Name: Quantitative FRET (transfert de Förster Resonance Energy) Analyse de la protéase SENP1 Kinetics Détermination (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 2 s
Description: Découvrez une méthode FRET quantitative pour analyser la cinétique de la protéase SENP1 en temps réel. Cette technique permet de déterminer les paramètres KM et kcat avec précision pour l'étude enzymatique.

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Nous sommes très reconnaissants à Victor GJ Rodgers pour ses conseils précieux. Nous tenons à remercier tous les membres du groupe Liao pour le travail collaboratif très proche et de l&#39;aide pour cette étude. Cette étude a été financée par le National Institutes of Health (Grant AI076504 à JL).

1. Constructions plasmidiques <ol><li> Amplifier les cadres ouverts de lecture des gènes par PCR et le clonage des produits PCR dans pCRII-TOPO vecteur. </li><li> Confirmer les produits de séquençage, et cloner l&#39;ADNc codant pour CyPet-(pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, et YPet domaines catalytiques de SENP1 dans l&#39;pET28 (b) avec un vecteur étiquette hexahistidine N-terminale. </li></ol> 2. Expression et purification des protéines <ol><li> Transformer des cellules d&#39;Escherichia coli de la souche BL21 (DE3) avec pET28 (b) des vecteurs codant CyPet-(pré-SUMO1)-YPet, CyPet-SUMO1, YPet et les domaines catalytiques de SENP1. </li><li> Cultivé des bactéries transformées dans un milieu 2xYT pendant 3 heures à 37 ° C (agitation à 250 tours par minute) pour atteindre une densité optique de 0,5 à 600 nm. </li><li> Ajouter 100 uM isopropyl-β-D-galactoside (IPTG) (concentration finale) pour induire l&#39;expression des protéines et agiter pendant 16 heures à 25 ° C à 200 tpm. </li><li> Récolter les bactéries par centrifugtion à 10000 rpm à 4 ° C pendant 5 min et les remettre en suspension dans un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM de NaCl et 5 mM imidazole. </li><li> Soniquer les cellules pendant 10 min dans 5 sec intervalles à une puissance de 25 W en utilisant MiSonics 4000 sonicateur et les récupérer par centrifugation à 35.000 xg à 4 ° C pendant 30 min. </li><li> Mettre en place la colonne avec 500 ml de Ni-NTA perles de culture 1 L et transférer le surnageant dans la colonne. </li><li> Laver la résine avec un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 500 mM de NaCl, et 10 mM d&#39;imidazole deux fois. </li><li> Protéines élue avec un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM et 500 mM d&#39;imidazole et la dialyse dans un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM et 1 mM de dithiothréitol (DTT) à 4 ° C pendant la nuit. </li><li> Déterminer les concentrations des protéines purifiées par la méthode de Bradford. Autre méthode pour la mesure des concentrations de protéines sera électrophorèse sur gel SDS-PAGE, puis colorées au bleu de Coomassie suivie par imageriequantitative. </li></ol> 3. FRET quantitative d&#39;analyse spectrale <ol><li> La stratégie générale pour le test était basé sur le FRET de signalisation (Figure 1). La paire FRET, et CyPet YPet, a été marqué à l&#39;extrémité N-et C-terminales, respectivement, de pré-SUMO1. SENP1 clive la protéine de fusion CyPet-(pré-SUMO1)-YPet sur le site Gly-Gly dans SUMO1 C-terminale et, ainsi, libère la queue avec YPet SUMO. Le signal de FRET est perturbé, ce qui entraîne une augmentation de l&#39;émission de CyPet et une diminution spectaculaire des émissions de YPet de la longueur d&#39;onde d&#39;excitation CyPet. </li><li> Lorsqu&#39;il est excité par de la lumière de longueur d&#39;onde 414 nm, l&#39;émission de fluorescence totale de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet à 530 nm peuvent être dérivés à partir de trois sources: des émissions de l&#39;absolu FRET induite YPet, la CyPet directe d&#39;émission et YPet directe d&#39;émission (Figure 2). </li></ol><img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq1.jpg" /> où FL 530/414 &lt;/ Sub&gt; est l&#39;émission de fluorescence totale à 530 nm lorsqu&#39;il est excité à 414 nm, FL FRET est l&#39;absolu signal de FRET, FL CyPet (cont) est l&#39;émission CyPet directe lorsqu&#39;il est excité à 414 nm, et FL YPet (cont) est le YPet diriger des émissions lorsqu&#39;il est excité à 414 nm. L&#39;indice de (cont) représente la contribution. <ol start="3"><li> L&#39;émission directe de CyPet à 530 nm est proportionnelle à son émission à 475 nm lorsqu&#39;il est excité à 414 nm avec un rapport constant de α. CyPet-SUMO1 été préparées à des concentrations de 50, 100, 200, 500 et 750 nM et 1 mM , et les émissions à 475 et 530 nm ont été mesurées après excitation à 414 nm pour déterminer α (figure 3-1). </li><li> L&#39;émission directe de YPet à 530 nm sous excitation à 414 nm est proportionnelle à son émission à 530 nm lorsqu&#39;il est excité à 475 nm avec un rapport constant de β. YPet été préparées à des concentrations de 50, 100, 200, 500, 750 Ae 1.000 nM, et l&#39;émission à 530 nm a été mesurée lorsque les échantillons sont excités par des longueurs d&#39;onde de 414 et 475 nm pour déterminer β (figure 3-2). </li><li> Lorsque CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a été digéré par SENP1, le clivage publié CyPet-SUMO1 et la queue SUMO1 avec YPet. Lorsque le composé est excité à 414 nm, l&#39;émission de fluorescence à 530 nm (FL &#39;530/414) a été diminué, mais peut encore être divisé en trois parties: </li></ol><img alt="Équation 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq2.jpg" /> où FL &#39;530/414 est l&#39;émission de fluorescence totale à 530 nm après digestion lorsqu&#39;il est excité à 414 nm, FL&#39; FRET est le reste absolue signal de FRET, CyPet FL »(475/414) est l&#39;émission CyPet à 475 nm après digestion quand excité à 414 nm (ici l&#39;émission CyPet est en deux parties: non digérés CyPet-(pré-SUMO1)-YPet et digéré CyPet-SUMO1), et FL YPet(530/475) est l&#39;émission YPet lorsqu&#39;il est excité à 475 nm, qui est constante si CyPet-(pré-SUMO1)-YPet est digéré ou non. <ol start="6"><li> Après digestion par SENP1, le reste FRET émission (FL &#39;FRET) est la suivante: </li></ol><img alt="L&#39;équation 3" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq3.jpg" /> où C est la concentration totale de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet et x est la concentration de digéré CyPet-(pré-SUMO1)-YPet. <ol start="7"><li> En combinant tous les éléments, l&#39;émission de fluorescence détectée à 530 nm sous excitation de 414 nm (FL &#39;530/414) est la suivante: </li></ol><img alt="L&#39;équation 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq4.jpg" /> 4. Essai de la protéase à base de FRET pour l&#39;étude cinétique enzymatique <ol><li> CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a été incubé avec le domaine catalytique de SENP1 à 37 ° C dans un tampon de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) de Tween-20 et 1 mM de DTT dans un volume total de 80 ml et transférée dans la plaque 384-puits. </li><li> Essais ont été réalisés en mesurant l&#39;émission de fluorescence à 475 et 530 nm après une excitation à 414 nm dans un lecteur de fluorescence de plaque multi puits pendant 5 min à 15-Sec intervalles. </li><li> La vitesse de la réaction (V) est en corrélation avec la variation de la quantité de substrat (S) en tant que: </li></ol><img alt="L&#39;équation 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq5.jpg" /><ol start="4"><li> La concentration du produit augmente de façon exponentielle à partir de 0 à [S] 0 (concentration en substrat d&#39;origine) quand t = 0: </li></ol><img alt="L&#39;équation 6" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq6.jpg" /><ol start="5"><li> Quand t = 0, la vitesse initiale (V 0) est la suivante: </li></ol><img alt="Équation 7" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq7.jpg" /><ol start="6"><li> Le concentréentration de SENP1 est fixée, et la concentration de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet a été augmentée de 100 fois supérieure à la concentration de l&#39;enzyme, ce qui est requis par l&#39;équation de Michaelis-Menten. </li><li> Toutes les lectures fluorescentes ont été analysés par la méthode d&#39;analyse FRET quantitative et tracés dans GraphPad Prism V Logiciel pour s&#39;adapter à l&#39;équation de Michaelis-Menten. La régression non linéaire peut également être effectuée à l&#39;aide d&#39;autres logiciels courants tels que des tableurs (comme Microsoft Excel). </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Maturation de la pré-SUMO1 par SENP1 peut être déterminée en contrôlant les variations du signal de fluorescence à 475 nm et 530 au cours du processus. Les résultats ont montré que la vitesse de pré-SUMO1 digestion par SENP1 substrat d&#39;une manière dose-dépendante (Figure 4). Ceci suggère que le domaine catalytique de SENP1 présente une activité excellente pour la maturation du pré-SUMO1. La réaction initialetion vitesses ont été calculées par l&#39;analyse ci-dessus avec des concentrations de substrat différentes (tableau 1). Le k cat / K M est généralement utilisé pour comparer l&#39;efficacité des différentes enzymes avec un substrat ou une enzyme particulière avec différents substrats. K M et V max peut être obtenu à partir de l&#39;équation de Michaelis-Menten en traçant les différentes vitesses initiales, correspondant pour les différentes concentrations de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet (figure 5) k cat a été obtenue comme.: <img alt="Équation 8" src="/files/ftp_upload/4430/4430eq8.jpg" /> Selon l&#39;analyse ci-dessus, la valeur calculée est de 0,21 M K ± 0,04 uM, le chat était k 6,90 ± 0,28 s -1 et k cat / K M ratio était de (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 </sup<html> &gt; S -1. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig1.jpg" /> Figure 1. Graphe de test FRET protéase à base de SENP pré-sumos maturation. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig2.jpg" /> Figure 2. Analyse quantitative de signal fluorescent à titre de contributions par le donneur, accepteur et FRET. La dissection des spectres d&#39;émission de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet sous excitation à 414 nm. CyPet FL (530/414) est des émissions CyPet de à 530 nm sous excitation de 414 nm, FL FRET est l&#39;émission FRET induite YPet à 530 nm sous excitation de 414 nm, et FL YPet (530/414) est une émission YPet de à 530 nm sous excitation de 414 nm. load/4430/4430fig3.jpg &quot;/&gt; Figure 3. Calcul du facteur α et β direction d&#39;émission. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig4.jpg" /> La figure 4. L&#39;analyse quantitative de CyPet-(pré-SUMO1)-YPet digéré par différentes proportions du domaine catalytique de SENP1. Les réactions ont été suivies dans les 5 premières minutes. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4430/4430fig5.jpg" /> Figure 5. Michaelis-Menten analyse graphique de la digestion CyPet-(pré-SUMO1)-YPet par SENP1. Les données ont été tracées et analysées par GraphPad Prism V et la régression non linéaire. <table border="1"><tbody><tr><td> [S] (M) </td><td> V 0 (pM / s) </td></tr><tr><td> 0,115 </td><td> 0,0023 ± 0,00005 </td></tr&gt; <tr><td> 0,214 </td><td> 0,0028 ± 0,00004 </td></tr><tr><td> 0,407 </td><td> 0,0033 ± 0,00007 </td></tr><tr><td> 0,594 </td><td> 0,0037 ± 0,00013 </td></tr><tr><td> 0,725 </td><td> 0,0043 ± 0,00012 </td></tr><tr><td> 1,471 </td><td> 0,0051 ± 0,00036 </td></tr><tr><td> 1,899 </td><td> 0,0050 ± 0,00031 </td></tr><tr><td> 2,300 </td><td> 0,0050 ± 0,00062 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Initiale de détermination des vitesses de maturation pré-SUMO1 par SENP1. Dans chaque concentration de substrat, quatre échantillons ont été utilisés pour mesurer la digestion. L&#39;écart-type est venu à partir des variations de ces quatre échantillons. <table border="1"><tbody><tr><td> K M (M) </td><td> k cat (s-1) </td><td> k cat / K m (M -1 s •-1) </td></tr><tr><td> 0,21 ± 0,04 </td><td> 6,90 ± 0,28 </td><td> 3,2 ± 0,55 x 10 7 </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Paramètres cinétiques de maturation pré-SUMO1 par SENP1 par FRET quantitative d&#39;analyse. L&#39;écart-type est venu des quatre échantillons de chaque concentration de substrat.

<ol><li>Johnson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+modification+By+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein modification By SUMO.</a> Annual Review of Biochemistry. 73, 355-382 (2004).</li>
<li>Gill, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+and+ubiquitin+in+the+nucleus%3A+different+functions%2C+similar+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">SUMO and ubiquitin in the nucleus: different functions, similar mechanisms.</a> Genes & Development. 18, 2046-2059 (2004).</li>
<li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%3A+a+history+of+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18, 1-12 (2005).</li>
<li>Müller, S., Hoege, C., Pyrowolakis, G., Jentsch, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO%2C+ubiquitin%27s+mysterious+cousin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SUMO, ubiquitin's mysterious cousin.</a> Nature. , 202-210 (2001).</li>
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<li>Mukhopadhyay, D., Dasso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+in+reverse%3A+the+SUMO+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modification in reverse: the SUMO proteases.</a> Trends in Biochemical Sciences. 32, 286-295 (2007).</li>
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<li>Horton, R., Strachan, E., Vogel, K., Riddle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+substrate+for+deubiquitinating+enzymes+based+on+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer+between+terbium+and+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A substrate for deubiquitinating enzymes based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer between terbium and yellow fluorescent protein.</a> Analytical Biochemistry. 360, 138-143 (2007).</li>
<li>Mikolajczyk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+Ubiquitin-related+Modifier+%28SUMO%29-specific+Proteases%3A+PROFILING+THE+SPECIFICITIES+AND+ACTIVITIES+OF+HUMAN+SENPs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Small Ubiquitin-related Modifier (SUMO)-specific Proteases: PROFILING THE SPECIFICITIES AND ACTIVITIES OF HUMAN SENPs.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 26217-26224 (2007).</li>
<li>Kolli, N., Mikolajczyk, J., Drag, M., Mukhopadhyay, D., Moffatt, N., Dasso, M., Salvesen, G., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distrubition+and+paralogue+specificity+of+mammalian+deSUMOylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Distrubition and paralogue specificity of mammalian deSUMOylating enzymes.</a> Biochem. J. , 335-344 (2010).</li>
<li>Drag, M., Mikolajczyk, J., Krishnakumar, I. M., Huang, Z., Salvesen, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+profiling+of+human+deSUMOylating+enzymes+%28SENPs%29+with+synthetic+substrates+suggests+an+unexpected+specificity+of+two+newly+characterized+members+of+the+family%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Activity profiling of human deSUMOylating enzymes (SENPs) with synthetic substrates suggests an unexpected specificity of two newly characterized members of the family.</a> Biochemical Journal. 409, 461(2008).</li>
<li>Engels, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+resonance+energy+transfer-based+assay+for+DEN1+peptidase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence resonance energy transfer-based assay for DEN1 peptidase activity.</a> Analytical Biochemistry. 390, 85-87 (2009).</li>
<li>Martin, S., Hattersley, N., Samuel, I., Hay, R., Tatham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-resonance-energy-transfer-based+protease+activity+assay+and+its+use+to+monitor+paralog-specific+small+ubiquitin-like+modifier+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-resonance-energy-transfer-based protease activity assay and its use to monitor paralog-specific small ubiquitin-like modifier processing.</a> Analytical Biochemistry. 363, 83-90 (2007).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nature Biotechnology. 23, 355-360 (2005).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

FRET technologie a été utilisée pour étudier la maturation pré-SUMO1 par SENP1 9. CFP-YFP a été utilisé comme la paire FRET et l&#39;analyse ratiométrique, qui est le rapport de l&#39;accepteur d&#39;émissions de bailleurs de fonds, a été utilisé pour caractériser les propriétés cinétiques. Cependant, il n&#39;ya aucune considération de donneur et accepteur d&#39;auto-fluorescence dans le ratiométrique traditionnelle analyse FRET. Le rapport n&#39;est pas directement corrélée avec la quantité de substrat digé...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> II TOPO PCR Kit </td><td> Invitrogen </td><td> K466040 </td></tr><tr><td> 2xYT </td><td> Recherche sur les produits Internationa.l Corp </td><td> X15600 </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Thermo Scientific </td><td> 88222 </td></tr><tr><td> Coomassie plus (Bradford) Regent Assay </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23238 </td></tr><tr><td> Plaque de 384 puits (à fond de verre) </td><td> Greiner </td><td> 781892 </td></tr><tr><td> FlexStation II 384 lecteur de plaque </td><td> Appareil moléculaire </td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative fret (transfert de förster resonance energy) analyse de la protéase senp1 kinetics détermination

Quantitative FRET (F&#246;rster Resonance Energy Transfer) Analysis for SENP1 Protease Kinetics Determination

Réversibles modifications post-traductionnelles des protéines avec des protéines ubiquitine ou l&#39;ubiquitine-like (UBLS) sont largement utilisés pour réguler dynamiquement l&#39;activité des protéines et jouent des rôles divers dans de nombreux processus biologiques. Par exemple, SUMO modifie de façon covalente un grand nombre ou des protéines avec des rôles importants dans de nombreux processus cellulaires, y compris les cellules cycle de régulation, la survie cellulaire et la mort, la réponse dommages à l&#39;ADN et de réponse au stress 1-5. SENP, comme SUMO protéase spécifique, fonctionne comme une endopeptidase dans la maturation de précurseurs ou sous forme SUMO isopeptidase pour supprimer SUMO de ses protéines cibles et actualiser le cycle 1,3,6,7 SUMOylation. L&#39;efficacité ou la spécificité catalytique d&#39;une enzyme est mieux caractérisée par le rapport des constantes cinétiques k cat / K m. Dans plusieurs études, les paramètres cinétiques de SUMO-SENP paires ont été déterminées par des méthodes différentes, y compris en gel de polyacrylamide à base de western-blot, radIOActive substrat marqué, un composé fluorescent ou une protéine marquée substrat 8-13. Cependant, les techniques de polyacrylamide à base de gel, qui étaient les «indigènes» des protéines, mais sont laborieux et techniquement exigeant, qui ne se prêtent pas facilement à une analyse quantitative détaillée. Le obtenues k cat / K M d&#39;études utilisant tétrapeptides ou des protéines avec un ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) ou AMC (7-amino-4-méthylcoumarine) fluorophore étaient soit jusqu&#39;à deux ordres de grandeur plus faible que les substrats naturels ou ne peut pas distinguer clairement les activités et les iso-endopeptidase de SENPs. Tests de protéase récemment, à base de FRET ont été utilisés pour étudier les enzymes désubiquitination (DUB) ou SENPs avec la paire FRET de la protéine fluorescente cyan (CFP) et la protéine fluorescente jaune (YFP) 9,10,14,15. Le taux d&#39;émission de l&#39;accepteur d&#39;émission du donneur a été utilisé en tant que paramètre quantitatif de FRET signal de contrôle en courant alternatif pour la protéasetivité détermination. Cependant, cette méthode de signaux ignorés contaminations croisées à l&#39;accepteur et donneur d&#39;onde d&#39;émission accepteur et donneur d&#39;auto-fluorescence et donc n&#39;était pas exacte. Nous avons développé un roman très sensible et quantitative dosage de protease FRET basée sur la détermination des paramètres cinétiques de la pré-SUMO1 maturation par SENP1. Une ingénierie FRET CyPet paire et avec YPet considérablement amélioré l&#39;efficacité et la fluorescence FRET rendement quantique, ont été utilisés pour générer le CyPet-(pré-SUMO1)-YPet substrat 16. Nous avons distingué et quantifiés absolues des signaux de fluorescence apportées par le donneur et l&#39;accepteur et FRET aux longueurs d&#39;onde d&#39;émission et accepteurs, respectivement. La valeur de k cat / K M a été obtenu comme (3,2 ± 0,55) x 10 7 M -1 s -1 SENP1 vers pré-SUMO1, qui est en accord avec les généraux paramètres cinétiques enzymatiques. Par conséquent, cette méthode est valable et peut être utilisésa approche générale pour caractériser d&#39;autres protéases ainsi.

Une nouvelle méthode qui analyse quantitative de FRET (Förster Resonance Energy Transfer) des signaux est décrite pour l&#39;étude de la cinétique enzymatique.<em&gt; K<sub&gt; M</sub</em&gt; Et<em&gt; K<sub&gt; Cat</sub</em&gt; Ont été obtenus pour l&#39;hydrolyse du domaine catalytique de SENP1 (SUMO / sentrine protéase spécifique 1) de pré-SUMO1 (Small Ubiquitin-comme modificateur). Les principes généraux de cette étude quantitative-FRET à base de protéase cinétique peut être appliquée à d&#39;autres protéases.

Quantitative FRET (transfert de Förster Resonance Energy) Analyse de la protéase SENP1 Kinetics Détermination

Les modifications posttraductionnelles réversibles des protéines par l'ubiquitine ou des protéines de type ubiquitine (Ubl) sont largement utilisées pour réguler dynamiquement les protéines...

Ce vidéo montre un nouvel essai FRET en une seule étape pour l'analyse quantitative de la cinétique des protéases. La stratégie générale de l'essai suivant repose sur l'analyse du signal FRET. Ici, la paire FRET, CYPe et YPe, est fixée aux extrémités N et C de la pré-SUMO1 dans le substrat intact, et CYPe et YPe sont en proximité étroite.Lorsque cette molécule est excitée à 414 nanomètres, la majorité du signal d'émission se situe à 530 nanomètres. Toutefois, lorsque la protéase SENP1 est ajoutée, le substrat est clivé au niveau du Gly-Gly à l'extrémité C-terminale de Sumo1, séparant ainsi CIPA et wpa. Désormais, lorsqu'elle est excitée à 414 nanomètres, la majorité du signal d'émission observé se situe à 475 nanomètres.Pour évaluer la cinétique de cette réaction, les émissions de fluorescence sont mesurées toutes les 15 secondes pendant une période de cinq minutes. L'analyse des données de fluorescence obtenues révèle la vitesse à laquelle le substrat cype pre sumo one ype est digéré par la protéase SENP one. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles qu'un dosage par masse, un test utilisant un substrat peptidique fluorescent ou une analyse radio métrique ou un western blot, est qu'elle permet de déterminer les paramètres cinétiques en temps réel lors d'un dosage en une seule étape et en temps réel.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic des maladies impliquant des protéines, telles que les cancers et les maladies métaboliques. Étant donné que cette technique permet d'obtenir des tests précis et à haut débit pour diverses protéines, ainsi que pour la découverte d'inhibiteurs et la caractérisation de protéines, le protocole démonstratif sera réalisé par un étudiant diplômé d'ENUA de mon laboratoire, qui a été la première personne à développer cette méthode et ce protocole. Commencez ce protocole en amplifiant par PCR les cadres de lecture ouverts de Cype ype pre sumo un, de sumo un mature et du domaine catalytique de SENP un.Cloner les produits obtenus dans un vecteur topo de type PCR. Ensuite, confirmer que les séquences des gènes sont correctes par séquençage. Puis, cloner l'ADNc codant pour CYPE pré-sumo1 YPE CYPE SUMO1 YPE et le domaine catalytique de SENP1 dans le vecteur PET28b, avec une étiquette Polyhis en position N-terminale.Après avoir cloné les gènes dans le vecteur, transformez-les dans Esia coli, BBL 21 DE trois par électroporation. Après avoir ensemencé les bactéries transformées sur milieu solide, sélectionnez des colonies isolées et mettez-les en culture toute la nuit. Ensuite, inoculez des fioles de deux litres de milieu XYT deux avec les bactéries transformées selon un rapport de un à 100.Incuber les cultures pendant trois heures à 37 degrés Celsius, sous agitation à 250 tr/min, afin d'atteindre une densité optique de 0,5 à 600 nanomètres. Pour induire l'expression protéique, ajouter du IPTG à une concentration finale de 100 micromolaire et agiter pendant 16 heures à 25 degrés Celsius à 200 tr/min. Ensuite, transférer les bactéries dans des bouteilles de centrifugeuse de 250 millilitres.Ensuite, récoltez les bactéries par centrifugation à 8 000 ×g à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après la centrifugation, éliminez le surnageant et resuspendez les cellules bactériennes dans un tampon de lyse composé de tris HCl, de chlorure de sodium et d'ole, puis transférez les cultures dans des tubes à centrifuger de 50 millilitres. Soniquez ensuite les cellules à une amplitude de 70 pendant 10 minutes, par intervalles de cinq secondes, afin de rompre les cellules bactériennes.Ensuite, pour séparer les protéines de fusion des débris cellulaires, centrifuger les tubes à 35 000 RCF à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes. Pendant la centrifugation, préparer une colonne BioRad de 10 millilitres avec 500 microlitres de billes au nickel NTI par litre de cellules cultivées. Laisser la solution s'écouler goutte à goutte de la colonne après la centrifugation.Transférez le surnageant dans un nouveau tube conique de 50 millilitres. Versez la solution de surnageant dans la colonne. Une fois que tout le surnageant est entré dans la résine, lavez la colonne deux fois avec 10 millilitres de chlorure de sodium tris hydrochlorure, et émettez un tampon aole.Pour éluer la protéine, ajouter 500 microlitres du même tampon, cette fois contenant 500 millimolaire d'ole. Recueillir l'écoulement dans un tube de microcentrifugeuse.Ensuite, transférez la solution dans un tube de dialyse ayant un seuil de coupure moléculaire de 10 kilodaltons et dialysez l'échantillon toute la nuit dans un litre de tampon contenant 20 millimolaires de tris, 50 millimolaires de chlorure de sodium, HCl et 1 millimolaire de DTT à quatre degrés Celsius. Après dialyse, transférez les protéines purifiées dans un tube de microcentrifugeuse et déterminez les concentrations des protéines purifiées par dosage de Bradford. Ensuite, les protéines purifiées sont utilisées pour évaluer la vitesse à laquelle le pré-SUMO-1 est clivé par SENP1 à l'aide d'un dosage FRET quantitatif.Dans des tubes de microcentrifugeuse, préparez 60 millilitres de Spet Sumo un et de YA à des concentrations de 5100, 200 500, 750 et 1000 nanomolaires. Ces échantillons témoins seront utilisés pour caractériser le rapport constant d'émission directe de cype et de YA dans le même tampon. Préparez cype pre sumo un y PET à 12 concentrations allant de 0,03 micromolaire à 0,9 micromolaire, ainsi qu'une dilution à 0,3 nanomolaire du domaine catalytique de SENP un.Configurer le lecteur de plaque multi-puits à fluorescence pour mesurer l'émission fluorescente à 475 et 530 nanomètres après une excitation à 414 nanomètres, et l'émission à 530 nanomètres après une excitation à 475 nanomètres, par intervalles de 32e pendant deux minutes à 37 degrés Celsius. Pour obtenir la fluorescence naturelle de la plaque, placer une plaque vide de 384 puits dans le fluorimètre et effectuer les mesures. Une fois la fluorescence naturelle de la plaque déterminée, régler les paramètres du fluorimètre de sorte que, pour Cype Sumo, une excitation soit à 414 nanomètres et que les mesures soient prises à 475 et 530 nanomètres, et pour ype, l'excitation soit à 414 et 475 nanomètres et les mesures prises à 530 nanomètres.Ensuite, ajoutez 75 microlitres de cype Sumo one ype ou de cype sumo one ype dans les puits appropriés de la plaque 384 puits en triple exemplaire, comme indiqué sur ce schéma. Puis ajoutez 5 microlitres de la préparation de SENP one à chaque puit, portant ainsi le volume final à 80 microlitres. Placez immédiatement la plaque dans le fluorimètre et commencez les mesures de fluorescence selon le protocole. Analysez les lectures de fluorescence à l’aide de la méthode d’analyse quantitative FRET présentée dans la section suivante.L'idée générale de cette technologie consiste à corréler le signal de transfert absolu avec la digestion. Pour obtenir le signal de transfert absolu, nous devons exclure les contributions directes du donneur et de l'accepteur à l'émission fluorescente totale aux longueurs d'onde d'émission de l'accepteur.Les contributions directes du donneur et de l'accepteur sont calculées à partir des facteurs de coefficients de corrélation alpha et bêta du donneur et des accepteurs, respectivement. Cette section de la vidéo détaille la manière dont les calculs sont effectués. Pour analyser la cinétique de la digestion du substrat par SENP1, utilisez le logiciel GraphPad Prism 5 ; commencez par ouvrir le fichier texte exporté dans Excel après avoir soustrait la fluorescence de fond de la plaque.La concentration du substrat digéré à différents moments est calculée par les formulations PrepU lorsqu'elles sont excitées par une lumière de longueur d'onde de 414 nanomètres ; l'émission totale de fluorescence de spet pre sumo one ype à 530 nanomètres peut être dérivée de trois sources : le signal absolu de transfert d'énergie par résonance de type FRET (Y pets), l'émission de cype, et l'émission directe de wpe. Dans cette équation, FL 530/414 représente l'émission totale de fluorescence à 530 nanomètres lorsqu'elle est excitée à 414 nanomètres, et FL fret correspond au signal absolu de FRET.FL Spet Con est l'émission directe de Spet. Lorsqu'elle est excitée à 414 nanomètres, et FL Ype Con est l'émission directe de Ype. Lorsqu'elle est excitée à 414 nanomètres, l'émission directe de spet à 530 nanomètres est proportionnelle à son émission à 475 nanomètres.Lorsqu'elle est excitée à 414 nanomètres avec un rapport constant d'alpha, l'émission directe de YA à 530 nanomètres sous excitation à 414 nanomètres est proportionnelle à son émission à 530 nanomètres. Lorsqu'elle est excitée à 475 nanomètres avec un rapport constant de bêta lorsque spet pre sumo un ype est digéré par SENP un et excitée à 414 nanomètres. L'émission fluorescente à 530 nanomètres diminue, mais peut encore être divisée en trois parties comme ici.FL Prime cinq 30 barre oblique quatre 14 est l'émission de fluorescence totale à 530 nanomètres après digestion. Lorsqu'elle est excitée à 414 nanomètres, FL Prime fret correspond au signal fret absolu restant et FL prime SPET 4 75 barre oblique quatre 14 est l'émission SPET à 475 nanomètres après digestion, excitée à 414 nanomètres. L'émission provient de deux parties : la cype non digérée, pré-sumo, une ype, et la cype Sumo une digérée.Un FL Y PET cinq 30 barre oblique 4 75 est l'émission de type ype lorsqu'il est excité à 475 nanomètres, ce qui est constant que cype pre sumo un ype soit digéré ou non après digestion par SENP un. L'émission de fret restante est indiquée dans cette équation, où C est la concentration totale de cype. Pre sumo un ype, et X est la concentration de cype. Pre sumo un YA. En combinant tous les éléments, l'émission de fluorescence détectée à 530 nanomètres sous excitation à 414 nanomètres est donnée par cette équation pour le test de protéase basé sur le fret destiné à l'étude cinétique enzymatique, la vitesse de réaction étant corrélée au changement de la quantité de substrat à mesure que la concentration du produit augmente de façon exponentielle à partir de zéro.Lorsque T est égal à zéro, comme indiqué ici, S indice zéro représente la concentration initiale du substrat lorsque T est égal à zéro. La vitesse initiale correspond à la maturation de la pré-SUMO par SENP.On peut le déterminer en surveillant les variations du signal fluorescent à 475 et 530 nanomètres au cours du processus. Comme illustré ici, la vitesse de maturation de la pré-sumo 1 dépendait de la concentration en substrat, ce qui suggère que le domaine catalytique de SENP 1 présente une excellente activité pour la maturation de la pré-sumo 1. Les vitesses initiales de réaction ont été calculées à l’aide de la même analyse effectuée avec différentes concentrations en substrat.Le rapport entre KCAT et KM est généralement utilisé pour comparer les efficacités de différentes enzymes avec un même substrat ou d'une enzyme particulière avec différents substrats. KM et Vmax peuvent être obtenus à partir de l'équation de McKayla Cementin en traçant les différentes vitesses initiales correspondant aux différentes concentrations de cype. La valeur de kcat pour un YA a été obtenue en utilisant cette équation.En fonction de l'analyse ci-dessus, la KM calculée était de 0,21 ± 0,4 micromolaire. La valeur de kcat était de 6,90 ± 0,28 par seconde, et le rapport kcat/KM était de 3,2 ± 0,55 × 10⁷ par molaire. Deuxièmement, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer les paramètres cinétiques de la protéase à l’aide d’un nouvel essai quantitatif basé sur les lipides, en une seule étape et en temps réel, en suivant cette procédure.Une autre méthode, comme l'inhibition du produit ou la caractérisation d'inhibiteurs, peut être réalisée afin de répondre à des questions supplémentaires, telles que la détermination de la KM apparente réelle ou de la constante d'inhibition K. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des protéines pour explorer de manière précise la génétique, ainsi que la compréhension des protéines impliquées dans les processus physiologiques et pathologiques au moyen de capteurs optiques. Diagnostic immédiat et découverte de médicaments.

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