Name: Peptide: CMH tétramère basée sur lenrichissement des cellules T spécifiques dépitopes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 58 s
Description: Apprenez à isoler les cellules T spécifiques d'épitopes rares à l'aide de tétramères CMH et de microbilles magnétiques chez la souris. Cette méthode permet d'étudier les populations polyclonales endogènes par cytométrie en flux.

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Les auteurs tiennent à remercier André Han Yen-Laurent et de l&#39;assistance technique, et les membres du laboratoire Jenkins de l&#39;aide à l&#39;élaboration de ce protocole.

1. Isolement cellulaire à partir des tissus lymphoïdes <ol><li> Ajouter 1 ml de glace froide cEHAA (EHAA + 10% de FBS, pénicilline / streptomycine, gentamycine, 2 mM de L-glutamine, 55 mM de 2-mercaptoéthanol) ou tout autre support équivalent des lymphocytes T, une boîte de culture de 60 mm contenant un petit carré de 100 mesh nylon um et le placer sur la glace. </li><li> Euthanasier souris. </li><li> Enlever la rate et les ganglions lymphatiques autant facilement accessibles que possible. Celles-ci doivent comprendre au moins les inguinaux, axillaires, brachiales, les ganglions lymphatiques cervicaux et mésentériques. Placez-les sur le dessus du filet de nylon dans la boîte de culture. </li><li> En utilisant la partie supérieure plate fermé d&#39;un tube de 1,5 ml de centrifugeuse, purée doucement le tissu lymphoïde au cours de la maille de nylon pour libérer les lymphocytes. Ajouter un autre 1 ml de cEHAA et pipette de haut en bas pour travailler les cellules en suspension. Transférer les cellules par un autre morceau de tulle de nylon placé sur la partie supérieure d&#39;un tube de centrifugeuse de 15 ml en polypropylène. Rincer la capsule et mesh avec un autre 1 ml de glace froide cEHAA, poOling les volumes dans le même tube. Répétez l&#39;opération pour obtenir un volume final de cellules suspension de 4 ml. </li><li> Ajouter tampon trieur de froid (PBS + 2% de FBS, azoture de 0,05%) pour un volume final de 15 ml et centrifuger le tube pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C </li><li> Soigneusement aspirer le surnageant, en s&#39;assurant qu&#39;aucun des gouttelettes de liquide sont laissées sur les parois du tube. Remettre en suspension les cellules dans Fc bloc (tampon trieur + 2.4G2 anticorps) culot jusqu&#39;à un volume final d&#39;environ deux fois égale à celle de la pastille elle-même. Par exemple, les rate et ganglions lymphatiques de souris naïves produit généralement une cellule d&#39;environ 100 pi granulés. Dans ce cas, ajouter 100 ul de bloc Fc pour porter le volume à 200 pi. Si un grand degré d&#39;agglutination cellulaire a eu lieu, retirer délicatement la motte de cellules à ce stade avec une pointe de pipette. </li></ol> 2. La coloration tétramère <ol><li> Ajouter PE-ou APC-marqué pMHC tétramère à une concentration finale de 10 nM (concentration ou empiriquement optimisé). </li><li> Mix et incubationte pendant 1 heure à température ambiante (ou le temps de manière empirique optimisé et température). </li><li> Ajouter tampon trieur de froid pour un volume de 15 ml et centrifuger le tube pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C Conserver les échantillons sur la glace ou à 4 ° C à partir de maintenant. </li><li> Soigneusement aspirer le surnageant, en s&#39;assurant qu&#39;aucun des gouttelettes de liquide sont laissées sur les parois du tube. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de tri à un volume final de 200 pl. Pour l&#39;enrichissement tétramère double, remettre en suspension dans un volume final de 150 pl. </li></ol> 3. L&#39;enrichissement magnétique <ol><li> Ajouter 50 ul de microbilles Miltenyi anti-PE ou anti-APC. Pour l&#39;enrichissement tétramère double, ajouter 50 ul des deux. </li><li> Mélanger et incuber pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter tampon trieur de froid pour un volume de 15 ml et centrifuger le tube pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C </li><li> En attendant, mettre en place une colonne LS Miltenyi magnétique sur un aimant MidiMACS ou QuadroMACS. Placer un tube à centrifuger ouverte 15 ml en polypropylène sur uneaccumuler directement sous la colonne. </li><li> Ajouter 3 ml de tampon de tri à la tête de la colonne, ce qui lui permet de s&#39;écouler dans le tube de 15 ml. </li><li> Placez un carré de 100 um maille de nylon sur le dessus de la colonne. </li><li> Lorsque les cellules ont terminé la filature, aspirer délicatement le surnageant et remettre en suspension le culot dans 3 ml de tampon trieur. </li><li> Transférer la suspension cellulaire à travers les mailles de nylon sur la tête de la colonne. </li><li> Lorsque la suspension cellulaire a complètement vidé dans la colonne, le tube de rinçage avec une autre origine ml de tampon trieur 3 et transférer le tampon à travers la maille en nylon dans la colonne, le rinçage de la maille dans le processus. Jetez le filet de nylon. </li><li> Lorsque le tampon est vidé complètement dans la colonne, ajouter une autre ml de tampon trieur 3 à la colonne. </li><li> Répétez l&#39;étape 10 pour un total de 3 lavages x 3 ml. </li><li> Supprimez la colonne de l&#39;aimant et la placer sur un nouveau tube de 15 ml en polypropylène centrifugeuse. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon trieur à til colonne. </li><li> Immédiatement après, insérer le piston dans le haut de la colonne et dans un mouvement continu, pousser le piston complètement vers le bas, ce qui oblige le tampon sur la colonne dans le tube. </li><li> Centrifuger les tubes contenant la fraction éluée liée et la fraction libre écoulement continu pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C </li><li> Soigneusement aspirer le surnageant de la fraction liée, en s&#39;assurant qu&#39;aucun des gouttelettes de liquide sont laissées sur les parois du tube. Remettre en suspension le culot cellulaire dans un tampon de tri à un volume final de 95 pl exactement. Aspirer et remettre en suspension la fraction non liée à un volume final de 2 ml. </li></ol> 4. Cytométrie en flux <ol><li> Pour chaque fraction, enlever et ajouter 5 ul à 200 ul de billes de comptage (ajusté à une concentration de 200.000 / ml dans un tampon de tri) dans un tube de 5 ml FACS. Mettez de côté à 4 ° C pour analyse ultérieure. Pour gagner du temps, les perles peuvent être pré-aliquotés dans des tubes étiquetés avant le début de l&#39;expérience. </li><li> Préparer haster mélange d&#39;anticorps anti-tache sur les marqueurs de surface des cellules (tableau 1). Pour gagner du temps, cela peut être fait avant le début de l&#39;expérience. </li><li> Pour la fraction liée, ajouter une dose de cocktail d&#39;anticorps directement à l&#39;~ 90 pl de cellules dans le tube. Si l&#39;analyse de la fraction libre est souhaité, transférer 90 ul de cellules dans un tube de 5 ml FACS et ajouter une dose de cocktail d&#39;anticorps. </li><li> Mettre en place un panel de commandes de compensation d&#39;une seule couleur pour le cytomètre en flux. Pour chaque fluorochrome à utiliser, mélanger 50 ul de cellules restes fraction libre dans un tube de 5 ml FACS avec 1 pi d&#39;anticorps anti-CD4 conjugué au fluorochrome correspondant. N&#39;oubliez pas de mettre en place un contrôle sans tache aussi. </li><li> Vortex et incuber les échantillons pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter 5 ml de tampon de tri à chaque tube et centrifuger pendant 5 min à 300 xg, 4 ° C </li><li> Pour la fraction liée, aspirer délicatement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de buf trieusefer. Transférer les cellules dans un microtube 1,2 ml FACS. Rincer le tube avec un autre ul de tampon 200 de tri et d&#39;une piscine dans le microtube même. Si amas de cellules sont apparents, passer les cellules à travers un filtre de 50 um. </li><li> Pour la fraction libre et commandes de compensation, décanter ou aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 ml de tampon de tri. </li><li> Mettre en place le cytomètre en flux à l&#39;aide des commandes de compensation d&#39;une seule couleur. Sélectionnez le côté de dispersion de largeur (SSC-W) comme un paramètre supplémentaire doit être enregistré. </li><li> Analyser les échantillons colorés à l&#39;aide d&#39;une séquence de portes d&#39;inclusion successives pour identifier les cellules CD4 + ou CD8 +, comme illustré dans les figures 1 et 2. Pour fractions liées, prélever des cellules autant que possible, jusqu&#39;à un maximum de 2.000.000 d&#39;événements au total. Pour les fractions non liées, collecter des événements 1000000 au total. Gardez le taux d&#39;acquisition ou au dessous de 3000 événements par seconde. </li><li> En utilisant les mêmes paramètres de la machine, l&#39;analyse des échantillons de comptage de perles. Recueillir 10.000 manifestations au total. &lt;/ Li&gt; <li> Sauvegardez toutes les données sous forme de fichiers FCS. </li></ol> 5. Analyse des données <ol><li> Analyser FCS fichiers de données pour les échantillons de comptage perles en utilisant le logiciel FlowJo. Nuage de points en avant par FITC et mettre une porte promenait dans les billes de comptage (voir les figures 1 et 2). Déterminer le nombre total de compter perles détectés dans chaque échantillon. Soustraire du nombre total d&#39;événements collectées pour déterminer le nombre d&#39;événements cellulaires collectés. </li><li> Calculez le nombre total de toutes les cellules dans chaque échantillon en utilisant les équations décrites dans l&#39;encadré 1. </li><li> Analyser FCS fichiers de données pour les échantillons colorés fraction liée et non liée. Mettre en place une série de portes d&#39;inclusion successives pour identifier + lymphoïde, side-scatter-largeur lo, dump-, CD3 +, CD4 + ou CD8 + tétramère + cellules T dans chaque échantillon comme illustré dans les figures 1 et 2. </li><li> Multiplier le nombre total de cellules dans l&#39;échantillon par les fréquences de chacune des portes d&#39;inclusion utilisés pour définir CD4 + tétramère+ Ou CD8 + tétramère + cellules pour calculer le nombre total de cellules T spécifiques d&#39;épitopes (encadré 1). </li></ol>

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<li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le pMHC tétramère méthode basée sur l&#39;enrichissement de cellules présenté par ce protocole est un outil puissant pour étudier épitope des cellules T spécifiques de cellules T endogènes répertoires. L&#39;utilisation de tétramères pMHC permet la détection de cellules T spécifiques d&#39;épitope basé directement sur la capacité de se lier à leurs TCR ligands apparentés pMHC. L&#39;enrichissement fournit un niveau de sensibilité de telle sorte que les populations extrêmement rares de cellules T spécifiques de l&#39;ant...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Fournisseur</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE ou APC conjugué pMHC tétramère (ou multimère)</td&gt;<td&gt; Fabriqué par l&#39;enquêteur, obtenu à partir du noyau NIH tétramère ou achetés auprès de sources commerciales</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE conjugués des microbilles magnétiques</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC conjugués des microbilles magnétiques</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Colonnes LS magnétiques</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS ou QuadroMACS aimant</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 130-090-976 ou</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Perles de comptage de cellules</td&gt;<td&gt; Life Technologies</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide: cmh tétramère basée sur l&#39;enrichissement des cellules t spécifiques d&#39;épitopes

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Une nécessité fondamentale pour les chercheurs qui étudient l&#39;immunité adaptative avec des modèles expérimentaux in vivo est une capacité à identifier les cellules T en fonction de leur récepteur antigène des cellules T (TCR) spécificité. Nombreuses méthodes indirectes qui sont disponibles dans une population de cellules T en vrac est stimulé in vitro avec un antigène spécifique et spécifiques d&#39;épitope des cellules T sont identifiés au moyen de la mesure d&#39;une réponse fonctionnelle telles que la prolifération, la production de cytokine, ou l&#39;expression de marqueurs d&#39;activation 1. Cependant, ces méthodes seulement d&#39;identifier l&#39;épitope des cellules T spécifiques présentant l&#39;une des nombreuses fonctions possibles, et ils ne sont pas suffisamment sensibles pour détecter épitope des cellules T spécifiques à des fréquences précurseurs naïfs. Une alternative populaire est le modèle TCR transgénique transfert adoptif, dans lequel les cellules T monoclonaux à partir d&#39;une souris TCR transgénique sont ensemencées dans des hôtes histocompatibles pour créer une population de précurseurs grand nombre de cellules T spécifiques d&#39;épitopes qui peuvent être easily suivi de l&#39;utilisation d&#39;un anticorps marqueur congénique 2,3. Bien que puissante, cette méthode souffre d&#39;artefacts expérimentaux liés à la fréquence non physiologique des cellules T avec une spécificité pour un seul épitope 4,5. En outre, ce système ne peut pas être utilisée pour étudier l&#39;hétérogénéité fonctionnelle des épitopes spécifiques des clones de lymphocytes T au sein d&#39;une population polyclonale. Le moyen idéal pour étudier l&#39;immunité adaptative devrait impliquer la détection directe de l&#39;épitope des cellules T spécifiques du répertoire des cellules T endogènes en utilisant une méthode qui distingue la spécificité du TCR uniquement par sa liaison au peptide apparenté: CMH (pMHC) complexes. L&#39;utilisation de tétramères pMHC et cytométrie de flux accomplit cette 6, mais il est limité à la détection de populations de haute fréquence de cellules T spécifiques d&#39;épitope ne se trouvent induite par un antigène suivant l&#39;expansion clonale. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode qui coordonne l&#39;utilisation de tétramères pMHC et magnetic technologie d&#39;enrichissement de cellules pour permettre la détection de cellules de fréquence extrêmement basse T spécifiques d&#39;épitope à partir de tissus lymphoïdes de souris 3,7. Avec cette technique, on peut suivre en détail entières populations spécifiques d&#39;épitopes de cellules T endogènes chez la souris à toutes les étapes de la réponse immunitaire.

La figure 1 illustre représentant parcelles de cytométrie en flux de pMHCII tétramère enrichi la rate et les échantillons de ganglions lymphatiques de souris naïves, tandis que la figure 2 montre des données représentatives pour souris préalablement immunisées avec le peptide pertinent + CFA. Déclenchement de série supprime autofluorescentes et d&#39;autres événements indésirables de l&#39;analyse des CD4 + populations de lymphocytes T. Le CD8 + population de cellules T sert de témoin n...

Ce protocole décrit l&#39;utilisation du peptide: CMH tétramères et les microbilles magnétiques pour isoler des populations de basse fréquence de cellules T spécifiques d&#39;épitopes et les analyser par cytométrie en flux. Cette méthode permet l&#39;étude directe des populations de cellules T endogènes d&#39;intérêt de<em&gt; In vivo</em&gt; Systèmes expérimentaux.

Peptide: CMH tétramère basée sur l&#39;enrichissement des cellules T spécifiques d&#39;épitopes

Une nécessité fondamentale pour les chercheurs étudiant l'immunité adaptative avec des modèles expérimentaux in vivo est la capacité d'identifier les lymphocytes T en fonction de leur...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'identifier des lymphocytes T spécifiques d'un épitope rare au sein du répertoire endogène des lymphocytes T de souris. Cette identification est réalisée en marquant d'abord les cellules lymphoïdes prélevées à l'aide de réactifs tétramériques peptide-MHC, qui marquent de façon fluorescente les lymphocytes T spécifiques de l'épitope concerné. Ces cellules marquées par le tétramère sont ensuite marquées avec des microbilles magnétiques conjuguées à des anticorps spécifiques de la marque fluorescente présente sur le tétramère.Ensuite, les cellules marquées magnétiquement sont passées à travers une colonne magnétisée afin d'enrichir l'échantillon en lymphocytes T spécifiques de l'épitope liés au tétramère. Enfin, les cellules sont marquées avec les marqueurs cellulaires expérimentaux souhaités et une cytométrie en flux multiparamétrique est réalisée pour détecter et quantifier les populations rares de lymphocytes T spécifiques de l'épitope enrichis en tétramères. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes existantes, comme le système de transfert adoptif de lymphocytes T transgéniques pour le TCR, est que les études sont menées sur de véritables populations polyclonales de lymphocytes T spécifiques de l'épitope qui se développent naturellement au sein du système immunitaire.En outre, la grande sensibilité de détection offerte par cette technique permet l'étude de ces populations lorsqu'elles sont présentes à des fréquences extrêmement faibles. Cette méthode peut aider à répondre à de nombreuses questions clés dans le domaine de l'immunologie, comme le nombre de lymphocytes T naïfs capables de reconnaître un antigène donné provenant d'un microbe pathogène, ou comment la composition clonale d'une population de lymphocytes T spécifique d'un épitope évolue au cours d'une réponse immunitaire. Avant de commencer la dissection, ajoutez un millilitre de milieu EHAA complet dans une boîte de culture de 60 millimètres contenant un petit carré de treillis en nylon de 100 microns, puis placez la boîte sur de la glace.Ensuite, retirer la rate d'une souris euthanasiée ainsi que le plus grand nombre possible de ganglions lymphatiques facilement accessibles. Placer les tissus sur le maillage en nylon dans la boîte de culture. Utiliser l'extrémité plate d'un tube microfuge fermé de 1,5 millimètre pour broyer doucement les tissus lymphoïdes sur le maillage en nylon.Pour libérer les lymphocytes, ajoutez un autre millilitre de milieu dans la boîte et aspirez la solution plusieurs fois à l’aide d’une pipette afin de mettre les cellules en suspension. Placez ensuite une nouvelle grille en nylon au-dessus d’un tube conique en polypropylène propre de 15 millilitres, puis transférez les cellules à travers cette nouvelle grille. Rincez la boîte et la grille avec un autre millilitre de milieu froid et faites passer les volumes à travers le nouveau morceau de grille dans le tube de 15 millilitres.Répétez le rinçage une fois de plus. Après avoir ajouté du tampon de tri froid jusqu'à un volume final de 15 millilitres, centrifugez le tube pendant cinq minutes à 300 ×g et à 4 °C. Ensuite, aspirez soigneusement le surnageant et resuspendez le culot.Suspendez le culot cellulaire dans le bloc FC jusqu'à un volume final équivalent à environ deux fois celui du culot lui-même. Si un degré élevé d'agglutination cellulaire s'est produit, retirez soigneusement l'agrégat cellulaire à l'aide d'une pipette pour la coloration destinée aux cellules T spécifiques de l'antigène.Ajouter le tétramère de peptide MHC marqué de façon fluorescente au culot cellulaire resuspendu à la concentration optimisée. Ensuite, mélanger la suspension cellulaire et incuber à la durée et à la température optimisées pour la liaison du tétramère. Puis, ajouter du tampon de tri froid pour amener le volume à 15 millilitres et centrifuger en maintenant les cellules à quatre degrés Celsius.À partir de maintenant, aspirez soigneusement le surnageant. Resuspendez ensuite le culot cellulaire dans du tampon de tri jusqu'à un volume final de 200 microlitres. Ajoutez ensuite 50 microlitres de microbilles conjuguées à l'anticorps mil tenny qui se lieront spécifiquement à la marque fluorescente du mélange de tétramères, puis incubez les cellules liées aux tétramères et les billes à quatre degrés Celsius.Après 20 minutes, laver les cellules dans le tampon de tri pendant que les cellules sont dans la centrifugeuse. Placer une colonne magnétique Milani LS sur un aimant Quadro Max et positionner un nouveau tube centrifuge en polypropylène de 15 millilitres directement sous la colonne. Ajouter trois millilitres de tampon de tri au sommet de la colonne, en laissant s'écouler dans le tube de 15 millilitres.Ensuite, placez un carré de maille en nylon de 100 microns sur le dessus de la colonne. Une fois la centrifugation des cellules terminée, aspirez soigneusement le surnageant et remettez en suspension le culot dans trois millilitres de tampon de tri. Transférez la suspension cellulaire à travers la maille de nylon sur le haut de la colonne. Lorsque la suspension cellulaire s'est complètement écoulée dans la colonne, rincez le tube d'origine avec trois autres millilitres de tampon de tri et transférez-les à travers la maille sur la colonne.Rassemblant le lavage dans le tube de collecte, jetez le tamis en nylon. Ensuite, lorsque le tampon s'est complètement écoulé dans le tube, lavez la colonne deux fois supplémentaires avec trois millilitres de tampon de tri à chaque fois. Puis retirez la colonne de l'aimant et placez la colonne au-dessus d'un nouveau tube conique en polypropylène de 15 millilitres.Ajoutez maintenant cinq millilitres supplémentaires de tampon de tri dans la colonne. Insérez immédiatement le piston dans la partie supérieure de la colonne et, d’un seul mouvement continu, poussez-le complètement vers le bas, expulsant ainsi le tampon hors de la colonne et dans le tube. Après avoir centrifugé à la fois le tube contenant la fraction liée éludée et le tube contenant la fraction non liée du flux traversant, aspirez soigneusement le surnageant de la fraction liée et remettez en suspension le culot cellulaire dans du tampon de tri jusqu'à un volume final exact de 95 microlitres. Remettez également en suspension la fraction non liée, par aspiration et resuspension, jusqu'à un volume final de deux millilitres. Avant de colorer davantage les fractions cellulaires, ajoutez 200 microlitres de billes de comptage dans un tube FACS de cinq millilitres et transférez cinq microlitres de cellules dans ce tube.Conserver ces tubes à quatre degrés Celsius pour analyse. Par la suite, préparer un mélange maître d'anticorps afin de marquer les marqueurs de surface des cellules selon le tableau. Pour la fraction liée, ajouter directement une dose de cocktail d'anticorps aux cellules destinées à la fraction non liée.Transférez 90 microlitres des cellules dans un tube fax de cinq millilitres et ajoutez une dose de cocktail d'anticorps à l'échantillon transféré pour chaque fluorochrome utilisé. Mélangez 50 microlitres de la fraction résiduelle non liée de cellules dans un tube fax de cinq millilitres avec un microlitre d'anticorps anti-CD4 conjugué au fluorochrome approprié. Réservez également un témoin non coloré à part, vortexez ensuite, puis incubez tous les échantillons à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes.Ensuite, après avoir lavé chaque tube avec cinq millilitres de tampon de tri, aspirez soigneusement le surnageant des échantillons de la fraction liée et resuspendez les cellules dans 200 microlitres de tampon de tri. Transférez les cellules dans des microtubes de 1,2 millilitre, puis rincez leurs tubes précédents avec 200 microlitres supplémentaires de tampon de tri, en regroupant les rinçages dans les microtubes correspondants. Si des agrégats sont visibles, faites passer les cellules à travers un filtre de 50 microns pour la fraction non liée et les témoins de compensation, décantez le surnageant et resuspendez les culots dans un millilitre de tampon de tri.Analyser les échantillons colorés à l’aide d’une séquence d’encadrements successifs pour identifier les lymphocytes T CD4 positifs ou CD8 positifs, comme illustré ici pour les échantillons de la fraction liée. Recueillir autant de cellules que possible, jusqu’à un maximum de 2 millions d’événements totaux pour les échantillons de la fraction non liée. Recueillir 1 million d’événements totaux.Enfin, en utilisant les mêmes paramètres de machine, collectez 10 000 évènements à partir des échantillons de billes de comptage. Cette première figure REPRESENTE des graphiques représentatifs de cytométrie en flux provenant d'échantillons de rate et de ganglions lymphatiques enrichis en tétramères de peptide CMH de type deux, obtenus chez des souris naïves, pour les fractions cellulaires liées et non liées. Une série de fenêtres a été définie afin de sélectionner les évènements positifs en dispersion latérale, positifs pour la dispersion de type lymphocytaire et négatifs pour le « dump », puis positifs pour le CD3 ; parmi ces évènements CD3 positifs, les populations CD4 positifs ou CD8 positifs ont été sélectionnées afin d'analyser les lymphocytes T spécifiques de l'épitope ou la coloration de fond.Des aliquots de cellules non marquées provenant des fractions liées et non liées ont été mélangées à des billes fluorescentes de comptage et analysées séparément. Ces diagrammes de densité illustrent des données représentatives obtenues chez des souris précédemment immunisées avec le peptide pertinent associé à un adjuvant complet. La même stratégie de sélection en série qu’au cours de l’expérience précédente a été utilisée afin d’éliminer toute autofluorescence et d’autres événements indésirables.À partir de l'analyse des populations de lymphocytes T CD4 positifs, la population de lymphocytes T CD8 positifs a servi de contrôle interne négatif utile pour la coloration par tétramères de peptide-MHC de classe II des lymphocytes T CD4 positifs. Le nombre absolu de lymphocytes T spécifiques de l'épitope dans un échantillon est calculé en multipliant le nombre total de toutes les cellules présentes dans la fraction liée de l'échantillon enrichi, déterminé à partir de l'analyse du nombre de billes, par la proportion de ces cellules qui sont tétramère-positives, déterminée à partir de l'analyse de coloration cellulaire. Pour les données représentatives de souris naïves illustrées dans la première série de diagrammes de densité, le nombre total de cellules était de 4 411 et le nombre de billes était de 5 589. La concentration stock de billes était de 2 × 10⁵ par millilitre.Le volume des billes était de 0,2 millilitre et le volume des cellules était de 0,005 millilitre. Ainsi, ces données ont été utilisées pour déterminer une concentration cellulaire de 6,31 fois 10 à la puissance six par millilitre. La concentration cellulaire a ensuite été multipliée par le volume total de l'échantillon afin de déterminer le nombre total de cellules.Ces données ont ensuite été multipliées par le pourcentage d'événements positifs pour le tétramère issus de l'analyse cellulaire afin de déterminer que le nombre de cellules T CD4 positives spécifiques de l'épitope provenant de cette souris naïve était de 98. Pour les données représentatives de la souris immunisée dans la deuxième série de diagrammes de densité, le nombre total de cellules T CD4 positives spécifiques de l'épitope était de 1,53 × 10⁴. L'efficacité de l'enrichissement diminue à mesure que le nombre de cellules T spécifiques de l'épitope augmente.Ainsi, des cellules positives pour le tétramère peuvent être observées dans la fraction non liée d'échantillons contenant des fréquences très élevées de lymphocytes T spécifiques de l'épitope. Dans de tels cas, le nombre de lymphocytes T spécifiques de l'épitope présents dans la fraction non liée peut être calculé séparément et ajouté au nombre trouvé dans la fraction liée. Par exemple, dans la fraction de cellules non liées d'une souris immunisée représentative, le nombre total de lymphocytes T CD4 positifs spécifiques de l'épitope était de 8,97 × 10³.Ainsi, en additionnant les nombres obtenus dans les fractions liée et non liée, on dénombre 2,43 fois 10 à la puissance quatre cellules T CD4 positives spécifiques de l'épitope dans l'échantillon total de souris immunisée. En effet, si l'expansion des cellules spécifiques de l'épitope est suffisamment importante, l'étape d'enrichissement peut être omise. Après la procédure d'enrichissement, des étapes d'auto-fixation et de perméabilisation peuvent être réalisées afin de permettre la coloration de protéines intracellulaires telles que les cytokines et les facteurs de transcription.Bien que cette méthode ait été initialement conçue pour l'étude des lymphocytes T provenant de la rate et des ganglions lymphatiques, elle peut également être appliquée à d'autres tissus tels que le thymus et l'intestin. La technique peut aussi être utilisée pour étudier les lymphocytes T spécifiques d'épitopes dans des échantillons sanguins et tissulaires humains.

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