuf avec du ruban adhésif. Comme précédemment, une bonne étanchéité est cruciale pour éviter la déshydratation de l’embryon. Ensuite, retournez l’embryon dans l’incubateur jusqu’à ce que le stade de développement souhaité soit atteint.

Une fois que l’embryon atteint Hamburger Hamilton, stade 25 ou 26, utilisez une pince pour retirer l’embryon de l’œuf et placez-le dans une boîte de Pétri recouverte d’élastomère sil guard. Utilisez la pince pour retirer les membranes embryonnaires supplémentaires et posez l’embryon avec le côté dorsal vers le bas. Utilisez maintenant des épingles à insectes de 0,2 millimètre pour étirer doucement et épingler l’embryon à travers le cou et la queue.

Ensuite, épinglez les membres de l’embryon, en insérant les broches à un angle afin qu’elles n’interfèrent pas avec la dissection ultérieure. Illuminez la boîte contenant l’embryon par le bas afin que la densité tissulaire puisse être perçue. Utilisez des ciseaux à ressort pour ouvrir la cavité abdominale et un grattage doux avec une pince pour retirer le cœur et les organes internes.

Lorsque tous les organes ont été complètement retirés, les vertèbres segmentées et la moelle épinière seront visibles. Ensuite, faites pivoter l’embryon à 180 degrés et utilisez des ciseaux à ressort pour faire une coupe peu profonde à travers les vertèbres recouvrant la moelle épinière au niveau du cou. Ensuite, faites deux courtes coupes longitudinales à travers les vertèbres de chaque côté de la moelle épinière, du cou à la queue.

À l’aide d’une pince, soulevez les vertèbres du clapet de la moelle épinière, puis décollez les vertèbres en une seule bande vers la queue. Ensuite, étirez doucement et réépinglez l’embryon à travers la queue et les membres. Identifiez maintenant les méninges de la moelle épinière, qui doivent apparaître comme une ligne de tissu sombre et dense entre le tube neural et les ganglions de la racine dorsale, puis utilisez une aiguille ster ou un scalpel microchirurgical fin pour couper les méninges longitudinalement de chaque côté du cordon, du cou à la queue.

Les méninges doivent se séparer facilement de la moelle épinière en raison de l’étirement de l’embryon épinglé. Enfin, coupez la moelle épinière au niveau du bourgeon de l’aile et cordal au bourgeon du membre. Ensuite, à l’aide d’une pince, soulevez la moelle épinière dans un mouvement de cordale rostrale tout en veillant à ce que le cordon reste immergé dans le PBS First.

Étalez la moelle épinière isolée sur une spatule et transférez-la dans un plat frais recouvert de syl guard contenant 4 % de para formaldéhyde dans du PBS. Ensuite, épinglez soigneusement la moelle épinière médialement et trimestriellement avec des épingles à insectes de 0,1 millimètre pour produire une préparation de montage plat, en incubant le paraldéhyde pendant 30 minutes à une heure. Attention à ne pas trop fixer.

Comme cela augmentera le bruit de fond et réduira l’efficacité de la diffusion diode. Ensuite, versez soigneusement le paraldéhyde et remplacez-le par du PBS. Après avoir préparé cinq milligrammes par millilitre de di rapide dans de l’éthanol, cassez la pointe d’une micro-pipette en verre de petit diamètre fixée à un tube en plastique et aspirez la solution dans la pipette iet.

Insérez l’aiguille remplie dans un plat de PBS et vérifiez que le colorant ne s’échappe pas de l’aiguille. Si c’est le cas, le diamètre est trop large et une nouvelle aiguille doit être préparée. Assurez-vous que la préparation du livre ouvert est éclairée par le bas et située une bande longitudinale plus dense de tissu située à environ un cinquième de la largeur du livre Hemi À partir du bord latéral, les corps cellulaires des neurones commissuraux sont juste dorsaux à cette ligne sombre.

Insérez la pointe de la micropipette en verre dans le tissu et, au fur et à mesure que l’aiguille est retirée, soufflez une petite quantité de D eye à l’aide d’une pipette buccale en répétant rapidement la procédure tous les 0,5 millimètres sur la longueur du livre ouvert. Une fois les injections terminées, utilisez une pipette de transfert pour aspirer et jeter. Tout excès de ne pas le faire entraînera un bruit de fond élevé.

Répétez la procédure pour toutes les préparations à livre ouvert. Placez ensuite le plat contenant les préparations injectées de quatre degrés Celsius pendant environ trois jours pour permettre au colorant de se répandre le long des axones. Après ce temps, montez les préparations selon les instructions du protocole écrit.

Des coupes transversales et des livres ouverts ont été dérivés d’embryons de poulet hamburger Hamilton Stage 25 à 26 qui ont été électro-évalués au Hamburger Hamilton Stage 18. Comme on le voit ici en coupe transversale, le promoteur agissant bêta est à l’origine de l’expression omniprésente. La flèche indique la direction ventrale dorsale.

Cette image montre un exemple de profils d’expression de protéines fluorescentes obtenus après électroporation des vecteurs plasmidiques. Ici, l’expression omniprésente du promoteur de l’actine bêta est observée dans une préparation à livre ouvert. La flèche indique la direction de la cordale rostrale.

Cette image montre une coupe efficace après électroporation avec une construction contenant un amplificateur mathématique. Cela entraîne l’expression dans les neurones di. Ici, l’expression de la construction de l’amplificateur de mathématiques un est observée dans une préparation à livre ouvert.

Cette section transversale montre l’expression de l’épervier, un amplificateur après électroporation bilatérale de la construction. Le rehausseur Hawk A one stimule l’expression spécifiquement dans la plaque de sol. Cette préparation à livre ouvert montre le motif d’expression des faucons une construction dans la plaque de sol.

Cette image montre une image en champ clair de l’application des sites d’injection de Dai. Dans une préparation à livre ouvert, Dai a été injecté dans un motif ponctué près de la marge latérale du livre ouvert. Du côté électro-noté, cette image montre la visualisation de l’expression de la GFP dans la même préparation, et ici Dai est visualisé.

Après trois jours de diffusion, la commissure se détendre sur les trajectoires devrait pouvoir être visualisée au microscope fluorescent. Les trajectoires axonales normales se développeront vers la plaque de sol, traverseront la plaque de sol, puis tourneront et grandiront. Allié, comme on le voit ici.

Les phénotypes anormaux résultant de l’inactivation de gènes, tels que celui montré ici, peuvent être comparés à la trajectoire archétypale. Dans l’exemple, certains axones calent la plaque de sol ou prennent des décisions de virage erronées du côté controlatéral. Lors de cette procédure, il est important d’être prudent et patient tout au long des étapes d’injection fine et de dissection.

Ceux-ci demandent un peu de pratique. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’injecter et de manger des plasmides d’ARN pour étudier la fonction des gènes pendant le développement du tube neural d’une manière spécifique au type de cellule.