Rendement élevé, spécifique au site transfection de cellules adhérentes avec l'aide siARN réseaux de microélectrodes (MEA)

L'objectif général de l'expérience suivante est d'obtenir une transfection spécifique à un site donné dans des cellules adhérentes. Cette approche est réalisée en cultivant une monocouche de cellules sur un réseau de microélectrodes. Dans une deuxième étape, l'application d'une impulsion électrique à des électrodes sélectionnées provoque l'électroporation des cellules ciblées adhérentes au-dessus des électrodes.

Cela conduit à la formation de pores dans la membrane cellulaire qui permettent l'entrée de molécules exogènes dans la cellule. Les cellules ciblées peuvent ensuite être analysées pour détecter le phénotype résultant à l'aide d'un test approprié. La technique de transfection microéchelle que nous décrivons ici présente plusieurs avantages clés par rapport aux techniques conventionnelles de transfection, telles que l'électroporation en masse ou la transfection chimique.

A, cela nous permet d'obtenir un contrôle spatial exquis sur le processus de transfection lui-même et nous aide à transfecter des cellules individuelles ou des groupes de cellules avec une efficacité élevée, même dans des lignées cellulaires difficiles à transfecter. B, il s'agit d'une approche facilement reproductible qui nous permet de réaliser des tests moléculaires à haut débit. L'un des principaux avantages de l'utilisation d'une zone d'électrode microscopique pour la transfection site-spécifique est qu'elle permet l'évaluation fonctionnelle simultanée des cellules ciblées, comme l'électrophysiologie quantitative et les changements morphologiques.

Pour commencer la procédure, stérilisez la MEA dans un autoclave, puis transférez la MEA autoclavée dans une hotte à flux laminaire et placez-la dans une boîte de Petri stérile en polystyrène standard avant de semer les cellules sur la MEA. Stérilisez la hotte à flux laminaire en activant la lumière UV pendant 20 minutes. Si la MEA est sensible à la lumière UV, recouvrez la boîte de Petri contenant la MEA avec du papier d'aluminium stérile pendant que la hotte est exposée à l'illumination UV. Ensuite, traitez la surface de la MEA avec 10 microgrammes par millilitre de fibronectine pendant une à deux heures pour les cellules helo.

Effectuez un lavage avec de l’eau DI et laissez sécher à l’air le MEA dans la hotte à flux laminaire. Ensuite, récoltez les cellules à partir d’une culture cellulaire en cours de lignée cellulaire adhérente de mammifères à l’aide de trypsine ETTA et ajustez-les à une concentration de 100 à 200 cellules par microlitre dans un millilitre de milieu cellulaire pour la mise en culture. Puis déposez une goutte de 20 à 30 microlitres de milieu contenant les cellules sur le MEA.

Veillez à ce qu'elle soit suffisamment grande pour couvrir toutes les électrodes sur la MEA. Transférez ensuite la boîte de Pétri contenant la MEA dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Deux à quatre heures.

Après avoir semé les cellules, transférez la boîte de Pétri contenant la MEA de l’incubateur vers le flux laminaire. Ensuite, ajoutez délicatement 400 à 500 microlitres de milieu préchauffé à 37 degrés Celsius dans le puits de la MEA, puis vérifiez au microscope que les cellules sont toujours fixées et uniformément réparties sur la surface de la MEA. Puis, remettez la MEA dans l’incubateur. Huit à douze heures après le semis des cellules, effectuez un à deux lavages avec du PBS afin d’éliminer les cellules mortes.

Dans une expérience typique, les cellules sont généralement prêtes pour la transfection 24 à 48 heures après leur mise en culture. Pour maintenir une cohérence dans les rendements d'électroporation, il est recommandé d'attendre que la culture soit proche de la confluence avant d'effectuer l'électroporation. Afin d'obtenir une transfection efficace par sarna, il est nécessaire de déterminer au préalable les paramètres optimaux de tension et d'impulsion d'électroporation pour une MEA donnée.

Ici, nous décrivons une série d'étapes expérimentales impliquant l'utilisation d'iodure de propidium pour déterminer les paramètres optimaux d'électroporation avant l'électroporation elle-même. Préparez une solution de 300 à 500 microlitres contenant 30 microgrammes par millilitre d'IP dans un tampon d'électroporation glacé, ainsi que 400 microlitres d'une solution de calcium AM à quatre micromolaire dans du PBS. Transférez ensuite le MEA de l'incubateur vers la hotte à flux laminaire.

Retirez le milieu cellulaire de la MEA et effectuez un lavage au PBS. Ensuite, ajoutez 300 à 500 microlitres de tampon d'électroporation glacé avec pi. Puis, placez un espaceur d'un millimètre de hauteur dans la MEA.

Eh bien, il est extrêmement important de s'assurer qu'il ne touche pas les cellules situées au centre de la MEA. Ensuite, connectez la MEA à l'interconnexion électrique et sélectionnez les électrodes souhaitées pour l'électroporation. Appliquez ensuite les impulsions électriques avec l'amplitude et la durée souhaitées aux électrodes ciblées pour l'étape d'électroporation.

Abaissez la cathode en acier recouverte de feuille d'aluminium dans le puits MEA jusqu'à ce qu'elle entre en contact avec l'espacement d'un millimètre. Immédiatement après, appliquez des impulsions électriques aux électrodes ciblées. Ensuite, répétez l'étape avec un autre ensemble d'électrodes selon le plan expérimental.

Dans nos expériences avec des cellules helo, nous avons observé qu'une impulsion de tension unique, d'une amplitude comprise entre trois volts et neuf volts et d'une durée comprise entre une milliseconde et 10 millisecondes, pour une électrode d'une taille de 100 micromètres, conduisait à une électroporation réussie avec un nombre minimal de morts cellulaires. Immédiatement après l'application des impulsions de tension, transférez la MEA dans l'incubateur pendant cinq minutes.

Après une période d'incubation de cinq à dix minutes, retirez délicatement l'espacement de la MEA. Ensuite, retirez 75 % du tampon d'électroporation du puits de la MEA et remplacez-le par du milieu cellulaire tiède. Puis, remettez la MEA dans l'incubateur.

Après une période d'incubation de deux à quatre heures, remplacez le milieu cellulaire dans le puits de la MEA par 300 à 500 microlitres d'une solution de calcium AM à quatre micromolaire dans du PBS. Replacez la MEA dans l'incubateur pendant encore 30 minutes après l'incubation des cellules avec le calcium AM. Remplacez le calcium AM dans le puits par du PBS après une étape de lavage, puis obtenez les images fluorescentes des cellules à l'aide d'un microscope optique équipé de filtres pour pi.

L'absorption de PI due à l'électroporation provoque une fluorescence rouge des cellules, et le calcium am provoque une fluorescence verte des cellules vivantes. La viabilité cellulaire pour chaque électrode peut être estimée à l'aide de cette équation, et l'efficacité de l'électroporation pour chaque électrode peut être estimée à l'aide de cette équation. Une fois les paramètres optimaux d'électroporation déterminés, ils peuvent être utilisés pour la délivrance ciblée d'une molécule, et la procédure d'électroporation pour les molécules d'ARNsi est identique à celle utilisée pour le PI.

On observe ici l'administration spécifique à un site d'iodure de propidium dans des cellules helo sur une électrode de 200 micromètres. Le test vital basé sur le calcium a été réalisé deux heures après électroporation. Les cellules vivantes sont indiquées par une fluorescence verte ici, et la fluorescence rouge montre l'absorption d'PI par les cellules sur l'électrode.

Voici l'image superposée. Ces cellules sont électroporées et vivantes, tandis que ces cellules sont mortes. Cette figure montre la transfection d'ARNi marqué avec rumine sur une électrode de 200 micromètres de diamètre, et cette figure montre la transfection de cellules HeLa avec de l'ARNi marqué Alexa 488 sur une électrode de 100 micromètres de diamètre.

Les flèches blanches indiquent les cellules transfectées avec l'ARNi, tandis que les flèches noires indiquent les cellules mortes. La technique que nous avons démontrée ici peut être étendue à différentes lignées cellulaires, y compris les lignées cellulaires primaires difficiles à transfecter, et peut être utilisée pour les transfecter avec des molécules plus grandes telles que des plasmides et des protéines.