L'insecte Galleria mellonella Comme un modèle d'infection puissant pour étudier la pathogenèse bactérienne

L’objectif général de cette procédure est d’infecter les larves d’insectes Galleria melanoma avec des bactéries pathogènes. Pour ce faire, les larves d’insectes sont débarrassées au stade de croissance approprié et une solution bactérienne est préparée. La larve est ensuite infectée par la bactérie par injection intra-hémophilique ou par gavage. La mortalité larvaire est ensuite surveillée sur une période de 48 heures.

L’analyse des données résultantes décrit la virulence bactérienne dans un modèle d’infection chez l’insecte. Les insectes présentent l’avantage d’avoir un système avancé de défenses antimicrobiennes, et en particulier, ils possèdent un système immunitaire inné complexe, ce qui permet d’éviter les problèmes de coût et d’éthique qui peuvent être rencontrés lors de l’utilisation de modèles de mammifères. Les insectes constituent un excellent modèle alternatif pour l’infection des mammifères.

Nous travaillons avec les larves de la grande teigne de la cire, qui sont relativement grandes et peuvent être utilisées pour des études d’infection menées entre 15 et plus de 37 degrés. Pour imiter un environnement de mammifère, Carina NI fera une démonstration de la procédure d’élevage et Elizabeth GME et Christophe Beon feront une démonstration des protocoles d’infection. Le cycle complet de l’œuf à la dernière chez les larves étoilées dure environ cinq semaines.

À 25 degrés Celsius, une ou deux semaines supplémentaires sont nécessaires pour obtenir des papillons adultes. Les papillons mâles mesurent de 10 à 15 millimètres. Le papillon mâle adulte est beige avec de faibles marques claires et foncées.

Les papillons femelles mesurent environ 20 millimètres. Les femelles sont plus foncées que les mâles avec une couleur brune à grise place au moins 100 papillons puy ou mélanome de gène adulte nouvellement fusionné. Dans une cage en treillis métallique de cinq litres, suspendez deux paquets de papier à quatre couches dans la cage pour la ponte des œufs.

Après deux jours, la femelle adulte pondra des œufs sur le bord entre les feuilles deux fois par semaine. Placez les paquets de papier d’œuf dans de nouvelles boîtes d’élevage en plastique avec des grilles pour laisser l’air circuler. Les boîtes doivent contenir du pollen et de la cire d’abeille comme source de nourriture.

Les œufs éclosent au bout de trois jours environ, et les petites larves commencent à se développer en se nourrissant de cire et de pollen pour fournir un rapport approprié de nourriture par lave. Séparez régulièrement les larves dans de nouvelles boîtes et réapprovisionnez la nourriture tous les deux jours. Les larves sont élevées au cours des six stades du stade larvaire.

Chaque stade est caractérisé par le glissement de la capsule couvrante des larves. Lorsque les larves ont atteint le dernier stade avant la pation, elles ont cessé de se nourrir et ont commencé à construire un cocon de soie légère dans leurs cocons protecteurs. Les larves se reposeront et se transformeront en puby. Cire.

Les vers restent au stade de caca pendant une à deux semaines avant de devenir des papillons adultes. Les papillons adultes ne boivent pas et ne mangent pas. L’accouplement a lieu et le cycle de vie des vers de cire recommence.

Pour normaliser le test de pathologie, prélever les larves au dernier stade larvaire. Au cours de cette étape, ils cessent de se nourrir, se déplacent vers le couvercle de la boîte d’élevage et commencent à produire de la soie. Cette étape dure environ cinq jours, après quoi les larves commencent à rétrécir.

Le cocon s’épaissit et les larves se cristallisent. À tout moment pendant le stade larvaire, retirez le cocon de soie naissant. Sélectionnez les larves étoiles en dernier, qui mesurent deux à trois centimètres de long et pesant de 180 à 250 milligrammes, 24 heures avant l’infection et mettez-les dans une boîte vide pour les affamer.

Les suspensions de priscilles, de bactéries ou de spores sont préparées comme décrit dans le document d’accompagnement à des concentrations finales, allant de 10 à quatre unités formant colonies par millilitre à 10 à huit unités formant colonies par millilitre. Chaque lave recevra 10 microlitres de suspension à la concentration souhaitée Pour préparer la culture de toxine C, la souche CI 4 0 7 transformée avec le plasmide PHTF 31 C, portant le gène codant pour cri un C dans 100 millilitres, milieu HCT avec 10 milligrammes par millilitre, érythromycine et 30 degrés Celsius pendant 72 heures. Cela permettra la sporulation complète de la toxine, la production de cristaux et la libération dans le milieu de culture.

Pour purifier les cristaux de la culture bactérienne, préparez un gradient de saccharose dans un tube de 40 millilitres. Tout d’abord, ajoutez 17 millilitres de saccharose à 79 %. Ensuite, superposez soigneusement 17 millilitres de saccharose à 72 % sur les 79 % de saccharose.

Enfin, superposez cinq à six millilitres de la culture de sporulate concentrée 10 X et fermez le tube, centrifugez le tube pendant 14 heures à 20 000 fois G à quatre degrés Celsius pour séparer les cristaux des spores. Les cristaux de toxine se déposeront à l’interface du gradient tandis que les spores denses atteindront le fond du tube. Utilisez une pipette pour collecter les cristaux, puis centrifugez-les à 20 000 fois.

G.Après le spin reus, suspendez la palette de cristaux dans 25 millilitres d’eau froide et stérile pour la laver en centrifugeant à 8 000 fois G.Cette étape est répétée trois fois pour éliminer tout le saccharose collé dans les cristaux. Après l’isolement des cristaux, mettez les cristaux en suspension dans cinq millilitres d’eau stérile et observez au microscope. Pour évaluer la pureté, évaluez la concentration en protéines de la toxine par coloration classique de Bradford sur une solution cristalline pré-solubilisée dans de l’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires.

La toxine peut être stockée à moins 20 degrés Celsius avant utilisation. Ensuite, les insectes seront injectés avec la solution bactérienne. Pour chaque condition, remplissez une seringue hypodermique d’un millilitre par condition avec 300 microlitres d’eau ou la solution bactérienne pour l’infection de 20 à 25 larves.

Retirez les bulles en tapotant soigneusement la seringue. Fixez ensuite une aiguille de 0,45 x 12 millimètres à la seringue. Placez la seringue dans un pousse-seringue automatisé avec une vitesse de mise en marche d’un microlitre par seconde et réglez un volume de 10 microlitres.

Effectuez une injection à blanc de 10 microlitres dans un tube vide pour contrôler le volume injecté. Placez l’insecte manuellement entre le pouce et l’index. Insérez ensuite l’aiguille fixée dans l’injecteur dans la peau de lave ou la cuticule à la base du dernier prol, et injectez 10 microlitres de la solution bactérienne.

Retirez délicatement l’insecte de l’aiguille. Placez l’insecte infecté dans une boîte de Pétri de cinq centimètres. Cinq larves par plat, infecter au moins 20 larves pour chaque condition expérimentale, placer les plats à 37 degrés Celsius dans un incubateur.

Les insectes peuvent également être infectés par voie orale, comme le montre cette section de la vidéo, dans un tube d’aile de deux millilitres. Mélangez 0,2 microgramme par microlitre de toxine cryo un C avec des spores ou une suspension de cellules végétatives pour obtenir des concentrations finales allant de trois fois 10, trois à une fois 10, six par 10 microlitres de remplissage, une seringue d’un litre équipée d’une aiguille hypodermique de calibre 30 de 25 millimètres avec 300 microlitres de cri bactérien. Une solution de toxine C pour l’infection de 20 à 25 larves.

Retirez les bulles de la seringue, placez manuellement l’insecte de manière à ce que sa bouche pénètre dans l’aiguille fixée dans l’injecteur et nourrissez-le de force avec 10 microlitres de solution bactérienne. À l’aide du pousse-seringue automatisé après l’injection orale, la solution se répandra dans l’intestin de l’insecte. Dans cet exemple, 10 microlitres de solution de colorant bleu sont introduits.

Remarquez que le colorant remplit rapidement la lumière intestinale des larves d’insectes Après que l’insecte a ingéré la solution, placez-la dans une petite boîte de Pétri de cinq centimètres, infectez au moins 20 larves pour chaque condition expérimentale, placez cinq larves dans chaque boîte Après des expériences d’alimentation forcée ou d’injection. Gardez les larves dans la boîte de Pétri sans nourriture à 25 degrés Celsius ou 37 degrés Celsius, vérifiez régulièrement la mortalité larvaire. Sur une période de 48 heures, les larves mortes sont brunes à noires et mobiles inconnues.

À la fin des expériences, libérez toutes les larves vivantes à moins 20 degrés Celsius pendant 24 heures dans un sac autoclave, puis autoclavez-les pour tuer toutes les bactéries. Analysez les données de mortalité à l’aide d’un logiciel de log prob bit ou d’un logiciel similaire. Ce programme teste la linéarité des courbes de mortalité liée aux doses et fournit des doses létales.

L’injection intra-hémophilique de bactéries DL 50 dans g Melan s’est avérée très utile pour l’identification de nombreux facteurs de virulence traitant des lésions tissulaires et de la résistance aux facteurs immunitaires innés de plusieurs pathogènes humains afin de déterminer le rôle de la paroi cellulaire bactérienne potentielle Peptidase C-W-P-F-M dans la mortalité des insectes virulents, après que diverses doses de souches de type sauvage et mutantes de bactéries BOU ont été évaluées comme indiqué ici. La mortalité des insectes dépendait de la dose, mais diminuait considérablement lorsque les larves recevaient la bactérie avec la mutation CWP fm. Ainsi, cette peptidase de la paroi cellulaire joue un rôle crucial lors de la virulence sérieuse de Priscilla envers les larves d’insectes pour démontrer l’effet synergique des spores de l’autre sur l’activité insecticide de la toxine cryo un C Les cristaux de la cryo un c ont été ajoutés aux spores de la souche de type sauvage de l’autre et donnés à Galleria.

Des beys de mélanome sans cristaux ont été utilisés comme contrôle. Après 48 heures à 25 degrés Celsius, la mortalité des larves a été évaluée comme le montre ce graphique, le taux de mortalité après l’ingestion d’un mélange de toxine sporeuse est significativement plus élevé que le taux de mortalité après l’ingestion d’une toxine C cryogénique ou l’ingestion de spores seules. Cela démontre un effet synergique, les spores ou les bactéries végétatives sur l’activité insecticide de la toxine cryo C.

Le rôle de la cryo un C dans le mélanome Galleria est d’aider les bactéries à traverser la matrice para atrophique, une structure riche en chitine et en mucus protégeant l’intestin des insectes du contact direct avec les aliments et les agents pathogènes. L’utilisation d’insectes, en particulier au stade de niveau, comme modèles d’infection pour plusieurs agents pathogènes, est de plus en plus courante. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de réaliser des infections hémel et buccales, et nous appelons la mortalité des insectes dans le gallium melan.

Ces méthodes peuvent être facilement appliquées à d’autres systèmes modèles tels que les espèces bombex, ma et spotter, car ces génomes ont été séquencés, de sorte que les hôtes peuvent être arrêtés par des méthodes d’ARN ou d’autres manipulations génétiques.