Name: 1 F O ATPase Vesicle Préparation et Technique for the Performing Patch enregistrements de serrage des membranes des vésicules submitochondriales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Apprenez à isoler des vésicules submitochondriales enrichies en ATP synthase F1FO à partir de cerveau de rat. Cette méthode permet d'étudier l'activité enzymatique par enregistrements patch clamp.

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1. Cerveau mitochondrial Isolation (Adapté de Brown MR et al. 9) <ol><li> Sacrifier le rat en utilisant des méthodes approuvées par le Comité d&#39;utilisation Institutional Animal Care et (IACUC). </li><li> Couper la tête de l&#39;animal par décapitation, couper la peau et exposer le crâne. </li><li> Ouvrez le crâne doucement en coupant avec des ciseaux ou rongeur. Retirez le cerveau. </li><li> Hacher finement le cerveau sans cervelet dans le tampon d&#39;isolement (voir tableau 1) et de le transférer à un ml en verre / téflon homogénéisation 5 (voir la liste de l&#39;équipement). </li><li> Homogénéiser les tissus doucement 10 fois (sans bulles), environ 5 min. </li><li> Centrifuger à 1500 g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse. </li><li> Enregistrer le surnageant (mitochondrial et synaptosomes) et jeter le culot (matières nucléaires et débris cellulaires). Centrifuger à 16000 g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse. </li><li> Jetersurnageant et remettre en suspension le culot dans 500 ul de tampon d&#39;isolement. Perturber synaptosomes avec un navire de la perturbation de la cellule (voir la liste de l&#39;équipement). Appliquer une pression de 1200 psi pendant 10 minutes, suivie d&#39;une décompression rapide. </li><li> Couche du mélange sur Ficoll gradients (voir tableau 2), lieu SW-50.1 rotor et centrifuger à 126.500 g pendant 20 min à 4 ° C dans une ultracentrifugation (voir la liste de l&#39;équipement). Le culot est les mitochondries purifiées, la couche entre les différentes densités de Ficoll est synaptosomes sans perturbation. </li><li> Lavez granulés par centrifugation dans un tampon d&#39;isolement à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse. </li></ol> 2. Submitochondriales vésicules (SMV) Isolation (Adapté de Chan et al. 10) <ol><li> Re-suspendre mitochondries dans 200 tampon d&#39;isolement ul combiné avec un volume égal de digitonine à 1% et laisser reposer sur la glace pendant 15 min. </li><li> Ajouter plus Buff Isolationer et centrifuger à 16000 g pendant 10 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse. Pour ce faire, deux fois. </li><li> Re-suspendre le culot dans 200 ul de tampon d&#39;isolement et ajouter 2 pi de 10% Lubrol PX (C12E9). Mélanger et laisser reposer sur la glace pendant 15 min. </li><li> mélange de la couche tampon sur d&#39;isolation, lieu SW-50.1 rotor et centrifuger à 182 000 xg à 4 ° C pendant 1 heure. </li><li> Laver le culot final par centrifugation dans une centrifugeuse bureau haut dans le tampon d&#39;isolement à 16.000 g pendant 10 min à 4 ° C. </li></ol> 3. L&#39;enregistrement électrophysiologique <ol><li> Un dispositif typique électrophysiologique comprend un amplificateur, un ordinateur de type PC équipé d&#39;une interface de convertisseur analogique-numérique Digidata 1440A en conjonction avec le logiciel pClamp10.0, manipulateurs, un microscope, une table d&#39;isolation de vibration, cage de Faraday. </li><li> Tubes capillaires de verre borosilicate sont insérés dans un Flaming / Brown Micropipette Extracteur modèle P-87. Un programme pipette extracteur est optimisé pourgénérer des pipettes avec résistances entre 80 à 100 MQ. </li><li> SMVS sont placés dans une solution physiologique intracellulaire (ATP est ajoutée au moment approprié au cours de l&#39;enregistrement) (tableau 3). pipettes de patch-clamp sont remplis avec la même solution (pas ATP). Les enregistrements sont effectués en formant un joint giga-ohms sur SMVS à la température ambiante. Les vésicules sont visualisées par microscopie à contraste de phase avec un microscope inversé Nikon ou Zeiss. </li><li> Le potentiel de la membrane est maintenu à des tensions allant de -100 mV à +100 mV pour des périodes de 10 secondes. Les enregistrements sont filtrés à 5 kHz en utilisant le circuit de l&#39;amplificateur. Niveau de bruit électrique ou non-spécifique parasite de moins de 1 pA sont souhaitables pour l&#39;enregistrement réussi. </li><li> Les données sont analysées avec le logiciel Clampfit 10.0 par exemple pour déterminer la fréquence et l&#39;amplitude des événements à un seul canal. La dépendance de tension est déterminée en traçant une relation courant-tension. </li></ol>

<ol><li>Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+factors+with+dual+roles+in+death+and+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial factors with dual roles in death and survival.</a> Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).</li>
<li>Duchen, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+calcium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and calcium in health and disease.</a> Cell Calcium. 44, 1-5 (2008).</li>
<li>Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mitochondrial+membrane+permeability+in+pathogenesis%2C+autophagy+and+control+of+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Modulation of mitochondrial membrane permeability in pathogenesis, autophagy and control of metabolism.</a> J. Gastroenterol. Hepatol. 22, Suppl 1. S31-S37 (2007).</li>
<li>Cox, G. B., Jans, D. A., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothesis.+The+mechanism+of+ATP+synthase.+Conformational+change+by+rotation+of+the+beta-subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hypothesis. The mechanism of ATP synthase. Conformational change by rotation of the beta-subunit.</a> Biochim. Biophys. Acta. 768, 201-208 (1984).</li>
<li>Cox, G. B., Fimmel, A. L., Gibson, F., Hatch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+ATP+synthase%3A+a+reassessment+of+the+functions+of+the+b+and+a+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">The mechanism of ATP synthase: a reassessment of the functions of the b and a subunits.</a> Biochim. Biophys. Acta. 849, 62-69 (1986).</li>
<li>Cory, S., Huang, D. C., Adams, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bcl-2+family%3A+roles+in+cell+survival+and+oncogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The Bcl-2 family: roles in cell survival and oncogenesis.</a> Oncogene. 22, 8590-8607 (2003).</li>
<li>Vander Heiden, M. G., Thompson, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+proteins%3A+regulators+of+apoptosis+or+of+mitochondrial+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 proteins: regulators of apoptosis or of mitochondrial homeostasis.</a> Nat. Cell Biol. 1, 209-216 (1999).</li>
<li>Alavian, K. N., Li, H., Collis, L., Bonanni, L., Zeng, L., Sacchetti, S., Lazrove, E., Nabili, P., Flaherty, B., Graham, M., Chen, Y., Messerli, S. M., Mariggio, M. A., Rahner, C., McNay, E., Shore, G. C., Smith, P. J. S., Hardwick, J. M., Jonas, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-xL+regulates+metabolic+efficiency+of+neurons+through+interaction+with+the+mitochondrial+F1FO+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase.</a> Nat. Cell Biol. 13 (10), 1224-1233 (2011).</li>
<li>Brown, M. R., Sullivan, P. G., Dorenbos, K. A., Modafferi, E. A., Geddes, J. W., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes%3A+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li>
<li>Chan, T. L., Greenawalt, J. W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+ultrastructural+properties+of+a+mitochondrial+inner+membrane+fraction+deficient+in+outer+membrane+and+matrix+activities%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical and ultrastructural properties of a mitochondrial inner membrane fraction deficient in outer membrane and matrix activities.</a> J. Cell Biol. 45 (2), 291-305 (1970).</li>
<li>Young, H. K. o, Delannoy, M., Hullihen, J., Chiu, W., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ATP+Synthasomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ATP Synthasomes.</a> J. Biol. Chem. 278 (14), 12305-12309 (2003).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les procédés décrits ici permettent l&#39;isolement des mitochondries pur à la fin de l&#39;étape 1 et des vésicules submitochondriales (SMVS) après l&#39;étape 2 de cerveau entier, sans distinction de cellules phenotypes.SMVspurified par ce procédé sont essentiellement exempt de contamination par d&#39;autres organelles sous-cellulaires comme indiqué dans Figure 1 et notre travail précédent (Alavian KN et al. 8) et conserver leur intégrité structurale et fonctionnelle avant la congé...

<table><tbody><tr><td>Mortier à tissus Potter-Elvehjem avec pilon en PTFE</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>1-7725T-5</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse Eppendorf 5424 </td><td>Eppendorf</td><td>5424 000.410</td><td></td></tr><tr><td>Récipient de disruption cellulaire 4639</td><td>Parr Instrument Company</td><td>4639</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5415</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger en polycarbonate</td><td>Beckman Coulter</td><td>P20314</td><td></td></tr><tr><td>Rotateur SW-50.1 </td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse L8-70M</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>Lubrol PX (C12E9) </td><td>Calbiochem</td><td>205534</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch 200B </td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440A </td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp10.0</td><td>Molecular Device</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>1308325</td><td></td></tr><tr><td>Tireuse de micropipettes Flaming/Brown modèle P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

<sub&gt; 1</sub&gt; f<sub&gt; o</sub&gt; atpase vesicle préparation et technique for the performing patch enregistrements de serrage des membranes des vésicules submitochondriales

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires importantes, y compris le métabolisme, la survie à 1, le développement et la signalisation calcium 2. Deux des fonctions mitochondriales les plus importants sont liés à la production efficace de l&#39;ATP, la devise de l&#39;énergie de la cellule, par phosphorylation oxydative et la médiation des signaux de mort cellulaire programmée 3. L&#39;enzyme principalement responsable de la production de l&#39;ATP synthase est le F1FO-ATP, aussi appelé ATP synthase 4-5. Au cours des dernières années, le rôle des mitochondries dans la mort cellulaire par apoptose et nécrose a reçu une attention considérable. Dans la mort cellulaire par apoptose, BCL-2 protéines de la famille tels que Bax entrent dans la membrane mitochondriale externe, s&#39;oligomériser et perméabilisent la membrane externe, libérant des facteurs pro-apoptotiques dans le cytosol 6. Dans la mort cellulaire nécrotique classique, telle que celle produite par une ischémie ou excitotoxicité des neurones, un large, augmentation mal régulé en calcium de la matrice contribue à l&#39;ouverture d&#39;un pore de la membrane intérieure, le pore de transition de perméabilité mitochondriale ou mPTP. Cette dépolarise la membrane interne et provoque des changements osmotiques, en contribuant à la rupture de la membrane externe, libération de facteurs pro-apoptotiques, et un dysfonctionnement métabolique. De nombreuses protéines dont la protéine Bcl-xL 7 interagir avec F1FO ATP synthase, de moduler sa fonction. Bcl-xL interagit directement avec la sous-unité bêta de l&#39;ATP-synthase F1FO, et cette interaction diminue une conductance de fuite à l&#39;intérieur de la F1FOATPasecomplex, augmentant le transport net de H + par F1FO pendant F1FO activité ATPase 8 et augmentant ainsi l&#39;efficacité mitochondriale. Pour étudier l&#39;activité et de la modulation de l&#39;ATP synthase, nous avons isolé à partir de rongeurs cerveau submitochondriales vésicules (SMVS) contenant F1FO ATPase. Les SMVS conserver l&#39;intégrité structurelle et fonctionnelle de la F1FO ATPase comme indiqué dans Alavian et al. Ici, nous décrivons une méthodeque nous avons utilisé avec succès pour l&#39;isolement du SMVS de cerveau de rat et nous délimiter la technique de patch-clamp pour analyser l&#39;activité du canal (ion fuite conductance) de la SMVS.

La première étape de notre protocole permet l&#39;isolement des mitochondries purifiées comme indiqué par Western blot à la figure 1. Dans la figure 2 est représenté un exemple de submitochondriales enregistrement de patch des vésicules dérivé du cerveau. Utilisation de la configuration de patch inside-out, nous démontrons l&#39;activité du canal modulé par l&#39;ATP. Le contrôle (CTL) enregistrement (à gauche) montre l&#39;activité du canal multi-conductance avec une conductance pic de...

Une méthode pour isoler les vésicules submitochondriales enrichis en F1FO ATP synthase complexes du cerveau de rat est décrite. Ces vésicules permettent l&#39;étude de l&#39;activité de F1FO complexe ATPase et sa modulation en utilisant la technique de l&#39;enregistrement de patch-clamp.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPase Vesicle Préparation et Technique for the Performing Patch enregistrements de serrage des membranes des vésicules submitochondriales

Les mitochondries sont impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires importantes, notamment le métabolisme, la survie1, le développement et la signalisation calcique2. Deux des plus...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler des vésicules F1 F zéro APAs à partir du cerveau de rat afin d'effectuer des enregistrements en configuration patch clamp. Cela est réalisé en premier lieu en retirant le cerveau d'un rat et en le broyant. La deuxième étape consiste à perturber les zones synaptiques en appliquant une pression.Ensuite, les synaptosomes sont déposés sur les gradients de flacon. La dernière étape consiste à incuber avec la digitonine et le L pour obtenir les vésicules finales destinées à l'enregistrement en configuration patch. Une fonction importante des mitochondries est la production d'ATP par phosphorylation oxydative.L'enzyme responsable de la production d'ATP est l'ATP synthase située dans la membrane interne mitochondriale. Pour étudier en détail la fonction de l'ATP synthase, nous isolons des vésicules sous-mitochondriales particulières que nous appelons des VSM. Elles contiennent l'enzyme ATP synthase dans une configuration inversée (lumière vers l'extérieur).Nous enregistrons ensuite ces PVM à l’aide d’une électrode de micro-patch, et nous déterminons la perméabilité de leur membrane. Cela nous renseigne sur l’efficacité de la production de

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Ceci est conçu comme une introduction à l'enregistrement de patch clamp à partir d'ovocytes de Xenopus laevis. Il couvre l'enlèvement membrane vitelline, la formation d'un joint gigaohm (gigaseal), et la conversion en option du patch à la topologie en dehors-out.

Enregistrement Patch Clamp des canaux ioniques exprimés dans les oocytes de Xenopus

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Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

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1 F O ATPase Vesicle Préparation et Technique for the Performing Patch enregistrements de serrage des membranes des vésicules submitochondriales (Vidéo) | JoVE Journal

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