Name: En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et lévaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Découvrez l'électroporation in ovo de miARN plasmidiques dans le tube neural du poulet pour étudier le guidage des axones commissuraux. Cette méthode permet de visualiser les défauts de guidage axonal par microscopie fluorescente.

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Travail dans le laboratoire de l&#39;ES est soutenu par le Fonds national suisse de la science. Nous tenons à remercier le Dr Beat Kunz de l&#39;aide pour le tournage.

<ol><li>Chédotal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+tales+of+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Further tales of the midline.</a> Current Opinion in Neurobiology. 21, 68-75 (2011).</li>
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<li>Murphy, M. C., Fox, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+tracing+method+using+DiI+to+label+vagal+innervation+of+the+embryonic+and+early+postnatal+mouse+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Anterograde tracing method using DiI to label vagal innervation of the embryonic and early postnatal mouse gastrointestinal tract.</a> Journal of Neuroscience Methods. 163, 213-225 (2007).</li>
<li>Helms, A. W., Abney, A. L., Ben-Arie, N., Zoghbi, H. Y., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoregulation+and+multiple+enhancers+control+Math1+expression+in+the+developing+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system.</a> Development. 127, 1185-1196 (2000).</li>
<li>Li, X., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+recombinase+expression+in+the+floorplate%2C+notochord+and+gut+epithelium+in+transgenic+embryos+driven+by+the+Hoxa-1+enhancer+III%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cre recombinase expression in the floorplate, notochord and gut epithelium in transgenic embryos driven by the Hoxa-1 enhancer III.</a> Genesis. 26, 121-122 (2000).</li>
<li>Mauti, O., Baeriswyl, T., Stoeckli, E. T. G. ene <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+by+Injection+and+Electroporation+of+dsRNA+in+Avian+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Silencing by Injection and Electroporation of dsRNA in Avian Embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2008).</li>
<li>Krull, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+using+in+ovo+electroporation+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function.</a> Developmental Dynamics. 229, 433-439 (2004).</li>
<li>Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+and+confirming+the+specificity+of+RNAi+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhancing and confirming the specificity of RNAi experiments.</a> Nature Methods. 3, 677-681 (2006).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette simple, basée sur un vecteur d&#39;expression artificielle stratégie miRNA peut être utilisé pour l&#39;expression du gène endogène effet de choc dans le tube neural poulet. Ces outils fonctionnels offrent gene silencing multiple, contrôle temporel et une spécificité de type cellulaire, afin de faciliter l&#39;élucidation des voies de développement complexes. En particulier, nous avons démontré l&#39;utilité de ces plasmides dans le guidage axonal commissurale, depuis les plasmides peuvent être utilisés à des gène...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 0,5 mm capillaires en verre </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Verre aiguille extracteur </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporateur </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard élastomère de silicone </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Fil de tungstène, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Broches d&#39;insectes, 0,20 mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Broches d&#39;insectes, 0,10 mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Ciseaux à ressort </td><td> Fin Pour la Scienceols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Rapide Dil </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscopes à fluorescence </td><td> Olympe </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

en électroporation in ovo de miarn à base de plasmides dans le tube neural développement et l&#39;évaluation des phénotypes par injection dans dil livre ouvert préparatifs

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissuraux EL1 neurones ont été étudiés afin d&#39;élucider les mécanismes qui sous-tendent le guidage axonal pendant 1,2 développement. Ces neurones sont situés dans la moelle épinière dorsale et envoient leurs axones le long de trajectoires stéréotypées. Axones commissuraux d&#39;abord projeter vers le ventre, puis à travers la plaque de sol. Après avoir traversé la ligne médiane, ces axones faire un virage serré rostrale et le projet longitudinalement vers le cerveau. Chacune de ces étapes est régie par les activités coordonnées de signaux de guidage attractives et répulsives. L&#39;interprétation correcte de ces signaux est essentielle pour guider les axones le long de leur parcours délimité. Ainsi, la contribution d&#39;une molécule physiologique particulier pour le guidage axonal commissure est idéalement étudiée dans le cadre de l&#39;embryon vivant. En conséquence, inactivation génique in vivo doit être contrôlée avec précision afin de bien distinguer les activités de guidage des axones des gènes qui pourraient jouer multiplerôles au cours du développement. Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;expression des gènes effet de choc dans le tube neural de poulet dans une cellule spécifique du type, de façon traçable. Nous utilisons de nouveaux vecteurs plasmidiques 3 Hébergement cellulaires spécifiques au type de promoteurs / amplificateurs qui alimentent l&#39;expression d&#39;un marqueur fluorescent protein, suivie directement par une transcription miR30-RNAi 4 (situé au sein de la 3&#39;-UTR de l&#39;ADNc codant pour la protéine fluorescente) ( Figure 1). Lorsque électroporation dans le tube neural en développement, ces vecteurs susciter la régulation négative de l&#39;expression génique efficace et d&#39;exprimer vives protéines marqueurs fluorescents pour permettre le traçage directe des cellules qui connaissent knockdown 3. Mélanger différents vecteurs d&#39;ARNi avant l&#39;électroporation permet l&#39;effet de choc simultanée de deux ou plusieurs gènes dans les régions indépendantes de la moelle épinière. Cela permet de complexes interactions cellulaires et moléculaires qui seront examinées au cours du développement, d&#39;une manière qui est rapide, smise, précis et peu coûteux. En combinaison avec Dil tracé des trajectoires des axones dans commissurales à livre ouvert préparations 5, cette méthode est un outil utile pour les études in vivo des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance axonale commissurale et d&#39;orientation. En principe, n&#39;importe quel promoteur / amplificateur peut être utilisé, ce qui pourrait rendre la technique plus largement applicable pour les études in vivo de la fonction des gènes au cours du développement 6. Cette vidéo montre d&#39;abord comment manipuler et oeufs de fenêtres, l&#39;injection de plasmides d&#39;ADN dans le tube neural et la procédure d&#39;électroporation. Pour étudier le guidage axonal commissurale, la moelle épinière est enlevée de l&#39;embryon comme une préparation à livre ouvert, fixé, et injecté avec Dil pour permettre voies axonales à tracer. La moelle épinière est monté entre lamelles et visualisées par microscopie confocale.

Procédé par lequel l&#39;expression du gène dans le tube neural peut être régulée à la baisse dans une cellule spécifique d&#39;un type, est décrit de façon traçable. Nous montrons comment<em&gt; In ovo</emÉlectroporation&gt; des microARN à base de plasmides qui suscitent spatio-temporellement contrôlée ARN interférence peut être utilisée pour étudier le guidage axonal commissurale dans le tube neural développement.

En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l&#39;évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs

Les neurones commissuraux dI1 ont été largement étudiés afin d'élucider les mécanismes sous-jacents au guidage axonal pendant le développement1,2. Ces neurones sont ...

L'objectif de cette procédure est d'évaluer les défauts de guidage des axones dans le tube neural de poulet après une diminution de l'expression génique réalisée de manière traçable et spécifique à un type cellulaire. Cette étape est réalisée en préparant des œufs de poulet fécondés pour une électroporation *in ovo*, en découpant une fenêtre dans la coquille. La deuxième étape consiste à injecter et à électroporater des constructions d'ADN codant des microARNs dans le tube neural.Ensuite, les moelles épini&egrave;res &eacute;lectropor&eacute;es sont diss&eacute;qu&eacute;es et fix&eacute;es en pr&eacute;parations &laquo; livre ouvert &raquo; mont&eacute;es &agrave; plat. La derni&egrave;re &eacute;tape consiste &agrave; injecter un colorant fluorescent afin de visualiser les projections axonales. Enfin, la microscopie fluorescente est utilis&eacute;e pour observer &agrave; la fois les cellules subissant un silen&ccedil;age g&eacute;nique et &eacute;valuer les effets subs&eacute;quents sur le guidage des axones commissuraux.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est l'inactivation spécifique de gènes selon le type cellulaire. Pour préparer les plasmides, consulter le protocole écrit pour obtenir les instructions. Incuber les œufs à 38,5 degrés Celsius et à une humidité d'environ 45

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Cette vidéo montre comment visualiser les voies axonales des groupes génétiquement définis des neurones de la moelle épinière embryonnaire de poulet en...

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Électroporation in utero est une méthode utile pour transfecter des cellules progénitrices neuronales in vivo. Selon le placement des électrodes et la période de développement de l'électroporation, certains sous-ensembles de cellules corticales peuvent être ciblées. Cellules ciblées peuvent ensuite être analysées in vivo ou in vitro des effets de l'altération génétique.

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

Électroporation in utero permet la livraison rapide dans un gène spatialement et temporellement contrôlée manière le développement du système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici un très adaptables dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être utilisé pour livrer des constructions d'expression dans de multiples domaines du SNC embryonnaire, y compris le télencéphale, diencéphale et la rétine.

Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l&#39;aide In Utero L&#39;électroporation

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Contrôle de l'expansion des cellules souches somatiques est un facteur majeur qui pèse sur leurs études et leur utilisation en thérapie. Ici, nous décrivons un système à contrôler temporellement les cellules souches neurales l'expansion au cours du développement et de l'âge adulte, ce qui peut être utilisé pour augmenter le nombre de neurones générés dans le cerveau de souris.

Expansion du embryonnaires et cellules souches neurales adultes par<em&gt; In Utero</em&gt; Électroporation ou virale par injection stéréotaxique

L'expression ectopique est une technique permettant d'éclaircir le rôle des microARN dans le développement du cerveau. Cependant, le ciblage des zones spécifiques à l'aide de l'électroporation in ovo est un défi. Ici, nous montrons de manière efficace à des régions du mésencéphale ventral et dorsal sélectivement l'électroporation.

Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale

Nous présentons transgénèse transitoire et knockdown de gènes dans Ciona intestinalis, un groupe de soeur chordés aux vertébrés, en utilisant des techniques de microinjection et électroporation. Ces méthodes facilitent la génomique fonctionnelle dans cet invertébré simple qui comporte des caractéristiques rudimentaires de vertébrés, y compris notochorde et la tête épithéliums sensorielle, et de nombreux orthologues de gènes de maladies humaines associées.

La micro-injection et l&#39;électroporation d&#39;embryons dans le chordés<em&gt; Ciona intestinalis</em

Nous avons développé une nouvelle approche de perte de fonction qui implique l’introduction et l’intégration génomique de séquences artificielles de micro-ARN dans des embryons de poussins en utilisant l’électroporation in ovo et le système de transposon Tol2. Cette technique fournit une méthodologie robuste et stable pour l’étude de la fonction des gènes au cours du développement.

Approche de perte de fonction dans la rétine embryonnaire du poussin en utilisant l’expression transgénique médiée par le transposon Tol2 de microARN artificiels

Dans ce protocole, nous décrivons comment injecter le lentivirus à la cavité amniotique de la souris à E7.5, conduisant à une transduction uniforme de toute la plaque neurale, avec des effets néfastes minimes sur la survie ou le développement embryonnaire.

Ciblage de la plaque neurale murine par nano-injection in utero (NEPTUNE) au jour embryonnaire 7,5

Découvrez l'électroporation in ovo de miARN plasmidiques dans le tube neural du poulet pour étudier le guidage des axones commissuraux. Cette méthode permet de visualiser les défauts de guidage axonal par microscopie fluorescente.

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