₁ F _O ATPase Vesicle Préparation et Technique for the Performing Patch enregistrements de serrage des membranes des vésicules submitochondriales

L’objectif global de cette procédure est d’isoler les vésicules F1 F zéro APA du cerveau du rat pour effectuer des enregistrements par pince de patch. Ceci est accompli en retirant d’abord le cerveau d’un rat et en l’homogénéisant. La deuxième étape consiste à perturber les zones synaptiques en appliquant une pression.

Ensuite, les synaptosomes sont superposés sur les gradients de fioles. La dernière étape consiste à incuber avec le doigt toin et L pour obtenir les vésicules finales pour l’enregistrement par patch clamp. Une fonction importante des mitochondries est la production de TP par phosphorylation oxydative.

L’enzyme responsable de la production d’une TP est la A TP synthase située au niveau de la membrane interne mitochondriale. Pour étudier en détail la fonction de l’A TP synthase, nous isolons des vésicules sous-mitochondriales spéciales que nous appelons SMV. Ils contiennent l’enzyme A TP synthase dans une configuration à l’envers.

Nous enregistrons ensuite ces SMV à l’aide d’une électrode patch clamp, et nous déterminons l’étanchéité de leur membrane. Cela nous renseigne sur l’efficacité de la production de TP par les mitochondries. La démonstration de cette procédure aujourd’hui sera assurée par Sylvia ti, boursière postdoctorale dans mon laboratoire à l’Université Yale.

Dans cette procédure, après avoir obtenu la tête d’un rat par décapitation, coupez la peau pour exposer le crâne, puis ouvrez doucement le crâne en le coupant avec une paire de ciseaux ou de Rons. Par la suite, retirez le cerveau, hachez le cerveau sans le cervelet enfin isolé, tamponnez-le, puis transférez-le dans un homogénéisateur en téflon en verre de cinq millilitres homogénéisez doucement le tissu 10 fois, environ cinq minutes au total. Après cela, centrifugez l’échantillon à 1 500 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de paillasse.

Conservez le surnageant avec les mitochondries et le synaptosome et jetez la cuffe. Ensuite, centrifugez-le à nouveau à 16 000 fois, G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de paillasse. Ensuite, jetez le surnageant et remettez le palais en suspension Dans 500 microlitres de tampon d’isolement, perturbez le synaptosome avec un vaisseau de rupture cellulaire en appliquant une pression de 1 200 PSI pendant 10 minutes, suivie d’une couche de décompression rapide les zones synapiques perturbées sur les tubes de centrifugation avec deux concentrations différentes de fial qui formeront deux couches.

Ensuite, placez les tubes dans un rotor SW 50.1 et centrifugez-les à 126, 500 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Dans une ultra-centrifugeuse, le palais est constitué des mitochondries purifiées. La couche entre les différentes densités de fial est le synaptosome non interrompu.

Ensuite, lavez le granulé par centrifugation isolé. Tamponnez à 16 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius dans une centrifugeuse de paillasse. Maintenant, Resus, suspendez les mitochondries dans 200 microlitres de tampon d’isolement, combiné à un volume égal de 1 % de doigt toin.

Placez-le sur de la glace pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez plus d’isolation, de tampon et de centrifugeuse à 16 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Répétez cette procédure deux fois, puis resuspendez le palais dans 200 microlitres de tampon d’isolement, et ajoutez deux microlitres de soutien-gorge 10 %Lu, PX, mélangez et placez sur de la glace pendant 15 minutes.

Après cela, superposez le mélange de manière isolée, tamponnez dans les tubes à centrifuger. Placez les tubes dans un rotor SSW 50.1 et centrifugez-le à 182 000 fois G à quatre degrés Celsius pendant une heure. Au bout d’une heure.

Lavez la palette finale en la centrifugeant dans un tampon d’isolement à 16 000 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Un appareil d’électrophysiologie typique comprend un amplificateur, un ordinateur PC équipé d’un digi data 1 440, une interface de convertisseur analogique-numérique associée à une pince P, des manipulateurs logiciels 10.0, un microscope, une table d’isolation des vibrations et une cage de Faraday. Tout d’abord, tirez une pipette d’un tube capillaire en verre de silicate Boros dans un extracteur de micro-pipette brun flamboyant.

La résistance optimale de la pipette doit être comprise entre 80 et 100 méga ohms. Ajouter les vésicules sous-mitochondriales dans une solution intracellulaire physiologique. Remplissez ensuite une pipette patch clamp avec la même solution.

Visualisez les vésicules sous contraste de phase. Microscopie après que les SMV sont patchés à température ambiante. Enregistrez l’activité lorsque le potentiel de membrane est maintenu à une tension allant de moins 100 millivolts à positif 100 millivolts pendant 10 secondes à chaque période.

Les données enregistrées sont filtrées à cinq kilohertz à l’aide du circuit de l’amplificateur et analysées avec le logiciel clamp fit 10.0. Cette figure montre le transfert de lysat préparé à partir du cytosol et des mitochondries. Le panneau supérieur montre un immuno-transfert utilisant un anticorps contre la protéine cytosolique GA dh.

Le panneau inférieur montre une tache utilisant un anticorps contre la protéine de la membrane interne mitochondriale. Voici deux enregistrements représentatifs de patch clamp avant et après l’ajout d’un millimolaire d’un TP. Le potentiel de maintien est positif à 70 millivolts. La ligne pointillée représente zéro picoampères.

Chaque trace est enregistrée pendant 10 secondes et il y a 10 secondes entre les traces et affichées. Voici les exemples de traces des changements d’intensité de fluorescence de l’indicateur A CMA au cours du temps en présence de SMV et en l’absence et la présence d’un TP. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler les mitochondries, une vésicule sous-mitochondriale contenant des synthés F1 FO 80 TP. De plus, vous devez comprendre notre joint résistant à la forme I avec une électrode sur la membrane de la vésicule pour analyser l’activité du canal du complexe A TP Syntase.