Name: Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec laide siARN réseaux de microélectrodes (MEA) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Découvrez la transfection spécifique au site dans les cellules adhérentes utilisant un réseau de microélectrodes. Cette méthode d'électroporation permet une livraison précise de siRNA avec un contrôle spatial élevé pour la biologie cellulaire.

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1. Préparation MEA <ol><li> AME pour une utilisation dans des expériences d&#39;électroporation peuvent être fabriqués en utilisant la technique de photolithographie standard comme décrit précédemment 18 ou acheté directement auprès des fournisseurs des fabricants AME tels que les systèmes multi-canaux <a href="http://www.multichannelsystems.com" target="_blank">(http:/www.multichannelsystems.com/)</a> et Alpha MED scientifique, Inc <a href="http://www.med64.com/" target="_blank">( http://www.MED64.com)</a> . Les AME utilisées dans nos expériences ont été fabriqués en interne à l&#39;installation de salle blanche dans l&#39;Arizona State University, qui est administré par le Center for Solid State Electronics Research (CSSER). Les AME utilisées dans nos expériences a eu 32 électrodes d&#39;indium oxyde d&#39;étain dans une matrice 8 par 4 avec des diamètres de 50 à 200 um d&#39;électrodes dans un verre de 1 cm de diamètre intérieur bien. Le verre et a été collé sur le polydiméthylsiloxane MEA en utilisant (PDMS). </li><li> Stériliser la MEA dans un autoclave avant cellule seeding. D&#39;autres méthodes de stérilisation comme un trempage dans de l&#39;éthanol à 70%, le traitement UV et traitement de l&#39;eau chaude comme décrit par ailleurs peut aussi être utilisé aussi longtemps qu&#39;elles ne compromettent pas l&#39;intégrité de la MEA. </li><li> Transférer la MEA autoclave à une hotte à flux laminaire et le placer dans un plat de Pétri en polystyrène norme stérile. Avant l&#39;ensemencement des cellules sur la MEA, la stérilisation de la hotte à flux laminaire par la mise sous lumière UV pendant 20 min. Si la MEA est sensible à la lumière UV couvrir la boîte de Petri contenant du MEA avec une feuille d&#39;aluminium tandis que la hotte stérile écoulement est sous éclairage UV. </li></ol> 2. Les cellules d&#39;ensemencement sur la MEA <ol><li> Récolte des cellules d&#39;une lignée cellulaire fonctionnement des cellules de mammifères adhérentes à l&#39;aide de trypsine / EDTA et de les élever à une concentration de 100-200 cellules / ul dans 1 ml milieux cellulaires pour le placage. Dans nos expériences, nous avons réussi à cultiver NIH 3T3 lignée de cellules fibroblastes, lignée cellulaire HeLa et primaires neurones corticaux et hippocampiques sur l&#39;AEM. </li><li&gt; Déposer une goutte 20-30 ul de médias avec des cellules de l&#39;AEM. Transférer la boîte de Pétri avec l&#39;AEM à l&#39;incubateur. Il est important de veiller à ce que la taille des gouttes de cellule est suffisamment grand pour recouvrir toutes les électrodes sur la MEA. </li><li> 2 h après l&#39;ensemencement des cellules de transfert de la boîte de Pétri avec la MEA de l&#39;incubateur pour hotte à flux laminaire et ajouter doucement pi 400-500 de pré supports chauffés (37 ° C) à la MEA bien. Vérifiez sous le microscope pour s&#39;assurer que les cellules sont encore attachés et uniformément répartie sur la surface de la MEA. Transfert à l&#39;arrière MEA à l&#39;incubateur. La période de 2 heures d&#39;attente avant l&#39;addition du support garantit suffisamment de temps aux cellules d&#39;adhérer à la surface de la MEA. Ajout de milieux cellulaires trop tôt après l&#39;ensemencement des cellules peut laver les cellules. Si les cellules n&#39;adhèrent pas bien à la MEA, sa surface peut être traitée avec des facteurs de fixation cellulaire tel aspolylysine, la fibronectine, la laminine et d&#39;améliorer l&#39;adhérence cellulaire. Dans nos expériences, nous avons généralement de cellules HeLa traiter la surface avec MEA fibronectin (10 pg / ml) pendant 1-2 heures. </li><li> 8-12 heures après l&#39;ensemencement des cellules, effectuez 1-2 lavages avec du PBS pour éliminer les cellules mortes. Milieu cellulaire peuvent être remplacées tous les 24 à 48 heures selon les besoins. Dans une expérience typique, les cellules sont généralement prêt pour la transfection 24-48 heures après l&#39;ensemencement. Pour assurer la cohérence de l&#39;efficacité d&#39;électroporation, il est recommandé d&#39;attendre que la culture est au moins 80% de confluence avant électroporation. </li></ol> 3. Spécifique au site transfection de siRNA <ol><li> Préparer une solution d&#39;acide nucléique. Pour transfection de siRNA, préparer une solution uM 1-2 siARN électroporation dans le tampon d&#39;électroporation glacée pour atteindre un volume final de 200-400 ul. Dans cet article, nous démontrons la vidéo transfection de cellules HeLa avec Alexa 488 conjugué brouillés séquence de siRNA. </li><li> Transférer la MEA avec des cellules de l&#39;incubateur à flux laminaire hotte stérile. Retirez le support de cellules de l&#39;AEM et d&#39;effectuer un lavage avec du PBS. Par la suite, ajouter 200-400 ul de la iCE froide solution à 1 uM électroporation siRNA pour le bien. </li><li> Appliquer anodiques carrés des impulsions électriques aux électrodes ciblées (Reportez-vous à l&#39;étape 4 pour déterminer les paramètres optimaux de l&#39;impulsion électrique). Dans nos expériences, nous avons utilisé un des instruments pragmatiques 2414A générateur de signaux pour générer des impulsions électriques et d&#39;un double-inline-paquet (DIP) 16 circlip d&#39;axe de prendre contact avec les plots de connexion MEA. Le générateur de forme d&#39;onde peut être relié à l&#39;élément DIP via une carte de circuit imprimé démultiplexeur pour fournir une sélectivité d&#39;électrodes individuelles. Pour l&#39;électrode de référence, placer une cathode en acier dans les milieux cellulaires. Tout en réduisant l&#39;électrode de référence en acier dans les médias, il est extrêmement important de veiller à ce qu&#39;il n&#39;entre pas en contact avec la surface de la MEA. En cas de contact, il peut causer des dommages aux cellules et l&#39;AME. Il est recommandé d&#39;abaisser l&#39;électrode de référence à une position de 1 mm au-dessus des cellules. Une entretoise avec une hauteur de 1 mm peut être placé dans le puits pour faciliter le placement de l&#39;arbitrerence électrode. Une approche alternative à l&#39;utilisation d&#39;une électrode de référence externe est d&#39;utiliser des électrodes voisines comme cathode-anode paires. </li><li> Immédiatement après l&#39;application des impulsions électriques aux électrodes ciblées sur l&#39;AEM, AEM transférer l&#39;arrière de l&#39;incubateur. Après une période d&#39;incubation de 5 min, doucement remplacer 75% de la mémoire tampon d&#39;électroporation avec préchauffées (37 ° C) milieu cellulaire. Plus tard, l&#39;imagerie fluorescente peut être fait pour confirmer la livraison de siRNA marquées par fluorescence dans les cellules. </li></ol> 4. Optimisation des paramètres d&#39;électroporation <ol><li> Pour déterminer les paramètres optimaux d&#39;impulsions électriques pour l&#39;électroporation, expériences d&#39;électroporation de conception pour une plage de valeurs de l&#39;amplitude d&#39;impulsion, durée d&#39;impulsion, et le nombre d&#39;impulsions. Dans notre expérience avec des cellules HeLa, nous avons observé qu&#39;une seule impulsion de tension d&#39;amplitude de 3 V à 9 V, et la durée de 1 ms à 10 ms pour une taille d&#39;électrode de 100 um ont conduit à une électroporation avec succès kmnimal mort cellulaire. Il est de notre recommandation selon laquelle un paramètre de faire varier à la fois et d&#39;autres sont maintenus constants. Pour quantifier l&#39;efficacité d&#39;électroporation pour chacun des paramètres d&#39;impulsion, nous utilisons l&#39;iodure de propidium (PI), un colorant imperméant cellule que le matériel nucléique taches, et la méthodologie de test en direct basée, comme décrit dans les étapes 4.2 à 4.5. </li><li> Mettre en place une culture de cellules de la MEA en suivant les instructions indiquées dans les étapes 1 et 2. </li><li> Avant de préparer une électroporation ul 300-500 de 30 pg / ml solution PI dans le tampon d&#39;électroporation glacée et 400 ul de 4 uM calcien AM solution dans du PBS. </li><li> Transférer la MEA de l&#39;incubateur de la hotte à flux laminaire. Retirez le support de cellules de l&#39;AEM et d&#39;effectuer un lavage avec du PBS. Par la suite, ajouter 300-500 ul du tampon d&#39;électroporation glacée avec PI. </li><li> Appliquer des impulsions électriques d&#39;amplitude d&#39;impulsion désirée et la durée des électrodes ciblées (Le matériel utilisé dans nos expériences pour générer et d&#39;appliquer l&#39;électrique impulsion à l&#39;AEM est décrite à l&#39;étape 3.3). Pour l&#39;électrode de référence soit abaisser une électrode d&#39;acier dans le tampon d&#39;électroporation dans la MEA bien ou d&#39;utiliser l&#39;électrode voisine comme référence. En appliquant sélectivement des impulsions d&#39;amplitudes variables ou des durées différentes à électrodes multiples expériences peuvent être réalisées sur le même dispositif. Par exemple, sur une électrode 32 MEA, 8 expériences peuvent être réalisées en séparant les électrodes 32 en 8 groupes, chacun composé de 4 électrodes. Chacun des 8 groupes peuvent ensuite être stimulé par une impulsion de tension rectangulaire unique d&#39;une durée de 5 ms avec des amplitudes différentes dans 3 V-6 V Plage par incréments de 0,5 V et un groupe peut être utilisé comme un contrôle. </li><li> Immédiatement après l&#39;application des impulsions de tension transférer la MEA à l&#39;incubateur pendant 5 min. Ensuite, retirer délicatement de 75% de la mémoire tampon d&#39;électroporation de la MEA bien et le remplacer par les médias de cellules chaudes. Transfert à l&#39;arrière MEA à l&#39;incubateur. </li><li> Après une période d&#39;incubation de 2-4 heuresremplacer les supports de cellules dans le MEA bien avec 300-500 ul de 4 uM calcéine AM solution dans du PBS. Transfert à l&#39;arrière de l&#39;incubateur MEA pendant encore 30 minutes. </li><li> Après l&#39;incubation des cellules avec la calcéine AM, la calcéine AM remplacer solution dans le puits avec du PBS MEA après deux lavages avec du PBS. Obtenir des images fluorescentes de cellules à l&#39;aide d&#39;un microscope optique avec des filtres pour PI (excitation / émission - 535 nm/617 nm) et calcéine AM (excitation / émission - 490 nm/520 nm). L&#39;absorption de PI, en raison de l&#39;électroporation, la destruction des cellules à fluorescence rouge et la calcéine AM provoque des cellules qui sont vivants à fluorescence verte. Trois scénarios possibles qui peuvent être observés sont: 1) des cellules vivantes (électroporation et une fluorescence rouge et vert), 2) des cellules vivantes, mais pas électroporation (une fluorescence verte juste) et 3) les cellules mortes en raison de l&#39;électroporation (une fluorescence rouge seulement) . La viabilité cellulaire a été calculé en pour cent du nombre total de cellules vivantes sur l&#39;électrode et l&#39;eff électroporationicacité a été calculé comme pour cent du nombre total de cellules chargées de PI / siRNA. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs La figure 1 montre la charge spécifique au site de cellules HeLa avec PI. On peut constater que seules les cellules sur l&#39;électrode démontrent une absorption de PI (figure 1B). Un test direct effectué après électroporation a été utilisé pour évaluer la viabilité des cellules (figure 1A). L&#39;efficacité d&#39;électroporation et la viabilité des cellules pour l&#39;exemple représenté à la figure 1 sont 81,8% et 96,1% respectivement. La viabilité des cellules à haute efficacité et d&#39;électroporation peut être obtenue en optimisant les paramètres d&#39;impulsion d&#39;électroporation. Spécifique au site transfection de cellules HeLa avec le siRNA marquées par fluorescence pour une impulsion d&#39;électroporation optimisé (8 V, 1 msec) est montré dans la figure 2. L&#39;efficacité d&#39;électroporation pour le siRNA à 8 ms V, 1 a été jugée 74,4 ± 16,0% etla viabilité des cellules a été jugée 87,9 ± 8,4% (toutes les données représentées sous forme de moyenne ± écart type, n = 5). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig1.jpg" /> Figure 1. Site-spécifique de livraison de PI dans les cellules HeLa sur une électrode de 200 um (6 V, 5 ms). A) Calcien dosage basé direct effectué 2 heures après l&#39;électroporation. Cellules vivantes sont indiqués par une fluorescence verte. B) Rouge fluorescence montre l&#39;absorption par les cellules de la PI sur l&#39;électrode. C) Une image superposée de A et B. Les flèches blanches indiquent les cellules qui électroporation et vivant. Les flèches noires indiquent les cellules qui sont morts. Le cercle blanc en A, B et C indique le contour de l&#39;électrode. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4415/4415fig2.jpg" /> Figure 2. La transfection de cellules HeLa avec scrambl marquées par fluorescencee séquence de siRNA. A) l&#39;image des cellules HeLa sur une électrode de 100 um transfectées avec Alexa 488 siARN étiquetés (8 V, 1 ms). B) l&#39;image de noyaux de cellules colorées avec du DAPI. Le cercle blanc marque le bord de l&#39;électrode.

<ol><li>Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391, 806-811 (1998).</li>
<li>Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Fire, A., Morgan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+gene+expression+by+small+double-stranded+RNAs+in+invertebrate+and+vertebrate+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and vertebrate systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 9742(2001).</li>
<li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550(2002).</li>
<li>Lee, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+small+interfering+RNAs+targeted+against+HIV-1+rev+transcripts+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 500-505 (2002).</li>
<li>Miyagishi, M., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U6+promoter-driven+siRNAs+with+four+uridine+3%27+overhangs+efficiently+suppress+targeted+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).</li>
<li>Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+expression+of+small+interfering+RNA+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective expression of small interfering RNA in human cells.</a> Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).</li>
<li>Xia, H., Mao, Q., Paulson, H. L., Davidson, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((siRNA-mediated+gene+silencing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">siRNA-mediated gene silencing in vitro and in vivo.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1006-1010 (2002).</li>
<li>Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+for+the+efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA.</a> Nucleic Acids Res. 15, 1311(1987).</li>
<li>Felgner, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofection%3A+a+highly+efficient%2C+lipid-mediated+DNA-transfection+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84, 7413(1987).</li>
<li>Raptis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((applications+of+electroporation+of+adherent+cells+in+situ%2C+on+a+partly+conductive+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">applications of electroporation of adherent cells in situ, on a partly conductive slide.</a> Mol. Biotechnol. 4, 129-138 (1995).</li>
<li>Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+mammalian+cells%3A+optimization+of+critical+parameters+affecting+calcium-phosphate+precipitate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation.</a> Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996).</li>
<li>Gao, Y., Liu, X. L., Li, X. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+progress+on+siRNA+delivery+with+nonviral+carriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Research progress on siRNA delivery with nonviral carriers.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1017(2011).</li>
<li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411, 107-110 (2001).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+and+temporally+controlled+gene+transfer+by+electroporation+into+adherent+cells+on+plasmid+DNA-loaded+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Spatially and temporally controlled gene transfer by electroporation into adherent cells on plasmid DNA-loaded electrodes.</a> Nucleic Acids Res. 32, e187(2004).</li>
<li>Yamauchi, F., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-by-Layer+Assembly+of+Poly+%28ethyleneimine%29+and+Plasmid+DNA+onto+Transparent+Indium%3F+Tin+Oxide+Electrodes+for+Temporally+and+Spatially+Specific+Gene+Transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Layer-by-Layer Assembly of Poly (ethyleneimine) and Plasmid DNA onto Transparent Indium? Tin Oxide Electrodes for Temporally and Spatially Specific Gene Transfer.</a> Langmuir. 21, 8360-8367 (2005).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsystem+for+transfection+of+exogenous+molecules+with+spatio-temporal+control+into+adherent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Microsystem for transfection of exogenous molecules with spatio-temporal control into adherent cells.</a> Biosensors and Bioelectronics. 22, 863-870 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-chip+for+spatially+controlled+transfection+of+nucleic+acid+payloads+into+cells+in+a+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Bio-chip for spatially controlled transfection of nucleic acid payloads into cells in a culture.</a> Lab on a Chip. 7, 1004-1011 (2007).</li>
<li>Jain, T., Muthuswamy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microelectrode+array+%28MEA%29+platform+for+targeted+neuronal+transfection+and+recording%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Engineering%2C+IEEE+Transactions+on%22%5BJournal%5D)">Microelectrode array (MEA) platform for targeted neuronal transfection and recording.</a> Biomedical Engineering, IEEE Transactions on. 55, 827-832 (2008).</li>
<li>Jain, T., McBride, R., Head, S., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+parallel+introduction+of+nucleic+acids+into+mammalian+cells+grown+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Highly parallel introduction of nucleic acids into mammalian cells grown in microwell arrays.</a> Lab on a Chip. 9, 3557-3566 (2009).</li>
<li>Huang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+high-throughput+electroporation+microchip+applicable+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An efficient and high-throughput electroporation microchip applicable for siRNA delivery.</a> Lab Chip. 11, 163-172 (2010).</li>
<li>Efficient and high-throughput electroporation chips. Li, Z., Wei, Z., Li, X., Du, Q., Liang, Z. Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems Conference (TRANSDUCERS), 2011 16th International, , IEEE. (2011).</li>
<li>Jain, T., Papas, A., Jadhav, A., McBride, R., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electroporation+of+surface-bound+siRNAs+in+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">In situ electroporation of surface-bound siRNAs in microwell arrays.</a> Lab Chip. 12, 939-947 (2012).</li>
<li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Electroporationfor+Gene+Transfer+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Electroporationfor Gene Transfer In Vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li>
<li>Akaneya, Y., Jiang, B., Tsumoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi-induced+gene+silencing+by+local+electroporation+in+targeting+brain+region%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">RNAi-induced gene silencing by local electroporation in targeting brain region.</a> J. Neurophysiol. 93, 594(2005).</li>
<li>Lee, W. G., Demirci, U., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+electroporation%3A+challenges+and+perspectives+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Microscale electroporation: challenges and perspectives for clinical applications.</a> Integr. Biol. 1, 242-251 (2009).</li>
<li>Boukany, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nature Nanotechnology. 6, 747-754 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cet article, nous démontrons vidéo de l&#39;utilisation de la MEA pour le site spécifique à la transfection de cellules HeLa avec brouillés séquence de siRNA. Un des avantages de cette technologie est son applicabilité à différentes lignées cellulaires, y compris des lignées de cellules primaires. Notre laboratoire a précédemment démontré que l&#39;utilisation de cette technologie pour le site spécifique à la transfection de culture neuronale hippocampique primaire de rat E18 vieux jour et cellules NIH-3T3 avec bro...

<table border="1"><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Milieux cellulaires: MEM avancée L-glutamine 200 mM Pénicilline / Streptomycine Sérum de veau fœtal </td><td> Gibco / Invitrogen HiMedia Laboratories / VWR Lonza Group Ltd Gibco / Invitrogen </td><td> 12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 </td><td> Cellule composition des milieux: 2% de FBS, Pennstrep 2% de L-glutamine et 2% à l&#39;avance MEM </td></tr><tr><td> Trypsine EDTA </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 25 à 053-CL </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Mediatech, Inc </td><td> 21-040 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Alexa 488 et la rhodamine étiqueté brouillés Sequrence siRNA </td><td> Qiagen, Inc </td><td> 1027292 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon d&#39;électroporation </td><td> Biorad Laboratories </td><td> 165-2677 </td><td></td></tr><tr><td> Générateur de signaux </td><td> Pragmatique </td><td> 2414A </td><td> Toute forme d&#39;onde / générateur d&#39;impulsions pouvant fournir des impulsions souhaitées peuvent être utilisées. </td></tr></table>

rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l&#39;aide siarn réseaux de microélectrodes (mea)

High efficiency, Site-specific Transfection of Adherent Cells with siRNA Using Microelectrode Arrays (MEA)

La découverte de la voie de RNAi chez les eucaryotes et le développement ultérieur des agents ARNi, comme siRNA et shRNA, ont atteint une méthode puissante pour faire taire des gènes spécifiques 1-8 pour la génomique fonctionnelle et la thérapeutique. Un défi majeur impliqué dans les études basées sur l&#39;ARNi est la délivrance d&#39;agents ARNi dans les cellules ciblées. Les techniques traditionnelles de livraison non viraux, tels que l&#39;électroporation en vrac et les méthodes de transfection chimiques n&#39;ont souvent pas le contrôle nécessaire spatiale sur la livraison et payer des efficacités de transfection pauvres 9-12. Les progrès récents dans les méthodes de transfection chimiques tels que les lipides cationiques, les polymères cationiques et les nanoparticules ont donné lieu à des efficacités de transfection hautement améliorées 13. Toutefois, ces techniques continuent à ne pas offrir un contrôle précis de l&#39;espace au-dessus de livraison qui peut grandement bénéficier miniaturisé technologies à haut débit, des études unicellulaires et les enquêtes sur les interactions cellule-cellule. nt &quot;&gt; Les récents progrès technologiques dans la prestation des gènes ont permis de transfection à haut débit de cellules adhérentes 14-23, dont une majorité d&#39;utiliser l&#39;électroporation microscopique. électroporation Microscale offre spatio-temporelle précise le contrôle de la livraison (jusqu&#39;à des cellules individuelles) et a été montré d&#39;atteindre des rendements élevés 19, 24-26. De plus, les approches basées sur l&#39;électroporation ne nécessitent pas une longue période d&#39;incubation (environ 4 heures) avec des complexes ADN et de siRNA comme nécessaire dans les méthodes de transfection à base de produits chimiques et de conduire à l&#39;entrée directe de l&#39;ADN nu et siRNA molécules dans le cytoplasme de la cellule. Comme expression d&#39;un gène conséquence peut être atteint dès six heures après la transfection 27. Notre laboratoire a précédemment démontré que l&#39;utilisation de réseaux de microélectrodes (MEA) pour le site spécifique de transfection dans des cultures de cellules mammaliennes adhérentes 17-19. Dans la MEA approche basée sur la livraison de la charge utile génétique est réalisée via localisée à micro-échelle electroporatisur des cellules. Une application de l&#39;impulsion électrique à des électrodes sélectionnées génère locale du champ électrique qui mène à l&#39;électroporation de cellules présentes dans la zone des électrodes stimulées. Le contrôle indépendant des électrodes de commande fournit des micro-spatiale et temporelle au cours de la transfection et permet également de multiples expériences de transfection à base à effectuer sur la même culture qui augmente le débit et la réduction de culture expérimentale à la variabilité culture. Ici, nous décrivons le dispositif expérimental et le protocole de transfection ciblée des cellules HeLa adhérentes avec une fluorescence marquée brouillés siRNA de séquence en utilisant l&#39;électroporation. Le même protocole peut également être utilisée pour la transfection des vecteurs plasmidiques. En outre, le protocole décrit ici peut être facilement étendu à une variété de lignées cellulaires de mammifères avec des modifications mineures. La disponibilité commerciale de ces accords avec des configurations d&#39;électrodes à la fois prédéfinis et personnalisés font de ce t technique accessiblelaboratoires de recherche avec la plupart des o équipement de culture cellulaire de base.

Les détails article pour le protocole spécifique de site de transfection de siRNA séquence brouillée dans une culture de cellules de mammifères adhérentes à l&#39;aide d&#39;une matrice de micro-électrodes (MEA).

Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l&#39;aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)

La découverte de la voie de l'ARNi chez les eucaryotes et le développement ultérieur d'agents ARNi, tels que les siARN et les shARN, ont permis d'établir une méthode puissante pour...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir une transfection spécifique à un site donné dans des cellules adhérentes. Cette approche est réalisée en cultivant une monocouche de cellules sur un réseau de microélectrodes. Dans une deuxième étape, l'application d'une impulsion électrique à des électrodes sélectionnées provoque l'électroporation des cellules ciblées adhérentes au-dessus des électrodes.Cela conduit à la formation de pores dans la membrane cellulaire qui permettent l'entrée de molécules exogènes dans la cellule. Les cellules ciblées peuvent ensuite être analysées pour détecter le phénotype résultant à l'aide d'un test approprié. La technique de transfection microéchelle que nous décrivons ici présente plusieurs avantages clés par rapport aux techniques conventionnelles de transfection, telles que l'électroporation en masse ou la transfection chimique.A, cela nous permet d'obtenir un contrôle spatial exquis sur le processus de transfection lui-même et nous aide à transfecter des cellules individuelles ou des groupes de cellules avec une efficacité élevée, même dans des lignées cellulaires difficiles à transfecter. B, il s'agit d'une approche facilement reproductible qui nous permet de réaliser des tests moléculaires à haut débit. L'un des principaux avantages de l'utilisation d'une zone d'électrode microscopique pour la transfection site-spécifique est qu'elle permet l'évaluation fonctionnelle simultanée des cellules ciblées, comme l'électrophysiologie quantitative et les changements morphologiques.Pour commencer la procédure, stérilisez la MEA dans un autoclave, puis transférez la MEA autoclavée dans une hotte à flux laminaire et placez-la dans une boîte de Petri stérile en polystyrène standard avant de semer les cellules sur la MEA. Stérilisez la hotte à flux laminaire en activant la lumière UV pendant 20 minutes. Si la MEA est sensible à la lumière UV, recouvrez la boîte de Petri contenant la MEA avec du papier d'aluminium stérile pendant que la hotte est exposée à l'illumination UV. Ensuite, traitez la surface de la MEA avec 10 microgrammes par millilitre de fibronectine pendant une à deux heures pour les cellules helo.Effectuez un lavage avec de l’eau DI et laissez sécher à l’air le MEA dans la hotte à flux laminaire. Ensuite, récoltez les cellules à partir d’une culture cellulaire en cours de lignée cellulaire adhérente de mammifères à l’aide de trypsine ETTA et ajustez-les à une concentration de 100 à 200 cellules par microlitre dans un millilitre de milieu cellulaire pour la mise en culture. Puis déposez une goutte de 20 à 30 microlitres de milieu contenant les cellules sur le MEA.Veillez à ce qu'elle soit suffisamment grande pour couvrir toutes les électrodes sur la MEA. Transférez ensuite la boîte de Pétri contenant la MEA dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Deux à quatre heures.Après avoir semé les cellules, transférez la boîte de Pétri contenant la MEA de l’incubateur vers le flux laminaire. Ensuite, ajoutez délicatement 400 à 500 microlitres de milieu préchauffé à 37 degrés Celsius dans le puits de la MEA, puis vérifiez au microscope que les cellules sont toujours fixées et uniformément réparties sur la surface de la MEA. Puis, remettez la MEA dans l’incubateur. Huit à douze heures après le semis des cellules, effectuez un à deux lavages avec du PBS afin d’éliminer les cellules mortes.Dans une expérience typique, les cellules sont généralement prêtes pour la transfection 24 à 48 heures après leur mise en culture. Pour maintenir une cohérence dans les rendements d'électroporation, il est recommandé d'attendre que la culture soit proche de la confluence avant d'effectuer l'électroporation. Afin d'obtenir une transfection efficace par sarna, il est nécessaire de déterminer au préalable les paramètres optimaux de tension et d'impulsion d'électroporation pour une MEA donnée.Ici, nous décrivons une série d'étapes expérimentales impliquant l'utilisation d'iodure de propidium pour déterminer les paramètres optimaux d'électroporation avant l'électroporation elle-même. Préparez une solution de 300 à 500 microlitres contenant 30 microgrammes par millilitre d'IP dans un tampon d'électroporation glacé, ainsi que 400 microlitres d'une solution de calcium AM à quatre micromolaire dans du PBS. Transférez ensuite le MEA de l'incubateur vers la hotte à flux laminaire.Retirez le milieu cellulaire de la MEA et effectuez un lavage au PBS. Ensuite, ajoutez 300 à 500 microlitres de tampon d'électroporation glacé avec pi. Puis, placez un espaceur d'un millimètre de hauteur dans la MEA.Eh bien, il est extrêmement important de s'assurer qu'il ne touche pas les cellules situées au centre de la MEA. Ensuite, connectez la MEA à l'interconnexion électrique et sélectionnez les électrodes souhaitées pour l'électroporation. Appliquez ensuite les impulsions électriques avec l'amplitude et la durée souhaitées aux électrodes ciblées pour l'étape d'électroporation.Abaissez la cathode en acier recouverte de feuille d'aluminium dans le puits MEA jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec l'espacement d'un millimètre. Immédiatement après, appliquez des impulsions électriques aux électrodes ciblées. Ensuite, répétez l'étape avec un autre ensemble d'électrodes selon le plan expérimental.Dans nos expériences avec des cellules helo, nous avons observé qu'une impulsion de tension unique, d'une amplitude comprise entre trois volts et neuf volts et d'une durée comprise entre une milliseconde et 10 millisecondes, pour une électrode d'une taille de 100 micromètres, conduisait à une électroporation réussie avec un nombre minimal de morts cellulaires. Immédiatement après l'application des impulsions de tension, transférez la MEA dans l'incubateur pendant cinq minutes.Après une période d'incubation de cinq à dix minutes, retirez délicatement l'espacement de la MEA. Ensuite, retirez 75 % du tampon d'électroporation du puits de la MEA et remplacez-le par du milieu cellulaire tiède. Puis, remettez la MEA dans l'incubateur.Après une période d'incubation de deux à quatre heures, remplacez le milieu cellulaire dans le puits de la MEA par 300 à 500 microlitres d'une solution de calcium AM à quatre micromolaire dans du PBS. Replacez la MEA dans l'incubateur pendant encore 30 minutes après l'incubation des cellules avec le calcium AM. Remplacez le calcium AM dans le puits par du PBS après une étape de lavage, puis obtenez les images fluorescentes des cellules à l'aide d'un microscope optique équipé de filtres pour pi.L'absorption de PI due à l'électroporation provoque une fluorescence rouge des cellules, et le calcium am provoque une fluorescence verte des cellules vivantes. La viabilité cellulaire pour chaque électrode peut être estimée à l'aide de cette équation, et l'efficacité de l'électroporation pour chaque électrode peut être estimée à l'aide de cette équation. Une fois les paramètres optimaux d'électroporation déterminés, ils peuvent être utilisés pour la délivrance ciblée d'une molécule, et la procédure d'électroporation pour les molécules d'ARNsi est identique à celle utilisée pour le PI.On observe ici l'administration spécifique à un site d'iodure de propidium dans des cellules helo sur une électrode de 200 micromètres. Le test vital basé sur le calcium a été réalisé deux heures après électroporation. Les cellules vivantes sont indiquées par une fluorescence verte ici, et la fluorescence rouge montre l'absorption d'PI par les cellules sur l'électrode.Voici l'image superposée. Ces cellules sont électroporées et vivantes, tandis que ces cellules sont mortes. Cette figure montre la transfection d'ARNi marqué avec rumine sur une électrode de 200 micromètres de diamètre, et cette figure montre la transfection de cellules HeLa avec de l'ARNi marqué Alexa 488 sur une électrode de 100 micromètres de diamètre.Les flèches blanches indiquent les cellules transfectées avec l'ARNi, tandis que les flèches noires indiquent les cellules mortes. La technique que nous avons démontrée ici peut être étendue à différentes lignées cellulaires, y compris les lignées cellulaires primaires difficiles à transfecter, et peut être utilisée pour les transfecter avec des molécules plus grandes telles que des plasmides et des protéines.

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La combinaison de poration laser et de réseaux de microélectrodes (MEA) permet des enregistrements de type potentiel d’action de cardiomyocytes cultivés primaires et dérivés de cellules souches. La forme d’onde fournit un meilleur aperçu du mode d’action des composés de test que les enregistrements standard. Il relie patch-clamp et lecture MEA pour optimiser davantage la recherche sur la sécurité cardio à l’avenir.

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Découvrez la transfection spécifique au site dans les cellules adhérentes utilisant un réseau de microélectrodes. Cette méthode d'électroporation permet une livraison précise de siRNA avec un contrôle spatial élevé pour la biologie cellulaire.

Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l'aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)

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