Enquêtes sur les altérations de la fonction hippocampique Circuit suite de traumatisme craniocérébral léger

L'objectif général de l'expérience suivante est d'étudier les modifications de la fonction réticulaire des régions cérébrales touchées par un modèle expérimental de traumatisme crânien léger. L'expérience débute par l'induction d'une lésion cérébrale chez une souris à l'aide d'une percussion liquidienne latérale, qui reproduit à la fois la pathologie et la symptomatologie du traumatisme crânien léger humain. Dans un second temps, un comportement dépendant de l'hippocampe, la réponse conditionnée de peur contextuelle, est utilisé pour évaluer les troubles cognitifs induits par la lésion cérébrale. Ensuite, des enregistrements extracellulaires et intracellulaires, ainsi que des colorants sensibles à la tension, sont utilisés pour déterminer les modifications spécifiques à chaque région du bilan synaptique entre la transmission synaptique excitatrice et inhibitrice. Dans la région d'intérêt, l'hippocampe, les résultats révèlent des changements spécifiques aux sous-régions de l'efficacité synaptique nette dans l'hippocampe, fondés sur les différences observées entre les souris témoins et les souris ayant subi une lésion cérébrale, et ce selon les trois techniques d'enregistrement décrites.

L'avantage principal de cette approche réside dans la capacité à distinguer les effets de l'état pathologique et des traitements potentiels sur plusieurs échelles physiologiques, permettant ainsi une vision plus cohérente des déficits de ce circuit. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés concernant le traumatisme crânien, notamment quels neurones sont spécifiquement les plus sensibles aux lésions, et par conséquent, ceux qui contribuent le plus au dysfonctionnement hippocampique après une blessure. Les implications de notre approche s'étendent vers le traitement du traumatisme crânien, car elle nous permet tout d'abord de définir les mécanismes sous-jacents, puis de développer des thérapies potentielles visant à rétablir une physiologie normale dans les régions endommagées par la lésion cérébrale.

Dans cette procédure, anesthésiez la souris à l’aide d’un mélange de kétamine et de xylazine administré par voie intrapéritonéale. Ensuite, effectuez une craniectomie C au niveau de la région pariétale droite à l’aide d’un foret de trois millimètres de diamètre externe. Puis fixez le manchon de l’aiguille à crochet sur la craniectomie C à l’aide de cyanoacrylate et d’acrylique dentaire.

24 heures plus tard, anesthésier la souris à l’aide d’isoflurane par inhalation. Une fois la respiration normale revenue, mais avant que la souris ne devienne sensible à la stimulation, appliquer une impulsion de 20 millisecondes de solution saline sur le crâne à l’aide du dispositif de lésion par percussion liquidienne. Retirer immédiatement le raccord après la lésion. Ensuite, réanesthésier la souris à l’aide d’isoflurane et suturer le cuir chevelu.

Manipulez la souris pendant deux jours consécutifs avant l'entraînement à la réponse conditionnée à la peur. Le jour de l'entraînement, placez la souris dans la chambre de conditionnement pendant trois minutes avant d'appliquer une secousse électrique de plancher de 1,5 minute à 2 secondes. Laissez ensuite la souris dans la chambre pendant 30 secondes supplémentaires avant de la retirer.

Après une période de latence de 24 heures, ramenez la souris dans la chambre de conditionnement pendant cinq minutes, puis évaluez l'immobilité par intervalles de cinq secondes, sept jours après la lésion. Préparez un litre de liquide céphalorachidien artificiel et 250 millilitres de solution de coupe au saccharose. Veillez à ce que tous les instruments et solutions utilisés lors de la préparation des tranches de cerveau soient glacés avec de la glace.

Anesthésiez la souris à l’aide d’isoflurane rapidement et délicatement. Retirez le cerveau de la souris et placez-le dans du saccharose. Ensuite, taillez le cerveau.

Placez la surface fraîchement coupée du cerveau sur une goutte de colle cyanoacrylate sur le plateau du vibromasseur, devant un bloc d'agar. Découpez des tranches coronales de 350 micromètres d'épaisseur. Vous devriez pouvoir obtenir quatre ou cinq tranches comportant le circuit hippocampique intact.

Après cela, incubez les tranches pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius. Préparez maintenant des électrodes en verre borosilicaté de deux à cinq mégohms. À l’aide du tireur vertical, transférez une tranche dans la chambre, puis placez une électrode sur le porte-électrode pour l’enregistrement du potentiel de champ extracellulaire.

Positionnez l'électrode de stimulation au-dessus du tractus axonal sur la tranche, comme le trajet perforant ou les collatéraux de Shafer. Ensuite, continuez à abaisser l'électrode d'enregistrement dans la tranche. Puis, appliquez une impulsion électrique unique pour évoquer le potentiel postsynaptique extracellulaire de champ.

Poursuivez la stimulation en faisant varier la profondeur de l'électrode d'enregistrement entre les stimuli, une fois la réponse maximale atteinte. Cela indique que les électrodes se trouvent au même niveau. L'analyse au niveau Z consiste généralement en des mesures permettant de comparer l'amplitude du sillon d'ondes dans les fibres chez les souris ayant subi une lésion cérébrale et chez les souris témoins opérées à blanc, afin d'évaluer l'activation pré-synaptique, ainsi que de comparer la pente du P-P-E-P-S pour évaluer l'activation post-synaptique. Pour l'enregistrement en mode « patch clamp », transférez de nouveau une tranche dans la chambre et abaissez l'électrode d'enregistrement.

Approchez une cellule en appliquant une pression positive sur l'électrode afin de garantir que l'électrode d'enregistrement ne s'obstrue pas pendant sa progression à travers le tissu. Lorsque l'électrode touche délicatement la cellule, appliquez une pression négative afin de former un scellement gigaohm entre l'électrode et la membrane plasmique. Ensuite, appliquez de brèves impulsions de pression négative pour rompre la membrane plasmique et obtenir une configuration en mode cellule entière.

Éliminer le transitoire de capacité à l’aide de l’amplificateur et compenser la résistance en série afin d’assurer des mesures précises. Ensuite, quantifier et comparer la fréquence et l’amplitude des courants synaptiques spontanés chez les souris présentant une lésion cérébrale et les témoins soumises à une opération factice. À cette étape, préparer le stock de colorant en mélangeant un milligramme de colorant trois onap DHQ dans 50 microlitres d’éthanol.

Dispenser des aliquots de deux microlitres dans des tubes enveloppés de papier d’aluminium et conserver à moins 20 degrés Celsius. Préparer quotidiennement la solution de colorant travail en diluant à 1/200 dans un liquide céphalorachidien A. Incuber ensuite une section sur un papier filtre humidifié avec le liquide céphalorachidien A et colorer avec 90 microlitres de colorant pendant 16 minutes.

Ensuite, rincez-le et placez-le dans la chambre d’enregistrement à l’interface. Placez les électrodes de stimulation et d’enregistrement comme décrit dans l’enregistrement extracellulaire des champs de potentiel.

Réglez l'intensité de la stimulation lumineuse jusqu'à ce que la réponse soit centrée au milieu de la caméra. Les images de profondeur sont généralement acquises à une fréquence de 500 à 1000 images par seconde. Déclenchez l'obturateur pour la stimulation lumineuse 200 millisecondes avant la stimulation électrique afin de permettre la stabilisation du blanchiment photochimique initial rapide.

Faire une pause de 10 secondes entre chaque essai. Alterner les essais d'acquisition entre la stimulation électrique et la stimulation non électrique afin de permettre par la suite la soustraction du fond correspondant à la stimulation non électrique. Ensuite, enregistrer l'intensité lumineuse au repos avant d'ouvrir l'obturateur.

Chaque essai VSD peut être analysé comme un film d'acquisitions de fluorescence. Autrement dit, chaque essai correspond à une matrice tridimensionnelle de données comportant des valeurs selon les dimensions spatiales X et Y au cours du temps. Enregistrez de 10 à 12 essais VSD pour chaque condition expérimentale et calculez la variation de fluorescence normalisée par pixel avant l'illumination, conformément au manuscrit accompagnant.

Cette figure montre un exemple d'enregistrement F-E-P-S-P dans la région CA1. La première déflexion vers le bas correspond à l'artéfact du stimulus, suivi par le volée de fibres présynaptiques, puis par le F-E-P-S-P. Voici les courbes entrée-sortie illustrant une diminution de l'efficacité synaptique nette dans la région CA1 après une lésion par percussion liquidienne.

Et voici les courbes entrée-sortie illustrant une augmentation de l'efficacité synaptique nette dans le gyrus denté suite à une lésion pariétale focale (FPI). Voici un exemple de courant post-synaptique excitateur spontané enregistré dans une cellule paramédiale du CA1. Voici un exemple de train de potentiels d'action provenant d'une cellule paramédiale du CA1 et d'un interneurone rapide du CA1.

Il s'agit d'un interneurone inhibiteur de la région CA1 rempli de jaune de Lucifer, sans épines dendritiques, et voici un neurone paramédian de la région CA1 rempli de jaune de Lucifer, avec des épines dendritiques. Ces images montrent une coupe hippocampique coronale de souris. Les pixels allant du jaune au rouge représentent l'activité excitatrice dans la région CA1, 14 millisecondes après la stimulation collatérale afférente de Schaeffer.

Le rouge indique une dépolarisation plus importante, tandis que le jaune indique une dépolarisation moindre mais néanmoins significative. Les pixels bleus représentent les sites d'activité inhibitrice dans la région CA1, 56 millisecondes après la même stimulation collatérale afférente de Schaffer, tandis que le bleu foncé indique une hyperpolarisation plus marquée. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de combiner plusieurs techniques d'enregistrement ex vivo afin d'étudier une condition pathologique cliniquement pertinente impliquant un dysfonctionnement de circuit.