Name: En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et lévaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 41 s
Description: Découvrez l'électroporation in ovo de miARN plasmidiques dans le tube neural du poulet pour étudier le guidage des axones commissuraux. Cette méthode permet de visualiser les défauts de guidage axonal par microscopie fluorescente.

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Travail dans le laboratoire de l&#39;ES est soutenu par le Fonds national suisse de la science. Nous tenons à remercier le Dr Beat Kunz de l&#39;aide pour le tournage.

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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Cette simple, basée sur un vecteur d&#39;expression artificielle stratégie miRNA peut être utilisé pour l&#39;expression du gène endogène effet de choc dans le tube neural poulet. Ces outils fonctionnels offrent gene silencing multiple, contrôle temporel et une spécificité de type cellulaire, afin de faciliter l&#39;élucidation des voies de développement complexes. En particulier, nous avons démontré l&#39;utilité de ces plasmides dans le guidage axonal commissurale, depuis les plasmides peuvent être utilisés à des gène...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> 0,5 mm capillaires en verre </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B120F-4 </td></tr><tr><td> Verre aiguille extracteur </td><td> Narishige </td><td> PC-10 </td></tr><tr><td> Electroporateur </td><td> BTX </td><td> ECM 830 </td></tr><tr><td> Sylgard élastomère de silicone </td><td> World Precision Instruments </td><td> SYLG184 </td></tr><tr><td> Fil de tungstène, 0,075 mm </td><td> World Precision Instruments </td><td> TGW0325 </td></tr><tr><td> Broches d&#39;insectes, 0,20 mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-20 </td></tr><tr><td> Broches d&#39;insectes, 0,10 mm </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26002-10 </td></tr><tr><td> Ciseaux à ressort </td><td> Fin Pour la Scienceols </td><td> 15003-08 </td></tr><tr><td> Dumont # 5 forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-20 </td></tr><tr><td> Dumont # 55 pince </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11255-20 </td></tr><tr><td> Rapide Dil </td><td> Molecular Probes </td><td> D-7756 </td></tr><tr><td> Microscopes à fluorescence </td><td> Olympe </td><td> SZX12, BX51 </td></tr></tbody></table>

en électroporation in ovo de miarn à base de plasmides dans le tube neural développement et l&#39;évaluation des phénotypes par injection dans dil livre ouvert préparatifs

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissuraux EL1 neurones ont été étudiés afin d&#39;élucider les mécanismes qui sous-tendent le guidage axonal pendant 1,2 développement. Ces neurones sont situés dans la moelle épinière dorsale et envoient leurs axones le long de trajectoires stéréotypées. Axones commissuraux d&#39;abord projeter vers le ventre, puis à travers la plaque de sol. Après avoir traversé la ligne médiane, ces axones faire un virage serré rostrale et le projet longitudinalement vers le cerveau. Chacune de ces étapes est régie par les activités coordonnées de signaux de guidage attractives et répulsives. L&#39;interprétation correcte de ces signaux est essentielle pour guider les axones le long de leur parcours délimité. Ainsi, la contribution d&#39;une molécule physiologique particulier pour le guidage axonal commissure est idéalement étudiée dans le cadre de l&#39;embryon vivant. En conséquence, inactivation génique in vivo doit être contrôlée avec précision afin de bien distinguer les activités de guidage des axones des gènes qui pourraient jouer multiplerôles au cours du développement. Nous décrivons ici une méthode pour l&#39;expression des gènes effet de choc dans le tube neural de poulet dans une cellule spécifique du type, de façon traçable. Nous utilisons de nouveaux vecteurs plasmidiques 3 Hébergement cellulaires spécifiques au type de promoteurs / amplificateurs qui alimentent l&#39;expression d&#39;un marqueur fluorescent protein, suivie directement par une transcription miR30-RNAi 4 (situé au sein de la 3&#39;-UTR de l&#39;ADNc codant pour la protéine fluorescente) ( Figure 1). Lorsque électroporation dans le tube neural en développement, ces vecteurs susciter la régulation négative de l&#39;expression génique efficace et d&#39;exprimer vives protéines marqueurs fluorescents pour permettre le traçage directe des cellules qui connaissent knockdown 3. Mélanger différents vecteurs d&#39;ARNi avant l&#39;électroporation permet l&#39;effet de choc simultanée de deux ou plusieurs gènes dans les régions indépendantes de la moelle épinière. Cela permet de complexes interactions cellulaires et moléculaires qui seront examinées au cours du développement, d&#39;une manière qui est rapide, smise, précis et peu coûteux. En combinaison avec Dil tracé des trajectoires des axones dans commissurales à livre ouvert préparations 5, cette méthode est un outil utile pour les études in vivo des mécanismes cellulaires et moléculaires de la croissance axonale commissurale et d&#39;orientation. En principe, n&#39;importe quel promoteur / amplificateur peut être utilisé, ce qui pourrait rendre la technique plus largement applicable pour les études in vivo de la fonction des gènes au cours du développement 6. Cette vidéo montre d&#39;abord comment manipuler et oeufs de fenêtres, l&#39;injection de plasmides d&#39;ADN dans le tube neural et la procédure d&#39;électroporation. Pour étudier le guidage axonal commissurale, la moelle épinière est enlevée de l&#39;embryon comme une préparation à livre ouvert, fixé, et injecté avec Dil pour permettre voies axonales à tracer. La moelle épinière est monté entre lamelles et visualisées par microscopie confocale.

Procédé par lequel l&#39;expression du gène dans le tube neural peut être régulée à la baisse dans une cellule spécifique d&#39;un type, est décrit de façon traçable. Nous montrons comment<em&gt; In ovo</emÉlectroporation&gt; des microARN à base de plasmides qui suscitent spatio-temporellement contrôlée ARN interférence peut être utilisée pour étudier le guidage axonal commissurale dans le tube neural développement.

En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l&#39;évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs

Les neurones commissuraux dI1 ont été largement étudiés afin d'élucider les mécanismes sous-jacents au guidage axonal pendant le développement1,2. Ces neurones sont ...

L'objectif de cette procédure est d'évaluer les défauts de guidage des axones dans le tube neural de poulet après une diminution de l'expression génique réalisée de manière traçable et spécifique à un type cellulaire. Cette étape est réalisée en préparant des œufs de poulet fécondés pour une électroporation *in ovo*, en découpant une fenêtre dans la coquille. La deuxième étape consiste à injecter et à électroporater des constructions d'ADN codant des microARNs dans le tube neural.Ensuite, les moelles épini&egrave;res &eacute;lectropor&eacute;es sont diss&eacute;qu&eacute;es et fix&eacute;es en pr&eacute;parations &laquo; livre ouvert &raquo; mont&eacute;es &agrave; plat. La derni&egrave;re &eacute;tape consiste &agrave; injecter un colorant fluorescent afin de visualiser les projections axonales. Enfin, la microscopie fluorescente est utilis&eacute;e pour observer &agrave; la fois les cellules subissant un silen&ccedil;age g&eacute;nique et &eacute;valuer les effets subs&eacute;quents sur le guidage des axones commissuraux.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est l'inactivation spécifique de gènes selon le type cellulaire. Pour préparer les plasmides, consulter le protocole écrit pour obtenir les instructions. Incuber les œufs à 38,5 degrés Celsius et à une humidité d'environ 45 % jusqu'à l'obtention du stade de développement souhaité. Pour étudier l'orientation des axones des neurones commissuraux, incuber les embryons pendant environ trois jours jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade 17 à 18 selon Hamburger et Hamilton.Une fois le stade de développement souhaité atteint et avant que la protéine d'intérêt ne s'accumule dans l'embryon, retirez les œufs de l'incubateur et placez-les en position horizontale stable pendant 20 minutes afin de repositionner l'embryon au-dessus du jaune, à la partie supérieure de l'œuf. Après que les embryons se soient repositionnés au-dessus du jaune, sortez les œufs de l'incubateur et essuyez-les avec de l'éthanol à 70 %. Ensuite, appliquez une bande de ruban adhésif le long de l'axe longitudinal de l'œuf et utilisez un scalpel pour percer un petit trou à l'extrémité arrondie de l'œuf ainsi qu'un autre à l'angle de la zone à ouvrir.Insérez ensuite une seringue équipée d'une aiguille de calibre 18 dans le trou situé à l'extrémité émoussée de l'œuf, selon un angle de 45 degrés, et aspirez environ trois millilitres d'albumine tout en prenant soin de ne pas endommager le jaune. Utilisez de petites ciseaux tenues horizontalement pour découper une fenêtre dans l'œuf sans endommager l'embryon. Scellez ensuite la fenêtre à l'aide du ruban adhésif.Enfin, utilisez un pinceau pour appliquer de la cire de paraffine fondue afin de sceller le trou à l'extrémité émoussée de l'œuf et de combler toute fissure sur l'œuf de la même manière. Replacez ensuite l'œuf dans l'incubateur. Répétez le processus pour tous les œufs à électroporer.Retirez le ruban adhésif de l'un des œufs fenêtrés et déterminez le stade de l'embryon selon Hamburger et Hamilton. Utilisez ensuite une pince pour soulever les membranes extra-embryonnaires à partir de la moitié cordonale de l'embryon, au niveau des grandes veines vitellines droite et gauche. Pénétrez doucement dans le tronc, déchirez ou coupez délicatement les membranes avec des ciseaux à ressort et rabattez-les vers la queue.Utilisez maintenant une aspiration douce pour charger le mélange d'ADN à électroporer dans une microcapillaire en verre munie d'un tube. Insérez la microcapillaire dans le canal central du tube neural juste au-dessus des membres postérieurs et injectez la solution d'ADN en contrôlant le volume d'injection par la bouche. Le colorant bleu doit s'étendre depuis l'extrémité de la queue jusqu'au ventricule du cerveau en développement.Ajoutez quelques gouttes de PBS stérile au-dessus de l'embryon et placez les électrodes parallèlement à l'axe antéro-postérieur de l'embryon sans toucher l'embryon ni aucun vaisseau sanguin. Ensuite, maintenez les électrodes immobiles et électroporez. Après l'électroporation, retirez les électrodes et rincez rapidement avec de l'eau stérile pour éliminer les protéines dénaturées du blanc d'œuf.Enfin, déposez un peu plus de PBS stérile sur l'embryon, puis refermez l'œuf avec du ruban adhésif. Comme précédemment, un scellement correct est essentiel pour éviter la déshydratation de l'embryon. Replacez ensuite l'embryon dans l'incubateur jusqu'à ce que le stade de développement souhaité soit atteint.Lorsque l'embryon atteint le stade 25 à 26 selon Hamburger Hamilton, utilisez une pince pour retirer l'embryon de l'œuf et placez-le dans une boîte de Pétri recouverte d'élastomère Sil-Guard. Utilisez la pince pour enlever les membranes extra-embryonnaires et disposez l'embryon avec le côté dorsal vers le bas. Utilisez ensuite des épingles d'insecte de 0,2 millimètre pour étirer doucement l'embryon et le fixer par le cou et la queue.Ensuite, épingler les membres de l'embryon en insérant les épingles en biais afin qu'elles n'entravent pas la dissection ultérieure. Illuminer la boîte contenant l'embryon par en dessous pour pouvoir percevoir la densité des tissus. Utiliser des ciseaux à ressort pour ouvrir la cavité abdominale et gratter délicatement avec une pince afin d'extraire le cœur et les organes internes.Lorsque tous les organes ont été entièrement retirés, les vertèbres segmentées et la moelle épinière seront visibles. Ensuite, faites pivoter l'embryon de 180 degrés et utilisez des ciseaux à ressort pour pratiquer une incision superficielle à travers les vertèbres recouvrant la moelle épinière au niveau du cou. Puis effectuez deux courtes incisions longitudinales à travers les vertèbres de chaque côté de la moelle épinière, du cou jusqu'à la queue.Utilisez une pince pour soulever les vertèbres à volet loin de la moelle épinière, puis détachez les vertèbres en une seule bande en direction de la queue. Étirez ensuite délicatement l'embryon et repinez-le par la queue et les membres. Identifiez maintenant les méninges de la moelle épinière, qui doivent apparaître comme une ligne sombre et dense de tissu entre le tube neural et les ganglions de la racine dorsale, puis utilisez une aiguille stérile ou un fin scalpel microchirurgical pour inciser longitudinalement les méninges le long de chaque côté de la moelle, de la nuque jusqu'à la queue.Les méninges doivent se détacher facilement de la moelle épinière en raison de l'étirement de l'embryon fixé par épingles. Enfin, sectionner la moelle épinière au niveau du bourgeon pectoral et caudal au bourgeon limbique. Puis, utiliser une pince pour extraire la moelle épinière par un mouvement rostro-caudal tout en veillant à ce qu'elle reste immergée dans le PBS First.Étaler la moelle épinière isolée sur une spatule et la transférer dans une nouvelle boîte revêtue de sylgard contenant du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS. Ensuite, épingler soigneusement la moelle épinière de façon radiaire vers le milieu et à intervalles réguliers à l’aide d’épingles d’insecte de 0,1 millimètre afin d’obtenir une préparation en montage plat, puis incuber dans le paraformaldéhyde pendant 30 minutes à une heure. Veiller à ne pas trop fixer.Cela augmentera le bruit de fond et réduira l'efficacité de la diffusion du diodure. Versez ensuite soigneusement le paraldéhyde et remplacez-le par du PBS. Après avoir préparé cinq milligrammes par millilitre de fast di dans l'éthanol, cassez délicatement l'extrémité d'une micro-pipette en verre de petit diamètre fixée à un tube en plastique et aspirez la solution dans la pipette iet.Insérez l'aiguille remplie dans une boîte de Pétri contenant du PBS et vérifiez que le colorant ne fuit pas de l'aiguille. S'il fuit, le diamètre est trop grand et une nouvelle aiguille doit être préparée. Assurez-vous que la préparation en livre ouvert est éclairée par en dessous et repérez la bande longitudinale plus dense située à environ un cinquième de la largeur du demi-livre par rapport au bord latéral ; les corps cellulaires des neurones commissuraux se trouvent juste au-dessus de cette ligne sombre.Insérez la pointe de la micropipette en verre dans le tissu, et lors du retrait de l'aiguille, soufflez une petite quantité de D eye à l'aide d'une pipette buccale. Répétez rapidement cette procédure tous les 0,5 millimètre le long de la préparation en livre ouvert. Une fois les injections terminées, utilisez une pipette de transfert pour aspirer et jeter tout excès de di. Le non-respect de cette étape entraînera un fond élevé.Répétez la procédure pour toutes les préparations en livre ouvert. Ensuite, placez la boîte contenant les préparations injectées à quatre degrés Celsius pendant environ trois jours afin de permettre au colorant de se répandre le long des axones. Au terme de cette période, montez les préparations conformément aux instructions du protocole écrit.Des coupes transversales et des livres ouverts ont été obtenus à partir d'embryons de poulet au stade 25 à 26 de Hamilton-Hamburger ayant subi une électroporation au stade 18 de Hamilton-Hamburger. Comme on le voit ici en coupe transversale, le promoteur de la bêta-actine induit une expression ubiquitaire. La flèche indique la direction dorso-ventrale.Cette image montre un exemple de patrons d'expression de protéines fluorescentes obtenus après électroporation des vecteurs plasmidiques. Ici, une expression ubiquitaire provenant du promoteur de l'actine bêta est observée dans une préparation en livre ouvert. La flèche indique la direction rostrale de la corde.Cette image montre une coupe transversale après électroporation avec un construct contenant un amplificateur math one. Celui-ci induit une expression dans les neurones di one. Ici, l'expression provenant du construct amplificateur math one est visible dans une préparation en livre ouvert.Cette coupe transversale montre l'expression provenant de l'enhancer hawk A one après électroporation bilatérale du vecteur. L'enhancer hawk A one induit une expression spécifique dans la plaque du plancher. Cette préparation en livre ouvert montre le profil d'expression du vecteur hawks a one dans la plaque du plancher.Cette image montre une image en champ clair des sites d'injection de Dai. Dans une préparation en livre ouvert, Dai a été injecté selon un motif ponctuel près de la marge latérale du livre ouvert. Sur le côté électro-exposé, cette image montre la visualisation de l'expression de la GFP dans la même préparation, et ici, Dai est visualisé.Après trois jours de diffusion, les commissures le long des trajectoires devraient pouvoir être visualisées en microscopie fluorescente. Les trajectoires normales des axones croîtront vers la plaque du plancher, traverseront la plaque du plancher, puis s'orienteront et poursuivront leur croissance, comme illustré ici.Les phénotypes anormaux résultant d'un abaissement de l'expression génique, comme celui illustré ici, peuvent être comparés à la trajectoire archétypique. Dans cet exemple, certains axones s'arrêtent au niveau de la plaque motrice ou effectuent des changements de direction erronés du côté controlatéral. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de faire preuve de prudence et de patience tout au long des étapes délicates d'injection et de dissection.Ces manipulations nécessitent un peu d'entraînement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment injecter des plasmides ARNi afin d'étudier la fonction des gènes pendant le développement du tube neural de manière spécifique à un type cellulaire.

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Découvrez l'électroporation in ovo de miARN plasmidiques dans le tube neural du poulet pour étudier le guidage des axones commissuraux. Cette méthode permet de visualiser les défauts de guidage axonal par microscopie fluorescente.

En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et lévaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs (Vidéo) | JoVE Journal

En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l'évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs

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