Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Cancer fibroblastes associés (CAF) de faciliter l'initiation des tumeurs, la croissance et la progression à travers signalisation qui favorise la prolifération, l'angiogenèse et l'inflammation. Nous décrivons ici une méthode pour isoler des populations pures de fibroblastes normaux et de souris CAF frais et tissus humains par tri cellulaire, en utilisant PDGFRα comme un marqueur de surface.

Le but de cette procédure est d’isoler les fibroblastes normaux et associés au cancer dans les tissus frais. Ceci est accompli en disséquant d’abord les glandes mammaires. La deuxième étape consiste à préparer des glandes mammaires, des suspensions de cellules uniques, des cellules suivantes soutenues par des anticorps spécifiques aux fibroblastes, ainsi que des anticorps spécifiques à d’autres populations cellulaires.

La dernière étape consiste à effectuer l’approvisionnement en cellules activées par fluorescence ou les faits. En fin de compte, le profil d’expression Q-R-T-P-C-R de marqueurs spécifiques exprimés dans les populations cellulaires triées est utilisé pour évaluer la pureté des populations cellulaires triées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d’isolement des fibroblastes est qu’elle permet d’isoler la majorité des fibroblastes tissulaires avec une contamination minimale par les cellules immunitaires ou les cellules épithéliales, tout en évitant une étape de culture tissulaire qui pourrait modifier le profil d’expression génique des fibroblastes.

Les implications de cette technique s’étendent à toutes les thérapies contre le cancer du sein, car la compréhension et l’identification de cibles moléculaires peuvent fournir une nouvelle approche Combinator pour lutter contre la progression du cancer du sein, prolonger la survie des patientes et, en fin de compte, aider à améliorer et à adapter les options thérapeutiques individualisées. En plus de votre œil, le Dr Lena seul, le responsable du laboratoire, fera une démonstration de la procédure pour commencer cette procédure. Placez la souris femelle euthanasiée sur son dos sur une surface en polystyrène et utilisez des aiguilles de calibre 25 pour épingler fermement les quatre membres.

Vaporisez généreusement la souris avec de l’éthanol à 70 % à l’aide d’une pince. Tirez la peau abdominale vers le haut sur la ligne médiane et faites une petite incision avec des ciseaux pointus à partir de l’incision. Coupez la peau jusqu’au cou de l’animal tout en évitant de percer les cavités thoraciques abdominales.

Coupez la peau des pattes arrière de l’incision médiane vers la jambe, ce qui donne une forme en Y. Ensuite, retirez la peau du corps de la souris et épinglez-la en exposant les glandes mammaires attachées au dessous de la peau. L’une des choses les plus problématiques dans cette procédure est d’éviter de prendre du tissu musculaire.

Afin d’éviter ce problème, je ne prendrai que la quatrième et la cinquième glande mammaire et non la seconde, qui se trouve à proximité du tissu musculaire. Utilisez des cotons-tiges pour séparer doucement la glande mémoire de la peau tout en coupant le tissu conjonctif avec de petits ciseaux tranchants pour séparer la glande mémoire vers la colonne vertébrale de la souris, retirez toutes les régions nécrotiques qui se trouvent. Placez les glandes de mémoire disséquées dans PBS sur de la glace.

Le moyen le plus simple d’obtenir du tissu cutané sans avoir à s’occuper de l’épilation est d’utiliser des oreilles de souris. Utilisez des ciseaux bien aiguisés pour couper les deux oreilles de la souris euthanasiée. Placez immédiatement les oreilles dans un bocal de digestion contenant un petit volume de PBS sur de la glace.

Pour préparer une suspension unicellulaire de glande mammaire, utilisez des ciseaux incurvés pour hacher soigneusement les glandes mammaires dans un bocal de digestion contenant un petit volume de PBS sur de la glace, ajoutez 20 millilitres de solution de collagénase au tissu haché. Cette quantité de solution de collagénase dissociera efficacement environ cinq grammes de mémoire ou de tissu tumoral et d’oreilles d’un maximum de 15 souris. Placer immédiatement sur une plaque à agiter dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incuber pendant 15 minutes en remuant à une vitesse moyenne pour arrêter la réaction à 30 millilitres de DMEM froid plus 10 % FCS.

Ensuite, filtrez le mélange de tissus et de milieux à travers une passoire à cellules de 70 microns placée sur un tube conique de 50 millilitres. Centrifugez le tube conique pendant cinq minutes à 450 fois G à quatre degrés Celsius. Si les souris n’ont pas été perfusées au cœur avec du PBS avant le sacrifice, les globules rouges de l’échantillon devront être menteurs avant la coloration immunitaire.

Les cellules doivent être bloquées pour les FC endogènes avant de marquer les fibroblastes et d’autres populations cellulaires. Resus suspend les cellules dans un à trois millilitres de tampon de télécopie, puis ajoute le bloc FC à une dilution de un à 50 et incube sur de la glace pendant 10 à 20 minutes. Il n’est pas nécessaire de laver les aliquotes de cellules de transfert de bloc FC de 100 microlitres pour les tubes à utiliser comme contrôle non coloré et contrôles monocolores.

En fonction du nombre d’anticorps fluorescents utilisés dans cette démonstration, deux anticorps fluorescents seront utilisés pour marquer les fibroblastes au niveau du récepteur alpha anti PDGF. Celui-ci est directement conjugué à un fluor à une dilution de un à 50 pour l’échantillon de tri ainsi qu’aux contrôles de couleur unique pour marquer d’autres populations cellulaires. Ajouter les anticorps conjugués fluorescents appropriés aux marqueurs de surface, également à une dilution de un à 50.

Il est recommandé d’ajouter des anticorps également aux tubes de contrôle monocolore appropriés, y compris des anticorps pour les cellules immunitaires et les cellules épithéliales, afin d’exclure toute population double positive et ainsi améliorer la pureté des fibroblastes isolés. Ensuite, incubez les cellules avec des anticorps pendant une heure sur de la glace dans l’obscurité après une heure de lavage des cellules en remplissant les tubes avec le tampon de télécopie un et en tournant pendant cinq minutes à 450 fois G à quatre degrés Celsius, aspirez l’état et réanimez les cellules dans le tampon de télécopie un à la concentration la plus appropriée pour le tri avec le trieur de télécopie à utiliser. Transférez les cellules étiquetées dans des tubes de télécopie avec des couvercles filtrants et des cellules filtrantes dans les tubes pour éviter les amas de cellules, les grumeaux pour exclure les cellules mortes.

Un DPI pour tous les échantillons, à l’exception du témoin non coloré. Conservez les échantillons sur de la glace pendant l’analyse par télécopieur. Pour commencer cette procédure, utilisez le logiciel de tri de faits pour préparer le réglage fluorescent, le réglage d’acquisition et le réglage de la goutte hydrodynamique.

Vortex brièvement chaque échantillon pour remettre les cellules en suspension avant de les charger dans le trieur de cellules. Commencez par analyser l’échantillon non coloré afin de définir le point de contrôle pour l’ensemble de la population cellulaire afin d’éliminer les débris cellulaires et de déterminer l’autofluorescence ou la coloration de fond. Ensuite, analysez l’échantillon non coloré plus le DPI pour déterminer et différencier la population de cellules vivantes de la population cellulaire totale.

Analysez chaque contrôle de couleur pour déterminer et calibrer des paramètres tels que la compensation. Analysez l’échantillon de coloration pour définir la position des vannes pour le tri. Une fois que les paramètres et les portes pour les populations cellulaires souhaitées ont été définis, commencez à trier les populations cellulaires marquées dans des tubes eph ou des tubes coniques de 15 millilitres contenant un milieu de culture ou un tampon de lyse de l’ARN.

Immédiatement après la fin du tri, faites tourner les cellules vers le bas et transférez-les dans un milieu frais ou un tampon de lyse de l’ARN. Selon le but de votre expérience, s’ils sont triés, les fibroblastes doivent être cultivés, toujours plaque sur des plaques recouvertes de collagène, ne plaquez jamais directement sur du plastique, car cela entraînerait l’activation des fibroblastes entraînant des changements dans leur expression génétique. L’utilisation du récepteur PDGF alpha comme marqueur des fibroblastes permet d’isoler des populations de fibroblastes tissulaires hautement enrichies.

Dans cet exemple, des suspensions unicellulaires de glandes mammaires de souris ont été colorées avec des anticorps du récepteur PDGF alpha et des anticorps F quatre 80. Le graphique de tri des faits est illustré dans le panneau de gauche où P deux est la porte des fibroblastes et P quatre est la porte des macrophages. Une analyse post-source a été effectuée pour déterminer la pureté des fibroblastes triés indiqués dans le panneau de droite et des macrophages indiqués dans le panneau du milieu.

La figure suivante montre une analyse de la pureté de l’approvisionnement par Q-R-T-P-C-R de gènes de contrôle spécifiques aux cellules pour les fibroblastes, les cellules immunitaires et les cellules épithéliales. Les résultats ont été normalisés à deux gènes d’entretien, ga, DH et mgus, et à l’expression relative à gap. DH est montré que ces analyses montrent généralement une contamination de 0,1 à 0,6 %.

Ce niveau de pureté permet un profilage transcriptomique de haute qualité des fibroblastes isolés. La quantification de l’expression du récepteur alpha du PDGF dans une population non triée de fibroblastes mammaires indique qu’environ 85 % du total des fibroblastes tissulaires des glandes mammaires sont positifs pour le récepteur alpha du PDGF. Je me suis isolé.

Les fibroblastes peuvent être cultivés directement après le tri, mais peuvent nécessiter quelques jours pour récupérer. Il est essentiel d’effectuer toutes les expériences ultérieures avec des cellules de faible massage car les fibroblastes primaires subissent une sénescence pendant la propagation. En culture, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est bien exécutée.

Si les cellules tiercées sont désignées pour être cultivées, il est importé de se rappeler d’effectuer toute la procédure dans des conditions stériles. Dans ce tournage, nous n’avons pas effectué de tri stérile. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler une population hautement enrichie de fibroblastes à partir de tissus frais.