Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d'hippocampe

Classiquement, la communication entre les éléments pré- et post-synaptiques implique un potentiel d'action arrivant au terminal présynaptique, qui déclenche, par une augmentation du calcium, la libération de glutamate activant les récepteurs postsynaptiques. Cependant, l'observation selon laquelle les astrocytes entourent étroitement les synapses et expriment des récepteurs de neurotransmetteurs a modifié cette vision, conduisant au concept de la synapse tripartite. La transmission glutamatergique en cours va donc également activer l'astrocyte et déclencher une augmentation du calcium intracellulaire.

La libération des transmetteurs gliaux, qui peuvent ensuite se lier à des récepteurs extra-synaptiques ou synaptiques, module les activités pré- et post-synaptiques. De plus, les astrocytes expriment le principal système de captage du glutamate libéré au niveau synaptique. En outre, ils éliminent le potassium, qui est libéré lors de la génération du potentiel d'action et de l'activation postsynaptique subséquente, à partir des terminaisons pré- et postsynaptiques via leurs canaux potassiques.

Ce potassium est ensuite transporté intracellulairement vers des sites où la concentration extracellulaire en potassium est plus faible, lieu où il est libéré ou diffuse via les jonctions communicantes vers les astrocytes adjacents. Ainsi, en contrôlant la concentration extracellulaire de substances neuroactives ainsi qu’en libérant des neurotransmetteurs, les astrocytes jouent un rôle important dans la définition de l’intensité de l’activité synaptique. Mon laboratoire étudie le rôle des interactions neurogliales dans la physiopathologie cérébrale.

Nous avons donc largement utilisé et perfectionné cette technique afin de percer le rôle des astrocytes dans la transmission synaptique de moment en moment. En effet, cette technique est puissante car elle permet de surveiller en ligne et simultanément les réponses électrophysiologiques dynamiques des neurones. Et comme le montre aujourd'hui Osteocytes Evap clinic, Ash et Jeremy Siebel, membres du laboratoire, vous montreront comment réaliser cette technique et vous expliqueront comment elle nous aide, nous, le cing, à comprendre le dialogue intime entre neurones et astrocytes.

J'ai étudié l'impact des réseaux d'astrocytes sur les neurones, la transmission synaptique et la plasticité en réalisant des enregistrements doubles de l'activité neuronale et de l'occurrence du transport du potassium et du glutamate par les astrocytes, et j'ai découvert que le couplage en réseau des astrocytes facilite l'élimination extracellulaire du potassium et du glutamate durant l'activité neuronale. J'ai examiné les propriétés et la plasticité des astrocytes en lien avec la neurophysiologie. Lors de l'enregistrement de l'activité évoquée des astrocytes et des neurones, j'ai pu identifier que la réponse des astrocytes à l'activation neuronale se produit principalement par l'intermédiaire des courants de potassium.

Ces courants possèdent leur propre plasticité électrophysiologique, qui ne régule pas l'excitabilité et la plasticité neuronales. En d'autres termes, le compte à rebours des astrocytes, celui qui est très excité. Neuros. Nous présenterons ici une méthode importante permettant d'étudier simultanément l'activité urinaire et astrogliale dans des tranches hippocampiques aiguës, en réalisant des enregistrements doubles des courants membranaires astrocytaires et des potentiels de réponse urinaires induits par la stimulation des fibres présynaptiques.

En outre, nous effectuerons des enregistrements appariés de neurones individuels et d'astrocytes adjacents afin d'étudier les réponses gly des ASTO lors de l'activité neuronale. Nous avons choisi l'hippocampe car cette région présente une compartimentalisation anatomique et fonctionnelle marquée et est bien caractérisée en ce qui concerne les circuits neuronaux ainsi que l'activité et la plasticité synaptiques. Commencez les expériences en préparant des tranches cérébrales hippocampiques ; pour cela, préparez d'abord de la glace appelée oxygénée.

Fluide céphalo-rachidien artificiel, anesthésiez profondément vos souris et découpez rapidement la tête, puis transférez-la dans du FCR. Ouvrez le crâne à l’aide de trois incisions afin de séparer les deux hémisphères. Enfin, transférez-les dans du FCR oxygéné.

Laissez-le tresser uniformément pendant environ cinq minutes. Commencez maintenant par un hémisphère. La dissection de l'hippocampe commence par l'ablation du mésencéphale.

La dissection détaillée de l'hippocampe est maintenant illustrée sur cette figure. Placez d'abord l'hémisphère séparé sur son site cortical afin d'accéder au mésencéphale. À l'aide de deux cuillères, retirez le mésencéphale.

Maintenant, l'hippocampe sera visible, comme indiqué par les lignes en pointillés. Dissez l'hippocampe à l’aide d’une cuillère en partant du fia, qui apparaît comme une structure large. Insérez une cuillère sous l'hippocampe et, à l’aide d’une deuxième cuillère, détachez le cortex adjacent à l'hippocampe.

Transférez l'hippocampe dans une petite boîte de culture contenant du A CSF oxygéné et procédez avec l'hémisphère suivant. Placez les deux hippo sur un petit bloc AGA avec le côté alveo vers le haut. Aspirez maintenant le DS A CSF. Collez l'hippo sur votre dispositif de chambre de coupe.

Transférez l'hippocampe dans la chambre de découpe et réalisez des tranches de 300 ou 400 micromètres. Ramassez les tranches dans une chambre de stockage oxygénée et laissez-les reposer au moins une heure avant l'enregistrement, à température ambiante, afin d'effectuer des enregistrements globaux sur des astrocytes uniques. Placez votre tranche d'hippocampe sur un coverslip recouvert de polylysine.

Éliminer l'excès de LCR A pour permettre l'attachement de la tranche d'hippocampe sur le coverslip recouvert de poly et réajouter ensuite du LCR A par-dessus la tranche. Transférer la tranche dans la chambre d'enregistrement, qui est constamment perfusée avec du LCR A oxygéné à une vitesse de perfusion d'un à deux millilitres par minute. Pour identifier les astrocytes, des souris exprimant EGFP sous le promoteur spécifique des astroglies GFAP peuvent être utilisées pour des enregistrements en patch-clamp.

Remplissez une pipette en verre ayant une résistance de quatre à six mégohms avec une solution intracellulaire froide filtrée en utilisant une solution intracellulaire contenant du rodda dron ; vous pouvez ainsi visualiser en rouge l'astrocyte soumis à l’enregistrement en patch, et en vert les astrocytes environnants. Vous observez les astrocytes voisins exprimant EGFP. Sous le promoteur GFAP, les astrocytes peuvent être identifiés par la petite taille de leur corps cellulaire, d’environ 10 micromètres, ainsi que par la ramification de leurs principaux prolongements, comportant généralement trois à quatre branches.

Une seringue reliée par un tube au pipet permet d'appliquer une pression positive tout en descendant dans le tissu. Dans la fenêtre de commande, déclenchez une impulsion test de 10 millivolts et réajustez le courant de maintien. Ensuite, déplacez le pipet à l’aide du micromanipulateur dans le tissu afin de vous approcher de la cellule. Lorsque nous atteignons la surface cellulaire, nous avançons davantage jusqu’à observer un affaissement, visible sous forme d’une déviation de la lumière, indiquant que nous déformons légèrement la surface de la cellule.

En raison de l'application d'une pression positive, la membrane de la cellule astrocytaire va maintenant s'obturer étroitement contre l'ouverture de la pipette en verre, ce qui peut être observé par une augmentation de la résistance lorsque le scellement gigaohm est atteint. Effectuez la compensation de la capacité et passez en configuration de perforation par l'application douce d'une pression négative, tout en surveillant les parties du test dans la fenêtre de commande. La rupture dans la cellule sera visible par le passage d'un courant à travers la membrane.

L'application d'une série d'escaliers de tension hyperpolarisants et dépolarisants permet la caractérisation des propriétés de la membrane cellulaire que présentent normalement les astrocytes. L'injection de courant en mode courant imposé ne provoque pas de potentiel d'action, ce qui constitue une confirmation supplémentaire que vous avez bien enregistré un astrocyte. L'ajout d'un traceur tel que le soufre ou la domine B à votre pipette de patch permet la visualisation de l'astrocyte enregistré.

En outre, la diffusion passive du traceur pendant 20 minutes en mode de blocage de courant permet de visualiser les astrocytes voisins interconnectés par des jonctions communicantes afin d'effectuer des enregistrements doubles de la transmission excitatrice neuronale et des courants astrocytaires subséquemment induits. Nous bloquons d'abord la transmission inhibitrice à l'aide de précunitoïne afin d'éviter l'hypersensibilité, qui survient en l'absence de transmission GABAergique. Nous sectionnons les connexions médiées par les collatérales écharpées entre CS trois et C un à l'aide d'un petit bistouri à iridectomie.

Nous positionnons ensuite une électrode de stimulation du champ CSF, une électrode d'enregistrement du champ et l'électrode de patch-clamp astrocytaire. Dans la tranche d'hippocampe, nous choisissons un astrocyte et plaçons l'électrode de champ à 5, 200 micromètres de celui-ci afin de garantir que l'astrocyte intègre bien l'activité enregistrée ; la stimulation des collatérales de Schaffer par l'électrode de champ induira un potentiel de champ excitateur. Ce potentiel de champ est composé de la réponse des fibres, reflétant le nombre d'axones stimulés, et de la dépolarisation postsynaptique ultérieure, permettant d'effectuer des enregistrements doubles des potentiels d'entrée neuronaux et des réponses en courant en mode cellule entière des astroglies.

Commencez par positionner votre électrode d’enregistrement extracellulaire à environ 50 micromètres d’un astrocyte choisi. Ensuite, déplacez votre électrode de patch vers le soma astrocytaire et réalisez un enregistrement en mode « patch clamp » ; la cellule sélectionnée est confirmée comme étant un astrocyte par ses propriétés passives de membrane. En stimulant maintenant les Shaer Cs, nous pouvons enregistrer simultanément l’activité neuronale et un courant astrocytaire subséquent, qui se manifeste par une réponse durable pouvant atteindre 50 picomètres, en raison de la connectivité de leur réseau et du fait qu’un astrocyte unique est en contact avec les synapses de jusqu’à 100 neurones.

Ces cellules intègrent l'activité d'un grand nombre de synapses activées simultanément afin d'effectuer des enregistrements simultanés en configuration tout-enregistrement de neurones individuels et d'astrocytes adjacents à l'aide de deux électrodes de patch qui descendent dans la zone du stratum du tissu hippocampique. Identifier dans la région C un neurone d'intérêt, puis, à la même profondeur, à environ 20 à 60 micromètres de distance, un astrocyte ; positionner ensuite les deux pipettes à environ 10 micromètres au-dessus de chaque cellule tout en appliquant une pression positive. La pipette d'enregistrement astrocytaire doit être positionnée aussi près que possible de l'astrocyte ciblé afin d'éviter tout mouvement mécanique supplémentaire.

Tout d'abord, obtenez le scellement gga sur le neurone. Passez ensuite au patchage de l'astrocyte, qui scelle généralement plus lentement que les neurones. Pour résumer les étapes importantes à effectuer lors des enregistrements doubles en mode whole-cell, abaissez d'abord les deux pipettes d'enregistrement dans la tranche.

Approchez le soma de l'astrocyte, puis effectuez le scellement gga sur le neurone et terminez en réalisant le scellement gga sur l'astrocyte. Les neurones présentent généralement une résistance membranaire beaucoup plus élevée que les astrocytes, atteignant pour les neurones pyramidaux environ 200 à 500 mégaohms. Ayant les deux cellules maintenant en mode de blocage de tension T et en hyperpolarisation, la membrane active des courants sodiques transitoires dans le neurone et des réponses passives au potassium dans l'astrocyte. Nous montrons ici que l'induction de potentiels postsynaptiques excitateurs rapides par stimulation des collatérales shaa provoque une réponse en courant ultérieure prolongée.

Dans l'astrocyte adjacent, l'inhibition des récepteurs ionotropes du glutamate par l'acide rémic révèle que la majeure partie du courant astro-glycique est due à une activation postsynaptique excitatrice. La réponse restante à la B AIC comprend l'occurrence rapide et transitoire du transport du glutamate, sensible au TBOA, et un faible courant de longue durée, probablement dû à la libération présynaptique de potassium pendant l'potentiel d'action. Le courant ascitique surveille de manière très fiable l'activité postsynaptique, puisque les deux augmentent linéairement avec l'augmentation de l'activité présynaptique.

De plus, les courants astrocytaires présentent, à l'instar des réponses neuronales, une facilitation à la stimulation double. Une stimulation modérée unique des collatéraux partagés induit un courant astrocytaire évoqué synaptiquement relativement important par rapport à la faible dépolarisation évoquée enregistrée dans la même cellule en mode de blocage de courant. Ceci est dû à la faible résistance membranaire des astrocytes.

L'enregistrement des dynamiques du potentiel membranaire gly TTO induites synaptiquement constitue une mesure directe des concentrations extracellulaires locales de potassium. En réalisant des enregistrements appariés d'un neurone et d'un astrocyte adjacent, nous n'avons observé aucune réponse en courant dans l'astrocyte pendant que le neurone déchargeait des potentiels d'action, ce qui indique qu'ils n'étaient pas couplés électriquement. Les potentiels postsynaptiques excitateurs induits dans la région CS trois déclenchent également des réponses en courant dans les astrocytes. De plus, une stimulation her a fortement potentialisé la réponse neuronale dans la région CS trois, mais n'a augmenté que modérément le courant astrocytaire.

Après avoir visionné cette vidéo, nous devrions avoir une meilleure compréhension de la manière de mettre en place et de réaliser des enregistrements électrophysiologiques doubles de neurones et de cytes. En utilisant cette technique, vous pouvez étudier en temps réel la signalisation dynamique entre neurones et astrocytes pour la réponse électrophysiologique qui vous intéresse. En particulier, vous pouvez examiner si de nouvelles interactions GL impliquant les fonctions et les modulations des canaux ioniques contribuent à définir des situations physiologiques ou pathologiques.

Merci d'avoir regardé et bonne chance avec votre expérience.