Name: Microgavage de larves de poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Apprenez le microgavage de larves de Danio rerio pour administrer précisément des substances dans l'intestin. Cette technique sûre et contrôlée facilite l'étude du transport intestinal et des effets sur le développement larvaire.

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Nous remercions les membres du laboratoire Rawls pour leurs suggestions utiles sur le contenu, ainsi que le Dr Alan Fanning pour ses discussions précieuses sur la perméabilité en fonction de la taille des jonctions serrées et les méthodes de perturbation. Nous remercions également le Dr Michael Chua et le Dr Neal Kramarcy de la Michael Hooker Microscopy Facility pour leur soutien concernant le microscope confocal. Ce travail a été financé par des subventions des National Institutes of Health : T32 DK007737-15 (boursier J.L.C.), F32 DK094592 (attribuée à J.L.C.) et R01 DK081426 (attribuée à J.F.R.).

<ol><li>Kuhlman, J., Eisen, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screen+for+mutations+affecting+development+and+function+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic screen for mutations affecting development and function of the enteric nervous system.</a> Dev. Dyn. 236, 118-127 (2007).</li>
<li>Pack, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+zebrafish+digestive+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of zebrafish digestive organs.</a> Development. 123, 321-328 (1996).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Dev. Biol. 255, 12-29 (2003).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mech. Dev. 122, 157-173 (2005).</li>
<li>Ng, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Dev. Biol. 286, 114-135 (2005).</li>
<li>Hama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+zebrafish+digestive+organ+function+using+multiple+quenched+fluorescent+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of zebrafish digestive organ function using multiple quenched fluorescent reporters.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 296, 445-453 (2009).</li>
<li>Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+digestive+organ+morphology+and+function+using+differential+fatty+acid+metabolism+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish.</a> Dev. Biol. 360, 276-285 (2011).</li>
<li>Rich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+high-content+model+system+for+studies+of+gastrointestinal+transit%3A+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol+Motil%22%5BJournal%5D)">A new high-content model system for studies of gastrointestinal transit: the zebrafish.</a> Neurogastroenterol Motil. 21, 225-228 (2009).</li>
<li>Bagnat, M., Cheung, I. D., Mostov, K. E., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+single+lumen+formation+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic control of single lumen formation in the zebrafish gut.</a> Nat. Cell Biol. 9, 954-960 (2007).</li>
<li>Bagnat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cse1l+is+a+negative+regulator+of+CFTR-dependent+fluid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cse1l is a negative regulator of CFTR-dependent fluid secretion.</a> Curr. Biol. 20, 1840-1845 (2010).</li>
<li>Shepherd, I., Eisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+zebrafish+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the zebrafish enteric nervous system.</a> Methods Cell Biol. 101, 143-160 (2011).</li>
<li>Brugman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxazolone-induced+enterocolitis+in+zebrafish+depends+on+the+composition+of+the+intestinal+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Oxazolone-induced enterocolitis in zebrafish depends on the composition of the intestinal microbiota.</a> Gastroenterology. 137, 1757-1767 (2009).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammatory+bowel+disease+%28IBD%29+susceptibility+genes+NOD1+and+NOD2+have+conserved+anti-bacterial+roles+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">The inflammatory bowel disease (IBD) susceptibility genes NOD1 and NOD2 have conserved anti-bacterial roles in zebrafish.</a> Dis. Model Mech. 4, 832-841 (2011).</li>
<li>Oehlers, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+enterocolitis+model+in+zebrafish+larvae+that+is+dependent+on+microbiota+and+responsive+to+pharmacological+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">A chemical enterocolitis model in zebrafish larvae that is dependent on microbiota and responsive to pharmacological agents.</a> Dev Dyn. 240, 288-298 (2011).</li>
<li>Faro, A., Boj, S. F., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fishing+for+intestinal+cancer+models%3A+unraveling+gastrointestinal+homeostasis+and+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Fishing for intestinal cancer models: unraveling gastrointestinal homeostasis and tumorigenesis in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 361-376 (2009).</li>
<li>Fleming, A., Jankowski, J., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+gut+function+and+disease+changes+in+a+zebrafish+larvae+model+of+inflammatory+bowel+disease%3A+a+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of gut function and disease changes in a zebrafish larvae model of inflammatory bowel disease: a feasibility study.</a> Inflamm. Bowel Dis. 16, 1162-1172 (2010).</li>
<li>Kanther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+colonization+induces+dynamic+temporal+and+spatial+patterns+of+NF-kappaB+activation+in+the+zebrafish+digestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Microbial colonization induces dynamic temporal and spatial patterns of NF-kappaB activation in the zebrafish digestive tract.</a> Gastroenterology. , (2011).</li>
<li>Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gnotobiotic+zebrafish+reveal+evolutionarily+conserved+responses+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4596-4601 (2004).</li>
<li>Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Goodman, A. L., Trent, C. M., Gordon, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+and+genetic+analysis+link+bacterial+motility+and+symbiosis+in+the+zebrafish+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging and genetic analysis link bacterial motility and symbiosis in the zebrafish gut.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7622-7627 (2007).</li>
<li>Kanther, M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-microbe+interactions+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Host-microbe interactions in the developing zebrafish.</a> Curr. Opin. Immunol. 22, 10-19 (2010).</li>
<li>Bates, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+signals+from+the+microbiota+promote+different+aspects+of+zebrafish+gut+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation.</a> Dev. Biol. 297, 374-386 (2006).</li>
<li>Cheesman, S. E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+know+you+are+in+there%3A+conversing+with+the+indigenous+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Microbiol%22%5BJournal%5D)">We know you are in there: conversing with the indigenous gut microbiota.</a> Res Microbiol. 158, 2-9 (2007).</li>
<li>Bates, J. M., Akerlund, J., Mittge, E., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase+detoxifies+lipopolysaccharide+and+prevents+inflammation+in+zebrafish+in+response+to+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota.</a> Cell Host Microbe. 2, 371-382 (2007).</li>
<li>Camp, J. G., Jazwa, A. L., Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+cis-regulatory+modules+mediate+tissue-specific+and+microbial+control+of+angptl4%2Ffiaf+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Intronic cis-regulatory modules mediate tissue-specific and microbial control of angptl4/fiaf transcription.</a> PLoS Genetics. , In Press (2012).</li>
<li>Cheesman, S. E., Neal, J. T., Mittge, E., Seredick, B. M., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+cell+proliferation+in+the+developing+zebrafish+intestine+is+regulated+by+the+Wnt+pathway+and+microbial+signaling+via+Myd88%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Epithelial cell proliferation in the developing zebrafish intestine is regulated by the Wnt pathway and microbial signaling via Myd88.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4570-4577 (2011).</li>
<li>Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gastrointestinal+physiology+using+a+novel+intestinal+transit+assay+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogastroenterol.+Motil%22%5BJournal%5D)">Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish.</a> Neurogastroenterol. Motil. 21, 304-312 (2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , 4 edn, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+generating+and+colonizing+gnotobiotic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish.</a> Nat. Protoc. 3, 1862-1875 (2008).</li>
<li>Shen, L., Weber, C. R., Raleigh, D. R., Yu, D., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+pore+and+leak+pathways%3A+a+dynamic+duo%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tight junction pore and leak pathways: a dynamic duo.</a> Annu. Rev. Physiol. 73, 283-309 (2011).</li>
<li>Van Itallie, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+density+of+small+tight+junction+pores+varies+among+cell+types+and+is+increased+by+expression+of+claudin-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">The density of small tight junction pores varies among cell types and is increased by expression of claudin-2.</a> J. Cell. Sci. 121, 298-305 (2008).</li>
<li>Van Itallie, C. M., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+size-dependent+permeability+of+the+tight+junction+using+PEG+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Measuring size-dependent permeability of the tight junction using PEG profiling.</a> Methods Mol. Biol. 762, 1-11 (2011).</li>
<li>Watson, C. J., Rowland, M., Warhurst, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+modeling+of+tight+junctions+in+intestinal+cell+monolayers+using+polyethylene+glycol+oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional modeling of tight junctions in intestinal cell monolayers using polyethylene glycol oligomers.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 281, 388-397 (2001).</li>
<li>Rodgers, L. S., Fanning, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+epithelial+permeability+by+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Regulation of epithelial permeability by the actin cytoskeleton.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 68, 653-660 (2011).</li>
<li>Gonzalez-Mariscal, L., Chavez de Ramirez, B., Cereijido, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+formation+in+cultured+epithelial+cells+%28MDCK%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Tight junction formation in cultured epithelial cells (MDCK).</a> J. Membr. Biol. 86, 113-125 (1985).</li>
<li>Palant, C. E., Duffey, M. E., Mookerjee, B. K., Ho, S., Bentzel, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B+regulation+of+tight-junction+permeability+and+structure+in+Necturus+gallbladder%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ca2+ regulation of tight-junction permeability and structure in Necturus gallbladder.</a> Am. J. Physiol. 245, C203-C212 (1983).</li>
<li>Holmberg, A., Schwerte, T., Pelster, B., Holmgren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+the+gut+motility+control+system+in+zebrafish+Danio+rerio+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of the gut motility control system in zebrafish Danio rerio embryos and larvae.</a> J. Exp. Biol. 207, 4085-4094 (2004).</li>
<li>Rich, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit-like+immunoreactivity+in+the+zebrafish+gastrointestinal+tract+reveals+putative%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Kit-like immunoreactivity in the zebrafish gastrointestinal tract reveals putative.</a> 236, 903-911 (2007).</li>
<li>Holmberg, A., Olsson, C., Hennig, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+and+TTX-insensitive+control+of+spontaneous+gut+motility+in+the+developing+zebrafish+%28Danio+rerio%29+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive and TTX-insensitive control of spontaneous gut motility in the developing zebrafish (Danio rerio) larvae.</a> J. Exp. Biol. 210, 1084-1091 (2007).</li>
<li>Hennig, G. W., Costa, M., Chen, B. N., Brookes, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+peristalsis+in+the+guinea-pig+small+intestine+using+spatio-temporal+maps%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of peristalsis in the guinea-pig small intestine using spatio-temporal maps.</a> J. Physiol. 517 (Pt 2), 575-590 (1999).</li>
<li>Flynn, E. J. 3rd, Trent, C. M., Rawls, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+nutritional+control+of+adipogenesis+in+zebrafish+%28Danio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and nutritional control of adipogenesis in zebrafish (Danio rerio.</a> J. Lipid Res. 50, 1641-1652 (2009).</li>
<li>Clifton, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+inhibitors+of+dietary+lipid+absorption+using+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification of novel inhibitors of dietary lipid absorption using zebrafish.</a> PLoS One. 5, e12386(2010).</li>
<li>Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+analyses+of+vascular+tube+and+lumen+formation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish.</a> Development. 132, 5199-5209 (2005).</li>
<li>Berghmans, S., Hunt, J., Roach, A., Goldsmith, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+offer+the+potential+for+a+primary+screen+to+identify+a+wide+variety+of+potential+anticonvulsants%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsy+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish offer the potential for a primary screen to identify a wide variety of potential anticonvulsants.</a> Epilepsy Res. 75, 18-28 (2007).</li>
</ol>

Aucun conflit d'intérêts déclaré.

Dans ce travail, nous décrivons un nouveau protocole permettant l'administration directe de substances dans l'intestin de larves de poisson zèbre par microgavage. Plusieurs étapes critiques doivent être prises en compte tout au long de la procédure. Premièrement, les larves de poisson zèbre doivent être en bonne santé avant l'expérience de gavage afin d'éviter des décès non liés au traitement. Un autre facteur important est la qualité de l'aiguille de gavage. L'une des parties les plus délicates du protocole consiste à c...

<table><tbody><tr><td>Finquel (méthanesulfonate de tricaine)</td><td>Argent Chemical Laboratories</td><td>MS-222</td><td>Anesthésie des larves</td></tr><tr><td>Solution de rouge de phénol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290-100 ml</td><td>0,5 % dans DPBS, testé pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Huile minérale, claire, blanche (haute pureté)</td><td>Amresco</td><td>J217-500 ml</td><td>Pour le remplissage arrière des aiguilles et les tests de volume</td></tr><tr><td>Dextran marqué avec le Texas Red, poids moléculaire 10 000, fixable par la lysine</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>D-1863</td><td>Suspension à 1 % dans du PBS 1x/rouge de phénol</td></tr><tr><td>FM4-64FX</td><td>Invitrogen/ Molecular Probes</td><td>F34653</td><td>Solution mère à 5 mM dans l’eau</td></tr><tr><td>Méthylcellulose</td><td>MP Biochemicals</td><td>0215549590</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre borosilicaté</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td>Diamètre extérieur 1,14 mm, diamètre intérieur 0,53 mm, longueur 3,5 pouces</td></tr><tr><td>Embout en plastique pour la fabrication de moules</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Unité de micro-injection Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Tire-lames Flaming Brown, filament large de 3,0 mm</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97, FT330B</td><td>Préparation des aiguilles</td></tr><tr><td>Pince Dumont n°5 pour étudiants</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>0,1 x 0,06 mm, pour couper les aiguilles</td></tr><tr><td>Graticule oculaire, 5 mm - 100 divisions</td><td>Leica</td><td>10394771</td><td>Pour couper les aiguilles</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Coupe des aiguilles et polissage à la flamme</td></tr><tr><td>Aiguille pour seringue Tuberculin SlipTip</td><td>Becton Dickinson</td><td>309626</td><td>1 ml, aiguille 25G 5/8</td></tr><tr><td>Microsphères Fluoresbrite YG (2,0 &amp;mu;m)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18338</td><td>Analyse de la motilité intestinale</td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td>Procédure de gavage</td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique à fluorescence</td><td>Leica</td><td>M205C</td><td>Essai de barrière au dextran</td></tr><tr><td>Microscope confocal</td><td>Zeiss</td><td>LSM510</td><td>Imagerie du dextran en circulation</td></tr></tbody></table>

microgavage de larves de poisson zèbre

Microgavage of Zebrafish Larvae

Le poisson zèbre s'est imposé comme un organisme modèle puissant pour l'étude du développement intestinal1-5, de la physiologie6-11, des maladies12-16 et des interactions hôte-microbe17-25. Les approches expérimentales destinées à étudier la biologie intestinale nécessitent souvent l'introduction in vivo de matériaux sélectionnés dans la lumière de l'intestin. Dans le modèle du poisson zèbre larvaire, cela est généralement réalisé en plongeant les poissons dans une solution contenant le matériau choisi, ou par injection à travers la paroi abdominale. Lorsqu'on utilise la méthode d'immersion, il est difficile de surveiller ou de contrôler précisément la voie ou le moment de l'administration du matériau dans l'intestin. Pour cette raison, l'exposition par immersion peut provoquer une toxicité non voulue et d'autres effets sur les tissus extraintestinaux, limitant ainsi la gamme possible de quantités de matériau pouvant être délivrées dans l'intestin. De plus, la quantité de matériau ingérée pendant l'exposition par immersion peut varier considérablement d'une larve à l'autre26. Bien que ces problèmes ne se posent pas lors d'une injection directe à travers la paroi abdominale, cette technique est délicate à réaliser et provoque des lésions tissulaires pouvant influencer les résultats expérimentaux. Nous présentons ici une méthode de microsondage chez les larves de poisson zèbre. L'objectif de cette méthode est de proposer un moyen sûr, efficace et reproductible de délivrer un matériau directement dans la lumière de l'intestin antérieur des larves de poisson zèbre, avec un contrôle précis du moment d'administration. Le microsondage utilise du matériel standard d'injection microscopique d'embryons et de stéréomicroscopie, couramment disponible dans la plupart des laboratoires travaillant sur le poisson zèbre. Une fois les poissons correctement positionnés dans la méthylcellulose, le sondage peut être effectué rapidement, à un rythme d'environ 7 à 10 poissons par minute, et le taux de survie après le sondage approche 100 %, selon la nature du matériau administré. Nous montrons également que le microsondage permet de charger la lumière intestinale avec des concentrations élevées de substances qui seraient létales pour les poissons en cas d'exposition par immersion. Afin d'illustrer l'utilité de cette méthode, nous décrivons un test de microsondage avec un dextran fluorescent, utilisable pour quantifier le passage du matériau depuis la lumière intestinale vers les espaces extraintestinaux. Ce test permet de vérifier l'exécution correcte de la procédure de microsondage, et fournit également un nouvel essai chez le poisson zèbre pour évaluer l'intégrité de la barrière épithéliale intestinale dans différentes conditions expérimentales (par exemple : manipulation génétique, traitement médicamenteux ou exposition à des facteurs environnementaux). En outre, nous montrons comment le sondage peut être utilisé pour évaluer la motilité intestinale en administrant des microsphères fluorescentes et en suivant leur transit ultérieur. Le microsondage peut être utilisé pour délivrer divers matériaux tels que des micro-organismes vivants, des facteurs ou toxines microbiens sécrétés, des agents pharmacologiques et des sondes physiologiques. Grâce à ces capacités, la méthode de microsondage chez les larves de poisson zèbre a le potentiel d'améliorer un large éventail de domaines de recherche utilisant ce système modèle.

Lorsque la gavage est effectuée correctement, le matériel administré doit être entièrement contenu dans l'intestin antérieur, avec peu ou pas de résidu dans l'œsophage (Figure 3). Le volume administré doit être choisi de manière à pouvoir être contenu dans la bulle antérieure sans s'écouler par la cloaque ou l'œsophage. Si le volume de matériel ou la pression d'administration est trop élevé, la force physique du gavage peut endommager l'épithélium ou provoquer des fuites à travers celui-ci. Cela peut éga...

Nous présentons une nouvelle méthode de gavage microscopique de larves de poisson-zèbre utilisant du matériel standard d'injection microscopique d'embryons et de microscopie stéréo. Nous démontrons que le gavage microscopique est une technique sûre et efficace, utile pour délivrer des quantités contrôlées de divers matériaux directement dans la lumière intestinale des larves de poisson-zèbre.

Microgavage de larves de poisson zèbre

Le poisson-zèbre s'est imposé comme un organisme modèle puissant pour étudier le développement intestinal1-5, la physiologie6-11, les pathologies12-16 et les interactions hôte-microbe ...

L'objectif général de cette procédure est d'administrer par voie orale des substances dans la lumière intestinale de larves de poisson zèbre. Tout d'abord, les larves sont anesthésiées et placées sur un moule d'injection recouvert de méthylcellulose. Ensuite, les larves sont doucement immergées dans le moule et alignées selon l'angle de l'aiguille de gavage et du micromanipulateur.L'aiguille est ensuite insérée dans la bouche de la larve et dirigée vers la vésicule intestinale. Une fois en place, le matériel est libéré dans la lumière. La dernière étape consiste à extraire la larve de la méthylcellulose et à la placer dans un milieu frais pour qu'elle se remette de l'anesthésie.En fin de compte, cette méthode peut être utilisée pour délivrer des matériaux spécifiquement dans la lumière intestinale de larves de zebrafish, où le transport au sein de l'intestin ou dans les tissus extraintestinaux peut être étudié. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l'immersion dans de l'eau contenant le matériau d'intérêt, est que la quantité de matériau délivrée à l'animal, ainsi que le moment et la dose, peuvent être rigoureusement contrôlés. Cela réduit la variabilité expérimentale et, dans certains cas, la toxicité associée à certains matériaux.L'idée de cette méthode nous est d'abord venue lorsque nous avons eu des difficultés à appliquer certaines sondes fluorescentes à des concentrations suffisamment élevées pour être détectables dans l'épithélium intestinal par microscopie. De hautes concentrations peuvent parfois tuer les poissons sans toutefois produire un signal fluorescent suffisant pour l'imagerie. Pour commencer, tirez plusieurs aiguilles de gavage à l'aide d'un tireur de micropipettes et empruntez des capillaires en verre de silice.Passez à un microscope stéréo pour couper les aiguilles. Commencez par aligner la pointe de l'aiguille avec l'extrémité d'une règle transparente ou d'un graphique. Une fois l'alignement effectué, utilisez une pince de précision de bijoutier pour couper l'aiguille à environ un millimètre de la pointe.Examinez la pointe de l'aiguille à un grossissement de 100 fois. Le diamètre de l'aiguille doit être compris entre 27 et 30 micromètres et doit être émoussée. Évitez les aiguilles pointues ou irrégulières pour des résultats plus reproductibles.Une micro-lampe à souder peut être utilisée pour mieux contrôler le point de coupe de l'aiguille et pour polir celle-ci à la flamme. Conseils pour éliminer les bords tranchants. Ensuite, préparez la solution de gavage.Pour la plupart des applications, le rouge de phénol est ajouté afin de faciliter la visualisation du micro-injecteur et le positionnement de la solution d'administration par gavage. Après remplissage avec de l'huile minérale, fixez l'aiguille de gavage sur l'unité de microinjection Nano Jet Two. Enveloppez une boîte de Pétri en plastique de 10 centimètres avec du film biologique afin de fournir une surface plane et étanche, puis déposez environ deux microlitres de la solution de gavage sur le film parafilm.L'étape suivante consiste à remplir manuellement l'aiguille d'administration par voie oesophagienne. Veillez à ne pas introduire de bulles d'air dans l'huile minérale. Pour étalonner le volume d'éjection, injectez de petites gouttelettes dans une petite boîte de Pétri remplie d'huile minérale jusqu'à ce qu'elles soient de taille constante, mesurez le diamètre des gouttelettes à l'aide de l'outil graphique et calculez le volume des gouttelettes.La cohérence entre les aiguilles est représentée ici. Avant d'utiliser l'aiguille pour la gavage, éliminer tout excès d'huile minérale en rinçant avec du milieu propre pour poissons zèbres. Après avoir réchauffé le moule aros, recouvrir trois rainures avec de la méthylcellulose à 3 %. La rainure doit être recouverte suffisamment pour maintenir le poisson en place, mais pas si peu que la méthylcellulose s'assèche rapidement.Ensuite, aliquoter environ quatre millilitres de milieu pour zebrafish dans les puits d'une plaque à six puits et transférer les larves de zebrafish de chaque groupe expérimental dans des puits séparés. Pour anesthésier les poissons, préparer une solution de trica à trois fois dans le milieu approprié pour zebrafish. Une fois par puits.Anesthésiez le poisson en mélangeant un volume égal de solution trica au milieu et en agitant doucement. Dès que les poissons cessent de bouger, utilisez une pipette Pasteur en verre borg large pour les placer un par un sur la méthylcellulose, la tête orientée vers l'angle de 45 degrés de la rainure et la queue dirigée vers l'angle de 90 degrés de la rainure. Utilisez une sonde de dissection émoussée pour appuyer doucement chaque larve dans la méthylcellulose afin d'en stabiliser la position.Ensuite, ajustez le dispositif de microinjection NanoJet de manière à ce que l'aiguille soit inclinée selon un angle faible. Assurez-vous que la course permettra d'atteindre facilement le fond du puits. Pour minimiser les ajustements ultérieurs, réglez l'unité de microinjection sur une libération de 4,6 nanolitres à l'aide du réglage « inject lent » ; placez une main pour effectuer de légers ajustements sur la plaque contenant les larves immobilisées et l'autre pour contrôler le micromanipulateur de l'unité de microinjection.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés car les poissons zèbres sont très petits et facilement endommagés. Il faut de la pratique pour identifier la structure de l'œsophage sous le microscope stéréo et pour déterminer la pression appropriée à appliquer sur l'aiguille de gavage afin d'atteindre la lumière intestinale. Commencez par introduire délicatement l'aiguille de gavage dans la bouche d'un poisson anesthésié.Faire passer le dispositif à travers l’œsophage et appuyer légèrement sur le sphincter œsophagien pour introduire la pointe juste à l’intérieur de la paroi intestinale antérieure. Une fois à l’intérieur du bulbe antérieur, administrer doucement le matériel selon ces paramètres. Le volume délivré doit juste remplir le bulbe antérieur de l’intestin sans s’échapper par l’œsophage ou le cloaque.Retirer rapidement et doucement l'aiguille. Veiller à ne pas libérer de quantités importantes de produit dans l'œsophage. Après avoir retiré l'aiguille de gavage, transférer le poisson dans une boîte contenant du milieu frais.Revivez les larves après l'anesthésie et éliminez la méthylcellulose en les rinçant plusieurs fois dans un milieu frais. Transférez les larves dans une boîte de Pétri ou une plaque à six puits jusqu'à leur utilisation. Pour les analyses ultérieures, une micro-gavage peut être utilisée pour introduire divers matériaux dans le poisson-zèbre en test.Pour commencer, préparez les solutions de gavage nécessaires afin de démontrer cette méthode. Le dextran de 10 kD conjugué au Texas Red est utilisé pour analyser l'intégrité de la barrière de l'épithélium intestinal.Suivre les étapes démontrées précédemment pour administrer par gavage des groupes de 10 à 20 larves de poisson zèbre pour chaque condition expérimentale. Répéter cette procédure sur des groupes dupliqués ou tripliqués si possible. Après le gavage, sortir les larves de l'anesthésie et leur permettre de nager librement dans un milieu frais.Après environ 20 minutes, réanesthésiez les larves comme indiqué précédemment. Une fois anesthésiées, placez les larves dans de la méthylcellulose à 3 % sur un bloc d'agarose à 3 %, puis observez les larves au microscope stéréofluorescent muni d'un filtre Texas red. Choisissez un grossissement permettant d'afficher les larves depuis le museau jusqu'immédiatement en arrière de l'extrémité du cloaque. La fluorescence doit être intense dans la lumière intestinale.Cependant, la fonction barrière est évaluée par le niveau de dextran qui apparaît dans les tissus extra-intestinaux, en ajustant l'exposition pour permettre la visualisation de la fluorescence du tronc. Même si cela surexpose la fluorescence luminale lorsqu'il est administré seul, le dextran est retenu à l'intérieur de la lumière de l'intestin. Toutefois, chez les larves co-incubées avec l'EDTA, qui perturbe les jonctions serrées épithéliales, le dextran est observé en circulation ainsi que dans les vaisseaux et espaces antisémites.Dans ces exemples, ImageJ a été utilisé pour quantifier la fluorescence moyenne relative dans une région d'intérêt située dans le tronc du poisson zèbre, puis normalisée par rapport à une région d'intérêt située à l'extérieur du poisson, servant de témoin interne. Ici, les résultats obtenus avec une aiguille standard sont comparés à ceux obtenus avec une aiguille micro forge. Moins de larves dans le groupe traité uniquement avec de la dextrine présentaient une fluorescence extra-intestinale, suggérant que les aiguilles micro forge endommagent moins fréquemment les larves.En examinant plus attentivement une région, on constate que le dextran est à nouveau confiné à la lumière intestinale, sans fuite vers la vascularisation ou les espaces extra-intestinaux. En l'absence de EDTA, lorsqu'on l'administre conjointement avec du dextran marqué au EDTA, celui-ci est observé dans les espaces extra-intestinaux ainsi que dans la lumière de l'aorte dorsale et de la veine cardinale postérieure ; le signal sanguin observé ici est dû à l'écoulement du sang. Lors de la réalisation de cette procédure, veillez à ce que l'aiguille ne présente pas de bords irréguliers, que les poissons soient bien positionnés et maintenus fermement dans la méthylcellulose, et soyez prudent et patient lors de l'apprentissage du maniement de l'aiguille à travers l'œsophage de la larve.Cette technique peut être utilisée dans un large éventail d'applications chez le poisson zèbre nécessitant une introduction ou une visualisation contrôlées de substances au sein de l'intestin. Elle permet un contrôle rigoureux du moment, du trajet et de la dose d'administration chez l'animal, et réduit considérablement la variabilité au sein d'une expérience et entre les expériences.

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