Name: Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez l'isolation de fibroblastes normaux et cancéreux par FACS à partir de tissus frais de souris et humains. Cette méthode utilise PDGFRα pour obtenir des populations pures sans contamination cellulaire.

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Nous remercions le Dr Yitzhak Oschry et le Dr Orit Sagi-Asif pour leur aide avec le tri par FACS. Cette recherche a été financée par des subventions à NE du Programme de l&#39;Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) en vertu de l&#39;accord de subvention n ° [276890], de l&#39;Association israélienne contre le cancer (# 20110078) et du Fonds de recherche sur le cancer Israël (Recherche Prix ​​du développement de carrière).

1. Dissection du tissu mammaire ou de la peau de souris <ol><li> Avant de disséquer le tissu désiré de souris, préparer les fournitures et réactifs suivants: Fournitures: <ul><li> Outils de chirurgie (lavés avec du détergent, puis trempé dans l&#39;éthanol à 70%). </li><li> Surface de styromousse pour reposer la souris sur lors de la dissection. </li><li> Épingles ou des aiguilles de tenir des souris lors de la dissection. </li><li> Bocal en verre avec couvercle pour la digestion, contenant un barreau d&#39;agitation magnétique (autoclave). </li><li> Bain d&#39;eau à 37 ° C, contenant un agitateur magnétique submersible et suffisamment d&#39;eau pour immerger le pot digestion, tout en reposant sur la plaque d&#39;agitation. </li></ul> Réactifs: <ul><li> Tampon FACS I: (4 ° C): phosphate de Dulbecco saline tamponnée CMF (Calcium Magnésium gratuit) + 0,5% de BSA </li><li> Solution de collagénase (faite immédiatement avant utilisation): 0,05 g collagénase II 0,05 g collagénase IV 0,01 g Deoxyribonucbail 20 ml de tampon FACS I. Conserver la solution de collagénase sur la glace jusqu&#39;à utilisation. </li><li> PharmLyse (Réactif de Lyse chlorure d&#39;ammonium). </li><li> Tampon FACS II: phosphate de Dulbecco saline tamponnée CMF + 1% de SVF. </li></ul></li><li> Dissection des glandes mammaires (voir aussi 17). <ul><li> Euthanasier les souris femelles à l&#39;aide d&#39;inhalation de dioxyde de carbone (CO 2). </li><li> Sur une surface de polystyrène, placez la souris sur son dos et la broche fermement les quatre membres avec 25 aiguilles de calibre (figure 1A). Vaporisez généreusement la souris avec de l&#39;éthanol à 70%. </li><li> En utilisant des pinces, tirer vers le haut la peau de l&#39;abdomen sur la ligne médiane et faire une petite incision avec des ciseaux pointus. </li><li> A partir de l&#39;incision, couper la peau jusqu&#39;au cou de l&#39;animal tout en évitant la perforation des cavités abdominale ou thoracique. </li><li> Coupez la peau sur les pattes arrière de l&#39;incision médiane vers la jambe, ce qui entraîne une &quot;forme de Y&quot;. </li><li> Tirez la peau loin de mouse corps et la broche vers le bas, exposant les glandes mammaires rattachées à la face inférieure de la peau (figure 1B). </li><li> Utilisez Q-tips séparer doucement les glandes mammaires de la peau tout en réduisant tissu conjonctif avec de petits ciseaux bien aiguisés pour séparer la glande mammaire vers la colonne vertébrale de la souris. </li><li> Les glandes abdominales (# 4, 5) sont les meilleurs pour ce protocole. Vous pouvez également utiliser la glande mammaire 2 ème, mais gardez à l&#39;esprit que ces glandes sont anatomiquement situé à proximité du muscle pectoral qui peuvent être difficiles à séparer, résultant en des cellules d&#39;origine mixte du tissu. </li><li> Remarque: Lors de la dissection du tissu tumoral, il est recommandé de supprimer des régions nécrotiques. </li></ul></li><li> La dissection des tissus de la peau: La meilleure façon d&#39;obtenir des tissus de la peau, sans avoir à traiter avec l&#39;épilation est d&#39;utiliser oreilles de souris. Si une plus grande quantité de tissu est nécessaire, vous pouvez vous raser les poils du torse de la souris et de disséquer la peau. <ul><li> Euthanasier les souris uchanter inhalation de CO 2. </li><li> Avec des ciseaux pointus, couper les deux oreilles et les placer immédiatement dans un pot de digestion contenant un volume faible (~ 0,5 ml) de PBS sur la glace. </li></ul></li></ol> 2. Préparation de la glande mammaire de la peau / Suspension Single Cell <ul><li> Placez les glandes mammaires / peau dans un bocal contenant la digestion d&#39;un petit volume de PBS sur la glace. Si le tissu est sanglante lavage avec du PBS x2, puis jetez excès de PBS. </li><li> Hacher soigneusement avec des ciseaux courbes. </li><li> Ajouter (note: cette quantité de solution de collagénase se dissocier efficacement environ 5 g de tissu mammaire ou une tumeur et les oreilles d&#39;un maximum de 15 souris) 20 ml solution de collagénase. </li><li> Placez immédiatement sur plaque d&#39;agitation à 37 ° C bain d&#39;eau, et incuber pendant 15 min en remuant au taux moyen. </li></ul> Remarque: Les durées optimales d&#39;incubation peut varier si la digestion d&#39;autres tissus. <ul><li> Pour arrêter la réaction, on ajoute 30 ml de DMEM froid + F 10%CS. </li><li> Filtrer le mélange tissu / support à travers un tamis 70 um cellule placée au-dessus d&#39;un tube conique de 50 ml. </li><li> Centrifuger le tube conique pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C. </li></ul> 3. Lyse des globules rouges Remarque: cette étape n&#39;est pas nécessaire si les souris étaient de cœur perfusé avec du PBS avant leur sacrifice. <ul><li> Aspirer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une pipette en verre attaché à vide, sans perturber le culot cellulaire. </li><li> Pour lyser RBC, remettre en suspension culot cellulaire dans une solution à 10 PharmLyse ml et incuber pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Neutraliser la solution PharmLyse par addition d&#39;environ 40 ml de tampon FACS I. </li><li> Faites tourner le tube conique avec des cellules pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant </li></ul> 4. Blocage de Fc endogène <ul><li> En option: compter les cellules pour déterminer le volume approprié pour la ste suivanteps. </li><li> Resuspendre les cellules dans 1-3 ml de tampon FACS I (selon le nombre de cellules, et la quantité d&#39;anticorps que vous souhaitez utiliser). </li><li> Ajouter FcBlock (anti-souris CD16/CD32) pour atteindre dilution 1:50 (10 pg / ml) et incuber sur de la glace pendant 10-20 &#39;. Pas besoin de rincer FcBlock. </li></ul> 5. Tachant <ul><li> Sortez aliquotes de 100 pi dans des tubes eppendorf être utilisées comme contrôle non teinté et des couleurs simples (selon le nombre d&#39;anticorps fluorescents utilisés). </li><li> Pour fibroblastes étiquettes: ajoutez anti-PDGFRα (directement conjugué à un fluorophore) à une dilution de 1:50 (10 pg / ml). </li><li> Pour marquer d&#39;autres populations cellulaires (par exemple, des cellules immunitaires, les macrophages, les cellules endothéliales, etc): ajouter appropriées anticorps par fluorescence conjugués à des marqueurs de surface, à une dilution de 1:50. </li></ul> Remarque: bien que PDGFRα est un marqueur robuste pour les fibroblastes, il est recommandé d&#39;inclure des anticorps pour immune cellules et de cellules épithéliales afin d&#39;exclure toutes les populations doubles positifs et renforcer ainsi la pureté de fibroblastes isolés. <ul><li> Ajouter 2 l de chaque anticorps de chacun des tubes eppendorf de contrôle de couleur uniques. </li><li> Incuber les cellules avec des anticorps pendant 1 heure sur la glace dans l&#39;obscurité. </li><li> Pour laver: remplir les tubes avec du tampon FACS I et tourner pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant, remettre les cellules en FACS Je tampon à une concentration d&#39;environ 2 x 10 6 cellules / ml, ou n&#39;importe quel concentration la plus appropriée pour le tri avec votre trieur FACS disponibles. </li></ul> En option: Les cellules peuvent être remises en suspension dans du tampon FACS II pour la durée de tri. Cela peut améliorer la viabilité des cellules. Toutefois, l&#39;exposition à des facteurs présents dans le sérum peut avoir un effet l&#39;expression des gènes, qui doivent être testés, et pris en compte. <ul><li> Transfert cellules marquées dans des tubes FACS avec filtre haut: filtre les cellules dans les tubes àempêcher amas cellulaires. </li><li> Pour exclure les cellules mortes, ajouter 7AAD (0,5 pg / ml) ou l&#39;iodure de propidium (PI) à des échantillons (sauf pour le contrôle non teinté). </li></ul> Remarque: Pour éviter de perdre des cellules, vous pouvez ajouter 7AAD/PI à l&#39;échantillon non taché après l&#39;enregistrement dans les FACS, et utiliser à nouveau comme 7AAD seule commande. <ul><li> Conserver les échantillons sur la glace lors de l&#39;analyse. </li></ul> 6. Isolement de cellules par FACS (Remarque: cette partie du protocole nécessite la connaissance de l&#39;exploitation d&#39;un trieur FACS, par exemple BD FACS AriaII, ou l&#39;assistance d&#39;un technicien qualifié). <ul><li> Utilisation du logiciel trieur FACS (BD FACSDiva), préparer des parcelles d&#39;analyse appropriés pour analyser diffusion vers l&#39;avant (FSC), la diffusion latérale (SSC), 7AAD, FITC, PE et tout autre fluorophore utilisé pour marquer les cellules (figure 2). </li><li> Avant de charger chaque échantillon au trieur de cellules, vortex brièvement pour remettre en suspension les cellules. </li><li> Commencez par analytion de l&#39;échantillon sans tache, afin de régler le déclenchement de la population cellulaire totale, à la porte des débris cellulaires, et de déterminer autofluorescence ou coloration de fond. </li><li> Analyser l&#39;échantillon non coloré + 7AAD de déterminer et porte la population de cellules vivantes de la population cellulaire totale. </li><li> Analyser chaque contrôle seule couleur de déterminer et de calibrer les paramètres tels que la rémunération. </li><li> Analyser l&#39;échantillon coloré pour définir la position des portes pour le tri. </li><li> Une fois les paramètres et portails pour les populations de cellules aient été définies, commencer à trier les populations cellulaires marqués dans des tubes Eppendorf ou 15 ml tubes coniques contenant un milieu de culture ou de tampon de lyse ARN (comme RLT tampon ou Trizol). </li></ul> Remarque: Si le tri d&#39;un grand nombre de cellules, il n&#39;est pas recommandé de trier directement dans un tampon de lyse ARN, comme le volume de liquide de gainage qui accompagne les cellules se diluer le tampon de lyse et de réduire le rendement. <ul><li> Spin cellules vers le bas immédiatement après le tri est terminé, et le transfert dans un milieu frais ou tampon de lyse ARN, selon le but de votre expérience. </li><li> Si le tri afin de cultiver des cellules isolées, effectuez sorte stérile. Pour une meilleure récupération des cellules, utilisez le rouge de phénol libre DMEM + 5% SVF au lieu de tampon FACS II et recueillir des cellules dans un milieu de culture avec 20% de FCS. </li><li> Si la culture de fibroblastes triés, alwaysplate sur des plaques recouvertes de collagène et jamais directement sur le plastique car cela conduit à l&#39;activation des fibroblastes entraînant des changements dans leur expression génique. </li></ul>

<ol><li>Kalluri, R., Zeisberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carcinoma-associated+fibroblasts+are+a+rate-limiting+determinant+for+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 19-25 (2010).</li>
<li>Orimo, A., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stromal+fibroblasts+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stromal fibroblasts in tumors.</a> Cancer Biol. Ther. 6, 618-619 (2007).</li>
<li>Ostman, A., Augsten, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+fibroblasts+and+tumor+growth--bystanders+turning+into+key+players%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+genetics+%26+development%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated fibroblasts and tumor growth--bystanders turning into key players.</a> Current opinion in genetics & development. 19, 67-73 (2009).</li>
<li>Allinen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+tumor+microenvironment+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the tumor microenvironment in breast cancer.</a> Cancer Cell. 6, 17-32 (2004).</li>
<li>Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+in+cancer+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression.</a> Nature. 432, 332-337 (2004).</li>
<li>Orimo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+fibroblasts+present+in+invasive+human+breast+carcinomas+promote+tumor+growth+and+angiogenesis+through+elevated+SDF-1%2FCXCL12+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.</a> Cell. 121, 335-348 (2005).</li>
<li>Pietras, K., Ostman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+interactions+with+the+tumor+stroma%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma.</a> Experimental cell research. 316, 1324-1331 (2010).</li>
<li>Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Arron, S. T., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-Associated+Fibroblasts+Are+Activated+in+Incipient+Neoplasia+to+Orchestrate+Tumor-Promoting+Inflammation+in+an+NF-kappaB-Dependent+Manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kappaB-Dependent Manner.</a> Cancer Cell. 17, 135-147 (2010).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li>
<li>Neumann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+and+passaging+alters+gene+expression+pattern+and+proliferation+rate+in+rheumatoid+arthritis+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+research+%26+therapy%22%5BJournal%5D)">Cell culture and passaging alters gene expression pattern and proliferation rate in rheumatoid arthritis synovial fibroblasts.</a> Arthritis research & therapy. 12, R83Forthcoming.</li>
<li>Sherr, C. J., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+mitotic+clock+or+culture+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: mitotic clock or culture shock.</a> Cell. 102, 407-410 (2000).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+complexity+in+breast+cancer+predicts+overall+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Leukocyte complexity in breast cancer predicts overall survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discovery. 1, 54-67 (2011).</li>
<li>Pahler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+tumor-promoting+inflammation%3A+impairment+of+macrophage+recruitment+evokes+a+compensatory+neutrophil+response%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Plasticity in tumor-promoting inflammation: impairment of macrophage recruitment evokes a compensatory neutrophil response.</a> Neoplasia. 10, 329-340 (2008).</li>
<li>Pietras, K., Pahler, J., Bergers, G., Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+of+paracrine+PDGF+signaling+in+the+proangiogenic+tumor+stroma+revealed+by+pharmacological+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Functions of paracrine PDGF signaling in the proangiogenic tumor stroma revealed by pharmacological targeting.</a> PLoS Med. 5, e19(2008).</li>
<li>Quante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+myofibroblasts+contribute+to+the+mesenchymal+stem+cell+niche+and+promote+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth.</a> Cancer Cell. 19, 257-272 (2011).</li>
<li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).</li>
<li>Xouri, G., Christian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+function+of+tumor+stroma+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cell+%26+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Origin and function of tumor stroma fibroblasts.</a> Seminars in cell & developmental biology. 21, 40-46 (2010).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Bien que les expériences réalisées en culture de tissus peut être informatif et proposer des principes fonctionnels qui peuvent être vérifiées in vivo, il est connu que des changements importants se produisent dans l&#39;expression des gènes des cellules en culture 11,12. Afin d&#39;éviter une étape de culture de tissus lors du profilage d&#39;expression génique dans les fibroblastes, nous avons développé un protocole qui permet l&#39;isolement de la normale, ainsi que des fibroblastes associés au ca...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nom du réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commentaires (optionnel)</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 41965</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PBS</td&gt;<td&gt; Secteurs d&#39;activité biologique</td&gt;<td&gt; 02-023-1A</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagénase II</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4176</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Collagénase IV</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS4188</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Désoxyribonucléase</td&gt;<td&gt; Worthington</td&gt;<td&gt; LS2007</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PharmLyse</td&gt;<td&gt; BD</td&gt;<td&gt; 555899</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdTamis cellulaire&gt; 70 pm</td&gt;<td&gt; SPL</td&gt;<td&gt; 93070</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Purifié anti-souris CD16/CD32</td&gt;<td&gt; BD Pharmingen</td&gt;<td&gt; 553142</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Via sonde (7AAD)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 00-6993-50</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-souris CD140a-PE (PDGFRA)</td&gt;<td&gt; E-Bioscience</td&gt;<td&gt; 12-1401-81</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-souris FITC F4/80-</td&gt;<td&gt; Cederlane</td&gt;<td&gt; CL8940F</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM w / o rouge de phénol</td&gt;<td&gt; Gibco</td&gt;<td&gt; 31053</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdCollagène de type&gt; I</td&gt;<td&gt; BD Biosciences</td&gt;<td&gt; 354236</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (facs)

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Fibroblastes associés au cancer (CAF) sont le type cellulaire le plus important au sein du stroma tumoral de nombreux cancers, notamment dans les cancers du sein, et leur présence importante est souvent associée à un mauvais pronostic 1,2. CAF sont une sous-population de fibroblastes du stroma activé, dont beaucoup expriment le marqueur de myofibroblastes α-SMA 3. CAF proviennent de fibroblastes tissulaires locales ainsi que de la moelle osseuse des cellules dérivées recrutés dans la tumeur en développement et adopter un phénotype CAF sous l&#39;influence du microenvironnement tumoral 4. CAF a montré une tumeur afin de faciliter l&#39;initiation, la croissance et la progression à travers de signalisation qui favorise la prolifération cellulaire tumorale, l&#39;angiogenèse et l&#39;invasion 5-8. Nous avons démontré que les CAF améliorer la croissance tumorale par la médiation de l&#39;inflammation tumorale-promotion, en commençant au plus tôt le pré-néoplasiques étapes 9. En dépit des preuves croissantes des CAF rôle clé que jouent dans la facilitation de la croissance tumorale,CAF étudiant a été un défi permanent en raison de l&#39;absence de marqueurs spécifiques à la CAF et de l&#39;hétérogénéité majorité de ces cellules, avec de nombreux sous-types de co-existantes dans le microenvironnement de la tumeur 10. Par ailleurs, l&#39;étude de fibroblastes in vitro est entravée par le fait que leur profil d&#39;expression génique est souvent altérée dans 11,12 culture de tissus. Pour résoudre ce problème et permettre impartiale profil d&#39;expression génique de fibroblastes de souris frais et tissus humains, nous avons développé une méthode basée sur des protocoles antérieurs pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 13,14. Notre approche repose sur l&#39;utilisation de PDGFRα comme un marqueur de surface à isoler les fibroblastes de souris frais et les tissus humains. PDGFRα est abondamment exprimé par les deux fibroblastes normaux et CAF 9,15. Cette méthode permet d&#39;isoler des populations pures de fibroblastes normaux et les EFC, y compris, mais sans s&#39;y limiter α-SMA + activé myofibroblastes. Fibroblastes isolés peuvent ensuite êtreutilisé pour la caractérisation et la comparaison de l&#39;évolution de l&#39;expression des gènes qui se produit en cours de tumorigénèse CAF. En effet, nous et d&#39;autres ont rapporté profilage de l&#39;expression des fibroblastes isolés par tri cellulaire 16. Ce protocole a été réalisé avec succès pour isoler et caractériser les populations hautement enrichies de fibroblastes de la peau des tissus, mammaires, le pancréas et les poumons. De plus, notre méthode permet également de cultiver des cellules triées, afin de réaliser des expériences fonctionnelles et pour éviter toute contamination par des cellules tumorales, ce qui est souvent un obstacle important lorsque vous essayez de CAF culture.

PDGFRα utilisant comme marqueur de résultats de fibroblastes dans l&#39;isolement de populations de fibroblastes hautement enrichi tissus. Le niveau de pureté après le tri a été de 99%, telle que quantifiée par l&#39;analyse post-tri (figure 2A). Estimer le pourcentage de contamination des cellules non fibroblastiques par l&#39;expression relative de gènes spécifiques des cellules de contrôle (figure 2B) montre généralement une contamination 0,1-0,6%. Ce niveau de pureté élevé permet pr...

Cancer fibroblastes associés (CAF) de faciliter l&#39;initiation des tumeurs, la croissance et la progression à travers signalisation qui favorise la prolifération, l&#39;angiogenèse et l&#39;inflammation. Nous décrivons ici une méthode pour isoler des populations pures de fibroblastes normaux et de souris CAF frais et tissus humains par tri cellulaire, en utilisant PDGFRα comme un marqueur de surface.

Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Les fibroblastes associés au cancer (FAC) constituent le type cellulaire le plus prédominant au sein du stroma tumoral de nombreux cancers, en particulier le carcinome mammaire, et leur...

L'objectif de cette procédure est d'isoler des fibroblastes normaux et associés au cancer à partir de tissus frais. Cela est réalisé en premier lieu par la dissection des glandes mammaires. La deuxième étape consiste à préparer à partir des glandes mammaires des suspensions de cellules uniques, puis à marquer les cellules avec des anticorps spécifiques des fibroblastes ainsi qu'avec des anticorps spécifiques d'autres populations cellulaires.La dernière étape consiste à effectuer un tri cellulaire activé par fluorescence, ou FACS. En fin de compte, un profil d'expression par Q-R-T-P-C-R de marqueurs spécifiques exprimés dans les populations cellulaires triées est utilisé pour évaluer la pureté des populations cellulaires triées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes d'isolement des fibroblastes est qu'elle permet d'isoler la majorité des fibroblastes tissulaires avec une contamination minimale par des cellules immunitaires ou épithéliales, tout en évitant une étape de culture tissulaire susceptible de modifier le profil d'expression génique des fibroblastes.Les implications de cette technique s'étendent à tous les traitements du cancer du sein, car la compréhension et l'identification de cibles moléculaires pourraient offrir une nouvelle approche combinatoire pour lutter contre la progression du cancer du sein, prolonger la survie des patientes et, ultimement, contribuer à améliorer et à personnaliser les options thérapeutiques individuelles. En plus de votre œil, seule la Dre Lena, responsable du laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer cette procédure, placez la souris femelle euthanasiée sur le dos sur une surface en polystyrène et utilisez des aiguilles de calibre 25 pour fixer fermement les quatre membres.Pulvériser généreusement la souris avec de l'éthanol à 70 % à l’aide de pinces. Relever la peau abdominale au niveau de la ligne médiane et pratiquer une petite incision avec des ciseaux fins en partant de cette incision. Inciser la peau jusqu’au niveau du cou de l’animal tout en évitant de percer les cavités abdominale et thoracique.Couper la peau des pattes arrière depuis l'incision médiane vers la patte, de manière à former une forme en Y. Ensuite, tirer la peau loin du corps de la souris et l'épingler pour exposer les glandes mammaires fixées à la face inférieure de la peau. L'un des aspects les plus délicats de cette procédure consiste à éviter de prélever du tissu musculaire.Afin d'éviter ce problème, je prélèverai uniquement la quatrième et la cinquième glande mammaire, et non la deuxième, qui se trouve à proximité immédiate du tissu musculaire. Utilisez des tiges de coton pour séparer délicatement la glande mammaire de la peau tout en coupant le tissu conjonctif avec de petites ciseaux pointus afin de détacher la glande mammaire vers la colonne vertébrale de la souris, et retirez toutes les régions nécrosées éventuellement présentes. Placez les glandes mammaires disséquées dans du PBS sur de la glace.La méthode la plus simple pour obtenir un tissu cutané sans avoir à éliminer les poils consiste à utiliser les oreilles de souris. Utilisez des ciseaux bien aiguisés pour couper les deux oreilles de la souris euthanasiée. Placez immédiatement les oreilles dans un flacon de digestion contenant un petit volume de PBS sur de la glace.Pour préparer une suspension de cellules uniques de glande mammaire, utilisez des ciseaux courbes pour hacher soigneusement les glandes mammaires dans un flacon de digestion contenant un petit volume de PBS sur de la glace, puis ajoutez 20 millilitres de solution de collagénase au tissu haché. Cette quantité de solution de collagénase dissociera efficacement environ cinq grammes de tissu mammaire ou tumoral et d’oreilles provenant de jusqu’à 15 souris. Placez immédiatement le flacon sur une plaque agitatrice dans un bain-marie à 37 degrés Celsius et incubez pendant 15 minutes en agitant à vitesse moyenne, puis arrêtez la réaction avec 30 millilitres de DMEM froid supplémenté de 10 % de SFC.Ensuite, filtrer le mélange de tissu et de milieu à l’aide d’un tamis cellulaire de 70 microns placé sur un tube conique de 50 millilitres. Centrifuger le tube conique pendant cinq minutes à 450 ×g et à 4 degrés Celsius. Si les souris n’ont pas été perfusées au PBS par le cœur avant l’euthanasie, les globules rouges présents dans l’échantillon devront être lysés avant la coloration immunologique.Les cellules doivent être bloquées pour les récepteurs Fc endogènes avant l'étiquetage des fibroblastes et d'autres populations cellulaires. Resuspendre les cellules dans un à trois millilitres de tampon FACS 1, puis ajouter le blocage Fc à une dilution de 1/50 et incuber sur de la glace pendant 10 à 20 minutes. Il n'est pas nécessaire de retirer le blocage Fc ; transférer des aliquots de 100 microlitres de cellules dans des tubes Eppendorf qui serviront de témoin non coloré et de témoins monocolorants.En fonction du nombre d'anticorps fluorescents utilisés dans cette démonstration, deux anticorps fluorescents seront utilisés pour marquer les fibroblastes dirigés contre le récepteur alpha du PDGF. Ceux-ci sont directement conjugués à un fluorochrome et dilués au ratio de un à 50 dans l'échantillon trié ainsi que dans les contrôles monochromes afin de marquer d'autres populations cellulaires. Ajoutez les anticorps appropriés conjugués à des fluorochromes dirigés contre les marqueurs de surface, également à une dilution de un à 50.Ajoutez également des anticorps à des tubes de contrôle monochromatiques appropriés, y compris des anticorps dirigés contre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales, afin d'exclure toute population doublement positive et ainsi améliorer la pureté des fibroblastes isolés. Incubez ensuite les cellules avec les anticorps pendant une heure sur de la glace, à l'abri de la lumière. Après une heure, lavez les cellules en remplissant les tubes avec le tampon fax un et en centrifugeant pendant cinq minutes à 450 ×g à quatre degrés Celsius. Aspirez le surnageant et resuspendez les cellules dans le tampon fax un à une concentration adaptée au tri à l’aide du trieur fax à utiliser. Transférez les cellules marquées dans des tubes fax munis de bouchons filtrants et filtrez les cellules dans les tubes afin d'éviter les agrégats cellulaires et d'exclure les cellules mortes.Un DPI à tous les échantillons sauf au témoin non coloré. Garder les échantillons sur glace pendant l'analyse en cytométrie. Pour commencer cette procédure, utiliser le logiciel du trieur à cellules pour régler les paramètres de fluorescence, les paramètres d'acquisition et les paramètres hydrodynamiques de formation des gouttes.Vortexez brièvement chaque échantillon afin de resuspendre les cellules avant de les charger dans le trieur cellulaire. Commencez par analyser l'échantillon non coloré afin de définir le fenêtrage pour la population totale de cellules, exclure les débris cellulaires et déterminer l'autofluorescence ou la coloration de fond. Ensuite, analysez l'échantillon non coloré additionné de DPI afin de déterminer et de sélectionner la population de cellules vivantes parmi la population totale de cellules.Analyser chaque témoin monocouleur afin de déterminer et calibrer des paramètres tels que la compensation. Analyser l'échantillon coloré pour définir la position des fenêtres de tri. Une fois les paramètres et fenêtres définis pour les populations cellulaires souhaitées, commencer le tri des populations cellulaires marquées dans des tubes Eppendorf ou des tubes coniques de 15 millilitres contenant du milieu de culture ou un tampon d'lysis pour ARN.Immédiatement après le tri, centrifuger les cellules et les transférer dans un milieu frais ou dans un tampon de lyse pour ARN. Selon l'objectif de votre expérience, si les fibroblastes triés doivent être mis en culture, les ensemencer systématiquement sur des plaques revêtues de collagène et jamais directement sur du plastique, car cela entraînerait une activation des fibroblastes et des modifications de leur expression génique. L'utilisation du récepteur PDGF alpha comme marqueur des fibroblastes permet d'obtenir des populations fortement enrichies en fibroblastes tissulaires.Dans cet exemple, des suspensions de cellules uniques de glandes mammaires de souris ont été marquées avec des anticorps dirigés contre le récepteur alpha du PDGF et le F quatre 80. Le tracé de tri est présenté dans le panneau gauche, où P deux correspond à la porte des fibroblastes et P quatre à la porte des macrophages. Une analyse postérieure au tri a été réalisée afin de déterminer la pureté des fibroblastes triés, illustrée dans le panneau droit, et des macrophages, illustrés dans le panneau central.La figure suivante présente une analyse de la pureté d'approvisionnement par Q-R-T-P-C-R de gènes de contrôle spécifiques aux cellules pour les fibroblastes, les cellules immunitaires et les cellules épithéliales. Les résultats ont été normalisés à deux gènes de référence, ga, DH et mgus, et l'expression relative à gap. DH est indiquée ; ces analyses montrent généralement une contamination de 0,1 à 0,6 %.Ce niveau de pureté permet un profilage de transcriptome de haute qualité des fibroblastes isolés. La quantification de l'expression du récepteur alpha du PDGF dans une population non triée de fibroblastes mammaires indique qu'environ 85 % des fibroblastes tissulaires totaux dans les glandes mammaires sont positifs pour le récepteur alpha du PDGF. J'ai isolé.Les fibroblastes peuvent être cultivés directement après tri, mais peuvent nécessiter quelques jours pour se rétablir. Il est essentiel de réaliser toutes les expériences ultérieures avec des cellules peu passagées, car les fibroblastes primaires entrent en sénescence lors de leur propagation. En culture, une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est effectuée correctement.Si les cellules divisées en trois doivent être cultivées, il est important de se rappeler d'effectuer toute la procédure dans des conditions stériles. Dans cette expérience, nous n'avons pas effectué de tri stérile. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler une population fortement enrichie de fibroblastes à partir de tissu frais.

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Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (Vidéo) | JoVE Journal

Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

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