Cytométrie de masse: Protocole pour Tuning quotidien et échantillons cellulaires course sur un cytomètre de masse CyTOF

L’objectif de révision de cette procédure est de démontrer l’accord quotidien et l’analyse d’échantillons appropriés sur un instrument CyTOF. Tout d’abord, la machine est assemblée et mise en marche. Ensuite, les paramètres de l’instrument sont optimisés pour l’accord au signal maximum.

La machine est alors prête à exécuter les échantillons. Dans la dernière étape, la machine est nettoyée et arrêtée. En fin de compte, des données cellulaires optimales peuvent être acquises en fonction des exigences de temps spécifiques.

La démonstration visuelle de cette technique est essentielle. Les procédures quotidiennes de configuration, de réglage et de nettoyage sont difficiles à apprendre à partir du manuel. Comme il y a plusieurs étapes logicielles simultanées impliquées.

Vous devez acquérir de l’expérience pour vous faire une idée des niveaux d’arrière-plan et des intensités de signal appropriés Au moins 15 minutes avant de commencer une expérience. Ouvrez le logiciel CyTOF et sélectionnez la configuration de l’instrument. Ensuite, dans l’onglet de la cage de carte, cliquez sur le bouton d’activation du chauffage pour permettre au manteau de la chambre de pulvérisation d’atteindre 200 degrés Celsius.

Remplacez la seringue dans le pousse-seringue par une seringue fraîche remplie d’eau milli-cube. Nettoyez ensuite le nébuliseur en le rinçant à contre-courant avec 5 % de citron deux fois par l’orifice de préhension. Pour éliminer tout résidu de cédr, répétez le rinçage à contre-courant avec de l’eau Milli Q.

Ensuite, ouvrez le robinet du réservoir de gaz argon, ce qui fait que le voyant Argonne à l’avant de la machine s’allume. Fixez ensuite le nébuliseur à l’entrée du gaz d’appoint et fixez le nébuliseur au tube d’introduction du liquide. Insérez l’extrémité du nébuliseur dans l’ouverture blanche du ballon chauffant sur la languette du contrôleur RFG de la fenêtre de configuration de l’instrument.

Cliquez sur Démarrer plasma, puis sur OK. Une fois le démarrage terminé, cliquez à nouveau sur OK dans la fenêtre contextuelle. Allumez maintenant le tire-seringue.

Lors du remplissage de la seringue, appuyez sur le bouton d’arrêt plutôt que sur le bouton pause pour réinitialiser le compteur de volume Avant d’étalonner le cytomètre de masse, assurez-vous qu’il s’est réchauffé pendant 20 minutes. Une fois la machine stabilisée, cliquez sur le bouton des paramètres d’acquisition pour ouvrir la fenêtre des paramètres d’acquisition des données. Dans l’onglet analytes.

Cliquez sur le tableau périodique pour ouvrir le panneau de sélection des isotopes. Sélectionnez ensuite les isotopes de la solution de réglage DVS sciences répertoriés dans le manuel et cliquez sur Enregistrer. Ensuite, cliquez sur le bouton Isotopes par lecture pour ouvrir la fenêtre des masses par lecture.

Sélectionnez le nombre d’impulsions et redimensionnez l’axe y en saisissant un nouveau nombre, puis en appuyant sur Entrée. Remplissez maintenant une seringue verte d’injection d’un millilitre avec la solution de réglage. Tournez le sélecteur de port d’échantillon pour charger.

Injectez 450 microlitres de solution de réglage, puis tournez le sélecteur pour injecter. Attendez que les isotopes de la solution d’accord commencent à apparaître sous forme de traînées dans cet affichage. Les signaux dans la région du temps de vol, 9, 400 à 9, 800 sont dus aux isotopes du xénon dans le gaz argon.

Revenez maintenant à la fenêtre de lecture des masses et cliquez sur le bouton vert de lecture. Chaque ligne colorée représente les isotopes sélectionnés dans l’onglet analytes. Lorsque les niveaux d’isotopes sont stables, réglez le courant de sélection de courant dans le menu déroulant de l’onglet des paramètres de la fenêtre des paramètres d’acquisition de données.

Dans la fenêtre de démarrage, entrez zéro pour la fin, entrez 10. Pour la valeur du pas, entrez 0,5 et pour le temps de règlement, entrez 200. Cliquez ensuite sur Enregistrer.

Cliquez ensuite sur la fenêtre de lecture des masses et cliquez sur jouer. Après avoir noté où les signaux des isotopes atteignent leur pic, rendez-vous dans l’onglet de configuration du canal DAC de la fenêtre de configuration de l’instrument. Faites défiler jusqu’à actuel et entrez la valeur du pic isotopique.

Cliquez sur Définir la valeur actuelle réelle, puis sur Enregistrer. Ensuite, modifiez le menu déroulant pour compenser le gaz. Entrez 0,55 dans la fenêtre de démarrage, 0,95 dans la fenêtre de fin, 0,05 dans la fenêtre de valeur de pas et 200 dans la fenêtre de temps de règlement.

Cliquez sur Enregistrer. Après être revenu à la fenêtre de masse par lecture et avoir cliqué à nouveau sur lecture, l’axe x affichera maintenant le débit de gaz d’appoint. Notez les valeurs où les signaux des isotopes atteignent leur maximum et observez l’augmentation rapide du signal GD 1 55 vers la fin.

Revenez ensuite à l’onglet de configuration du canal DAC. Faites défiler vers le bas jusqu’à makeup, gas et entrez la nouvelle valeur de pic isotopique. Cliquez sur définir la valeur actuelle réelle.

Cliquez ensuite à nouveau sur Enregistrer pour enregistrer le rapport isotope souhaité par rapport à l’oxyde. Tout d’abord, faites une deuxième injection de 450 microlitres de solution de réglage. Ensuite, dans l’onglet des paramètres, sélectionnez l’heure dans le menu déroulant et entrez zéro dans la fenêtre de démarrage, 10 dans la fenêtre de fin, un dans la fenêtre de valeur de pas et 200 dans la fenêtre de règlement.

Après avoir cliqué sur lire dans la fenêtre de masse par lecture, utilisez le curseur pour lire la valeur la plus élevée pour TM 1 69 ou TB 1 59, ainsi que la valeur GD 1 55. Injectez maintenant trois millilitres d’eau Milli Q à travers la boucle d’échantillonnage, suivis de 500 microlitres de solution de lavage DVS. Dans l’onglet étalonnage de la masse, cliquez sur exécuter pour surveiller la progression du lavage de nettoyage jusqu’à ce que l’intensité des stries commence à diminuer.

Ensuite, appliquez trois millilitres d’eau millicube et surveillez jusqu’à ce que les traînées soient descendues aux niveaux de fond. Commencez par entrer les isotopes de l’échantillon qui viennent d’être démontrés pour les isotopes de la solution de réglage, puis cliquez sur Enregistrer. Ensuite, ouvrez la fenêtre d’acquisition et modifiez les paramètres d’acquisition selon vos besoins pour le volume d’échantillon.

Par exemple, un échantillon de 450 microlitres remplira la boucle d’échantillonnage et prendra 600 secondes à fonctionner pour tenir compte des retards dans l’acquisition des données de la cellule. Réglez le délai d’acquisition sur au moins 30 secondes et le délai de stabilité du détecteur sur au moins 20 secondes avant de fonctionner. Lavez les échantillons de cellules au moins deux fois avec de l’eau millicubique, puis remettez l’échantillon en suspension à un maximum de 10 à six cellules par millilitre et filtrez la solution cellulaire résultante à travers une crépine de cellules de 35 micromètres.

Pour enlever tous les agrégats. Entrez maintenant un nouveau nom de fichier pour l’échantillon actuel. Notez que tous les fichiers doivent être enregistrés sur le lecteur E.

Ensuite, basculez la vanne de boucle d’échantillonnage pour charger, injectez l’échantillon, remettez la vanne de boucle d’échantillonnage pour injecter, puis cliquez sur exécuter. Dans la fenêtre d’acquisition. Les cellules seront représentées dans la fenêtre d’instantané sous forme de collections horizontales de marques dans chaque canal isotopique vertical et présenteront la meilleure résolution d’environ 300 à 500 cellules par seconde, comme démontré ici.

Lorsque l’acquisition des données de l’échantillon est terminée, une fenêtre contextuelle apparaît. Cliquez sur OK pour confirmer la fin de l’échantillon, puis injectez au moins 500 microlitres d’eau MQ entre chaque échantillon pour aider à minimiser tout transfert d’échantillon pour nettoyer la machine Après utilisation, injectez 450 microlitres de solution de lavage dans la boucle d’échantillonnage. Surveillez la libération de métal libre, puis rincez la boucle d’échantillonnage avec trois millilitres d’eau milli Q en surveillant le lavage jusqu’à ce que les niveaux de traînée de fond soient atteints.

Ensuite, pour arrêter la machine, sélectionnez l’onglet Contrôleur RFG de la fenêtre de configuration de l’instrument et cliquez sur arrêter le plasma. Une fois la procédure terminée, cliquez sur OK dans la fenêtre contextuelle, recommandant le retrait du nébuliseur sous l’onglet de la cage de carte. Éteignez le radiateur, fermez la vanne de l’alimentation en argonne, puis tirez doucement vers l’arrière sur le nébuliseur pour le retirer de la chambre de pulvérisation.

Ensuite, dévissez le tube d’introduction de l’échantillon et placez-le de côté. Dévissez le raccord d’introduction de gaz d’appoint jusqu’à ce qu’il se desserre légèrement, puis retirez le nébuliseur. Enfin, à l’aide de la même seringue et du même tube que ceux démontrés précédemment, nettoyez les deux orifices du nébuliseur avec 5 % de Citron et conservez le nébuliseur recouvert de 5 % de Citron jusqu’à la prochaine utilisation.

Un lavage adéquat du cytomètre de masse avec de l’eau UE et une solution de lavage DVS réduira les niveaux d’absorption de métal dans le tube et dans d’autres parties de l’appareil, ce qui contribuera à réduire tout bruit de fond, comme le montrent ces graphiques. Un mauvais accordage représenté par la ligne magenta a considérablement augmenté la formation d’oxyde à m plus 16 par rapport à l’échantillon correctement accordé, comme le démontre la ligne bleu foncé. Cela a pour effet de diminuer légèrement les signaux utiles à m et d’augmenter considérablement le brouillage de fond indésirable à m plus 16.

Un lavage et une dilution appropriés des échantillons dans de l’eau Milli Q garantiront un bruit de fond minimal et la plus grande résolution des cellules tout en équilibrant le besoin de vitesse. À l’instar des données d’une expérience représentative montrée ici dans cette expérience, des billes de polystyrène contenant de l’abondance naturelle : lanthane 1 39, ODIUM 1 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 et LUTÉTIUM 1 75 ont été analysées en mode d’acquisition de cellule. Les données ont été analysées à l’aide de FlowJo et les débris de toutes les billes cassées ont été éliminés.

Il a été déterminé que l’échantillon correctement réglé était au débit de 0,74 litre par minute, représenté par la ligne bleu foncé. Des intensités de signal plus élevées ont été observées à ce débit qu’à des débits plus faibles, et on a observé que cet échantillon correctement réglé avait un signal plus élevé aux masses métalliques M et moins de signal aux masses d’oxyde m plus 16 que les signaux mal réglés. Un gros plan du signal à M Mass LANTHANUM 1 39 et THULIUM 1 69 est montré ici.

Notez que le débit de gaz d’appoint affecte l’intensité du signal LANTHANUM 1 39 plus que l’intensité du signal thulium 1 69. Ces graphiques montrent le signal à m plus 16 masses d’oxyde 1 55 et 180 5 correspondant respectivement aux oxydes LANTHANE 1 39 plus oh 16 et thulium 1 69 plus oh 16. Notez que le débit de gaz d’appoint augmente le signal de masse 1 55 beaucoup plus que le signal de masse 180 5, car le lanthane 1 39 s’oxyde plus facilement que le thulium 1 69.

Les intensités de signal m et m plus 16 en fonction du débit de gaz d’appoint sont représentées ici. Les icônes remplies représentent la masse M.Alors que les icônes ouvertes représentent la masse M plus 16, les couleurs des lignes correspondent à la masse M respective.Notez que les intensités des signaux LANTHANUM 1 39 et prix ODIUM 1 41 sont fortement affectées par le débit de gaz d’appoint. Même en atteignant un point où il y a plus de masse m plus 16 d’oxyde que de masse M.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de démarrer correctement le CyTOF, de le régler, puis d’analyser vos échantillons, et enfin de nettoyer et d’éteindre correctement la machine à la fin de vos cycles quotidiens.