Name: Capture dsélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de lADN génomique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Découvrez la capture sélective de la 5-hydroxyméthylcytosine à partir d'ADN génomique. Cette méthode utilise la β-glucosyltransférase et la chimie click pour un enrichissement efficace et indépendant de la densité.

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Cette étude a été financée en partie par le National Institutes of Health (GM071440 au CH et NS051630/MH076090/MH078972 à PJ).

1. La fragmentation ADN génomique Fragment d&#39;ADN génomique en utilisant sonication à une gamme de taille souhaitée adapté à la plate-forme de séquençage du génome entier. (En général, nous soniquer à ~ 300 pb.) Vérifier la distribution de la taille de l&#39;ADN génomique fragmenté sur gel d&#39;agarose 1% (Figure 1). 2. Préparation de l&#39;ADN Déterminer les quantités d&#39;ADN à partir basées sur l&#39;abondance de la 5-HMC dans l&#39;ADN génomique. Depuis le 5-HMC niveaux varient considérablement dans différents types de tissus, des quantités d&#39;ADN à partir dépendre des niveaux de 5-HMC des échantillons. S&#39;il vous plaît se référer au tableau 1 pour des exemples. 3. β-GT réaction catalysée (Réaction de transfert de glucose) <ol><li> Mélanger à la pipette le mélange comme indiqué dans le tableau 2 et incuber dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau pendant 1 heure. </li><li> Après incubation, nettoyer la réaction avec QIAquick suppression de nucléotides, utilisant 10 pg d&#39;ADN parcolonne. Éluer avec 30 pl d&#39;eau par colonne et se combinent. </li></ol> 4. La réaction de biotinylation (Cliquez Chimie) <ol><li> Ajouter DBCO-SS-biotine conjugué Peg3-solution de travail (1 mM) dans la solution d&#39;ADN élué (à partir de l&#39;étape 3) à une concentration finale de 150 uM (soit 5 ul de solution de travail pour 30 solution d&#39;ADN ul). </li><li> Mélanger à la pipette et incuber dans un bain à 37 ° C de l&#39;eau pendant 2 heures. </li><li> Nettoyer la réaction avec QIAquick suppression de nucléotides. Le volume d&#39;élution idéal totale est de 100 ul. </li><li> Quantifier la quantité d&#39;ADN récupéré à l&#39;aide spectrophotomètre échelle du microlitre (p. ex., NanoDrop). </li></ol> 5. La capture de 5-HMC ADN contenant <ol><li> Lavez 50 pi de Dynabeads MyOne C1 streptavidine 3 fois avec 1 ml de B &amp; W 1X tampon conformément aux instructions du fabricant. Séparer les billes avec un support magnétique. </li><li> Ajouter un volume égal de tampon 2X B &amp; W pour le récupéré D biotinyléNA (100 ul) pour les billes lavées. </li><li> Incuber pendant 15 min à température ambiante avec une légère rotation sur un rotateur. </li><li> Séparer les billes avec un support magnétique et laver les billes 3 fois avec 1 ml de tampon 1X B &amp; W. </li><li> Éluer l&#39;ADN par incubation des billes dans 100 ul de fraîchement préparée DTT 50 mM pendant 2 h à température ambiante avec une légère rotation sur un rotateur. </li><li> Séparer les billes avec un support magnétique. Aspirer l&#39;éluant et la charge sur un Micro Bio-Spin 6 Colonne selon les instructions de fabrication pour enlever la TNT. L&#39;ADN cible est présent dans la solution. </li><li> Purifier l&#39;ADN élue de l&#39;étape précédente par Qiagen PCR Purification Kit MinElute et éluer l&#39;ADN dans 10 pl de tampon EB. Quantifier l&#39;ADN en utilisant fluorimètre qubit, ou NanoDrop si la concentration est supérieure à 20 ng / ul. L&#39;ADN est prêt pour aval du génome entier de préparation bibliothèque séquençage. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Si le joint de la qualitéf ADN génomique est élevée, les rendements de récupération typiques après la β-GT et les réactions sont biotinylation ~ 60-70%. Cependant, l&#39;efficacité de captage varient considérablement en fonction des types de tissus différents en fonction des niveaux de 5-HMC des échantillons. En règle générale, l&#39;efficacité de captage de l&#39;ADN génomique du cerveau est d&#39;environ 4-9%, et dans certains cas extrêmes, le rendement peut atteindre jusqu&#39;à 12%. Pour les cellules ES, l&#39;efficacité de captage moyenne est d&#39;environ 2-4%, contrairement à ~ 0,5% pour les cellules souches neurales. La faible efficacité vu jusque là est pour l&#39;ADN génomique à partir de cellules cancéreuses. Tout l&#39;ADN enrichi est prêt pour la prochaine génération de standards protocoles de préparation de la bibliothèque. En outre, l&#39;ADN capturée peut également être utilisé comme matrice pour la PCR en temps réel pour détecter l&#39;enrichissement de quelques fragments d&#39;ADN par rapport à l&#39;entrée, si les amorces liées sont disponibles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4441/4441fig1.jpg" /> Figure 1. Soniquées homme fragments d&#39;ADN génomique dans1% gel d&#39;agarose. 10 pg d&#39;ADN génomique isolé à partir de cellules iPS humaines dans 120 ul de tampon TE 1X a été soniquée à l&#39;aide d&#39;un dispositif de sonication (Covaris). Après sonication, 2 pl de l&#39;ADN soniqué a été chargé sur un gel d&#39;agarose 1% en utilisant 100 pb de l&#39;ADN marqueur pour comparer les tailles des fragments d&#39;ADN soniqué. <table border="1"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> Eau </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de 10 X Réaction β-GT </td><td> 2 pl </td><td> X 1 </td></tr><tr><td> Jusqu&#39;à 10 mg d&#39;ADN génomique </td><td> _ Pl </td><td> Jusqu&#39;à 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-Glc (3 mM) </td><td> 0,67 ul </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 1 pl </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 20 pi </td&gt; <td></td></tr></tbody></table> i) Pour l&#39;ADN génomique des tissus (haute teneur en 5-HMC&gt; 0,1%) <table border="1"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> Eau </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de 10 X Réaction β-GT </td><td> 10 pl </td><td> X 1 </td></tr><tr><td> Jusqu&#39;à 20 mg d&#39;ADN génomique </td><td> _ Pl </td><td> Jusqu&#39;à 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> Ul 1,33 </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 2 pl </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 40 pi </td><td></td></tr></tbody></table> ii) Pour l&#39;ADN génomique de cellules souches (médiane 5-HMC contenu ~ 0,05%) <table border="1"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Volume </td><td> Concentration finale </td></tr><tr><td> Eau </td><td> _ Pl </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de 10 X Réaction β-GT </td><td> 10 pl </td><td> X 1 </td></tr><tr><td> Jusqu&#39;à 50 mg d&#39;ADN génomique </td><td> _ Pl </td><td> Jusqu&#39;à 500 ng / pl </td></tr><tr><td> UDP-6-N3-Glc (3 mM) </td><td> 3,33 ul </td><td> 100 pM </td></tr><tr><td> β-GT (40 uM) </td><td> 5 pl </td><td> 2 uM </td></tr><tr><td> Le volume total </td><td> 100 pi </td><td></td></tr></tbody></table> iii) Pour l&#39;ADN génomique des cellules cancéreuses (faible teneur en 5-HMC ~ 0,01%) Tableau 1. Exemples de quantités d&#39;ADN d&#39;entrée et de réactions de marquage utilisant des échantillons avec différents niveaux de 5-HMC par la méthode de marquage chimique sélective. <table border="1"><tbody><tr><td> Échantillon </td><td> 5-HMC niveau </strong&gt; </td><td> ADN de départ (pg) </td><td> La récupération après l&#39;étiquetage (entrée à billes) (pg) </td><td> Rendement de récupération </td><td> Pull-down ADN (ng) </td><td> Pull-down rendement </td></tr><tr><td> Cervelet de souris adulte </td><td> 0,4% </td><td> 10 </td><td> 7,5 </td><td> 75% </td><td> 236 </td><td> 3,1% </td></tr><tr><td> Postnatal du cervelet de souris 7 jours </td><td> 0,1% </td><td> 11 </td><td> 9 </td><td> 82% </td><td> 140 </td><td> 1,6% </td></tr><tr><td> Souris cellules ES E14 </td><td> 0,05% </td><td> 60 </td><td> 42 </td><td> 70% </td><td> 350 </td><td> 0,8% </td></tr></tbody></table> Tableau 2. Résultats représentatifs à partir de tissus de cerveau de souris et des cellules ES.

<ol><li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+gene+expression%3A+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. Genet. , Suppl 33. 245-254 (2003).</li>
<li>Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tet+proteins+in+5mC+to+5hmC+conversion%2C+ES-cell+self-renewal+and+inner+cell+mass+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of Tet proteins in 5mC to 5hmC conversion, ES-cell self-renewal and inner cell mass specification.</a> Nature. 466, 1129-1133 (2010).</li>
<li>Tahiliani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+5-methylcytosine+to+5-hydroxymethylcytosine+in+mammalian+DNA+by+MLL+partner+TET1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1.</a> Science. 324, 930-935 (2009).</li>
<li>Kriaucionis, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+DNA+base+5-hydroxymethylcytosine+is+present+in+Purkinje+neurons+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The nuclear DNA base 5-hydroxymethylcytosine is present in Purkinje neurons and the brain.</a> Science. 324, 929-930 (2009).</li>
<li>Ko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+hydroxylation+of+5-methylcytosine+in+myeloid+cancers+with+mutant+TET2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2.</a> Nature. 468, 839-843 (2010).</li>
<li>Koh, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+and+tet2+regulate+5-hydroxymethylcytosine+production+and+cell+lineage+specification+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 and tet2 regulate 5-hydroxymethylcytosine production and cell lineage specification in mouse embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8, 200-213 (2011).</li>
<li>Iqbal, K., Jin, S. G., Pfeifer, G. P., Szabo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+the+paternal+genome+upon+fertilization+involves+genome-wide+oxidation+of+5-methylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of the paternal genome upon fertilization involves genome-wide oxidation of 5-methylcytosine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 3642-3647 (2011).</li>
<li>Wossidlo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nat. Commun. 2, 241(2011).</li>
<li>Gu, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+Tet3+DNA+dioxygenase+in+epigenetic+reprogramming+by+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of Tet3 DNA dioxygenase in epigenetic reprogramming by oocytes.</a> Nature. 477, 606-610 (2011).</li>
<li>Dawlaty, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet1+is+dispensable+for+maintaining+pluripotency+and+its+loss+is+compatible+with+embryonic+and+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet1 is dispensable for maintaining pluripotency and its loss is compatible with embryonic and postnatal development.</a> Cell Stem Cell. 9, 166-175 (2011).</li>
<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+behaviour+of+5-hydroxymethylcytosine+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The behaviour of 5-hydroxymethylcytosine in bisulfite sequencing.</a> PLoS One. 5, e8888(2010).</li>
<li>Song, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+labeling+reveals+the+genome-wide+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selective chemical labeling reveals the genome-wide distribution of 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nat. Biotechnol. 29, 68-72 (2011).</li>
<li>Pastor, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+mapping+of+5-hydroxymethylcytosine+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine in embryonic stem cells.</a> Nature. 473, 394-397 (2011).</li>
<li>Matarese, F., Pau, C. arrillo-deS. anta, E,, Stunnenberg, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Hydroxymethylcytosine%3A+a+new+kid+on+the+epigenetic+block%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">5-Hydroxymethylcytosine: a new kid on the epigenetic block.</a> Mol. Syst. Biol. 7, 562(2011).</li>
<li>Szwagierczak, A., Bultmann, S., Schmidt, C. S., Spada, F., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+enzymatic+quantification+of+5-hydroxymethylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sensitive enzymatic quantification of 5-hydroxymethylcytosine in genomic DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38, 181(2010).</li>
<li>Terragni, J., Bitinaite, J., Zheng, Y., Pradhan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+recombinant+%CE%B2-glucosyltransferase+and+analysis+of+global+5-hydroxymethylcytosine+in+unique+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of recombinant β-glucosyltransferase and analysis of global 5-hydroxymethylcytosine in unique genomes.</a> Biochemistry. , (2012).</li>
<li>Rusmintratip, V., Sowers, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpectedly+high+excision+capacity+for+mispaired+5-hydroxymethyluracil+in+human+cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An unexpectedly high excision capacity for mispaired 5-hydroxymethyluracil in human cell extracts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14183-14187 (2000).</li>
<li>Globisch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+distribution+of+5-hydroxymethylcytosine+and+search+for+active+demethylation+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tissue distribution of 5-hydroxymethylcytosine and search for active demethylation intermediates.</a> PLoS One. 5, e15367(2010).</li>
<li>Yildirim, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mbd3%2FNURD+Complex+Regulates+Expression+of+5-Hydroxymethylcytosine+Marked+Genes+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mbd3/NURD Complex Regulates Expression of 5-Hydroxymethylcytosine Marked Genes in Embryonic Stem Cells.</a> Cell. 147, 1498-1510 (2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+5-hydroxymethylcytosine+into+the+epigenomic+landscape+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating 5-hydroxymethylcytosine into the epigenomic landscape of human embryonic stem cells.</a> PLoS Genet. 7, e1002154(2011).</li>
<li>Szulwach, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-hmC-mediated+epigenetic+dynamics+during+postnatal+neurodevelopment+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">5-hmC-mediated epigenetic dynamics during postnatal neurodevelopment and aging.</a> Nat. Neurosci. 14, 1607-1616 (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC) est une modification présente récemment identifié épigénétique en quantités importantes dans certains types de cellules de mammifères. La méthode présentée ici est de déterminer la distribution du génome entier de 5-HMC. Nous utilisons bactériophage T4 β-glucosyltransférase de transférer une fraction de glucose ouvragée contenant un groupe azide sur le groupe hydroxyle de 5-HMC. Le groupe azide peut être modifié chimiquement avec de la biotine pour la détection, l&#39;enrichissement d&#39...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Catalogue </td><td> Commenter </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> Le chlorure de sodium 5M (NaCl) </td><td> Promega </td><td> V4221 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5 M pH 8,0 acide éthylène diamine (EDTA) </td><td> Promega </td><td> V4231 </td><td></td></tr><tr><td> 1M Trizma de base (Tris) pH 7,5 </td><td> Invitrogen </td><td> 15567-027) </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M, pH 7,4 </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> Le chlorure de magnésium (MgCl 2) 1M </td><td> Ambion </td><td> AM9530G </td><td></td></tr><tr><td> Diméthylsulfoxyde (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D8418 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Fisher BioReagents </td><td> BP337-100 </td><td></td></tr><tr><td> DBCO-SS-biotine conjugué Peg3- </td><td> Cliquez sur Outils Chimie </td><td> A112P3 </td><td></td></tr><tr><td> 1,4-dithiothréitol, ultrapure (TNT) suprapur </td><td> Invitrogen </td><td> 15508-013 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick suppression de nucléotides </td><td> Qiagen </td><td> 28304 </td><td></td></tr><tr><td> Micro Bio-Spin 6 Colonne </td><td> Bio-Rad </td><td> 732-6222 </td><td></td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne </td><td> Invitrogen </td><td> 650-01 </td><td></td></tr><tr><td> Streptavidine C1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Qiagen PCR Purification Kit MinElute </td><td> Qiagen </td><td> 28004 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 16500500 </td><td></td></tr><tr><td> UDP-6-N 3-glucose </td><td> Active Motif </td><td> 55013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Enzyme </td></tr><tr><td> β-glucosyltransférase (β-GT) </td><td> New England Biolab </td><td> M0357 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Dispositif de sonication </td><td> Covaris </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Centrifugeuse bureau </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Appareil de gel running </td><td> Bio-Rad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> NanoDrop1000 </td><td> Thermo Scientific </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Shaker </td><td> Barnstead </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labquake Tube Shaker </td><td> Thermolyne </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pied de séparation magnétique </td><td> Promega </td><td> Z5342 </td><td></td></tr><tr><td> Qubit 2,0 fluorimètre </td><td> Invitrogen </td><td></td&gt; <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 10 Configuration réactif X β-GT tampon de réaction (500 mM HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X à relier et de lavage (B &amp; W) tampon (10 mM Tris pH 7,5, EDTA 1 mM, NaCl 2 M, 0,02% de Tween 20) . </td></tr></tbody></table>

capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;adn génomique

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-méthylcytosine (5-mC) constitue ~ 2-8% des cytosines total dans l&#39;ADN génomique humain et affecte une large gamme de fonctions biologiques, y compris l&#39;expression des gènes, le maintien de l&#39;intégrité du génome, empreinte parentale, inactivation du chromosome X, la réglementation des développement, le vieillissement et le cancer 1. Récemment, la présence d&#39;un 5-mC oxydé, 5-hydroxyméthylcytosine (5-HMC), a été découvert dans les cellules de mammifères, en particulier dans les cellules souches embryonnaires (ES) et de cellules neuronales 2-4. 5-HMC est généré par l&#39;oxydation du 5-mC catalysée par TET famille du fer (II) / α-cétoglutarate en fonction de dioxygénases 2, 3. 5-HMC est proposé de participer à l&#39;entretien de souches embryonnaires (MES) cellulaire, hématopoïèse normale et les tumeurs malignes et le développement du zygote 2, 5-10. Afin de mieux comprendre la fonction de la 5-HMC, un système de séquençage fiable et simple est essentielle. Séquençage bisulfite traditionnelle ne peut pas distinguer 5-5-console HMC à partir MC 11 </sup&gt;. Pour élucider la biologie de la 5-HMC, nous avons développé une approche chimique très efficace et sélective d&#39;étiqueter et de capturer 5-HMC, profitant d&#39;une enzyme bactériophage qui ajoute une fraction de glucose à 5 HMC spécifiquement 12. Nous décrivons ici une simple procédure en deux étapes pour l&#39;étiquetage chimique sélective de la 5-HMC. Dans la première étape de marquage, le 5-HMC dans l&#39;ADN génomique est marqué avec un azide catalysée 6-β-glucose par-GT, une glucosyltransférase du bactériophage T4, d&#39;une manière qui transfère le 6-azide-glucose à 5-HMC de l&#39; modifié cofacteur, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). Dans l&#39;étape, biotinylation seconde, une liaison disulfure biotine est fixé au groupe azide par click chemistry. Ces deux étapes sont très spécifiques et efficace, conduisant à compléter l&#39;étiquetage quelle que soit l&#39;abondance de la 5-HMC dans des régions génomiques et en donnant de fond extrêmement faible. Après biotinylation de 5-HMC, les fragments d&#39;ADN 5-HMC contenant sont ensuite sélectivement capturéen utilisant des billes de streptavidine d&#39;une manière indépendante de la densité. Les résultantes 5-HMC-enrichis fragments d&#39;ADN peuvent être utilisés pour les analyses en aval, y compris séquençage de prochaine génération. Notre marquage sélectif et le protocole de capture confère une sensibilité élevée, applicable à toute source d&#39;ADN génomique avec des variables / 5 diversifiée HMC abondance. Bien que le but principal de ce protocole est son application en aval (., Séquençage de prochaine génération de cartographier la distribution 5-HMC dans le génome), il est compatible avec une seule molécule, en temps réel SMRT (ADN) séquençage, qui est capable de fournir séquençage résolution d&#39;une seule base de 5-HMC.

Décrit un procédé de marquage en deux étapes à l&#39;aide β-glucosyltransférase (β-GT) pour transférer un azide-glucose à 5-HMC, suivie par click chemistry pour transférer un segment de liaison de biotine pour l&#39;enrichissement facile et indépendante de la densité. Cette méthode d&#39;étiquetage efficace et spécifique permet l&#39;enrichissement de la 5-HMC avec un fond extrêmement faible et la cartographie épigénomique à haut débit via séquençage de prochaine génération.

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

la 5-méthylcytosine (5-mC) constitue environ 2 à 8 % du total des cytosines dans l'ADN génomique humain et influence un large éventail de fonctions biologiques, dont l'expression génique...

Le but général de cette procédure est de marquer et d'isoler la cinq-hydroxyéthylcytokinine, une modification de l'ADN récemment découverte. Commencez par fragmenter l'ADN génomique par sonication, puis effectuez une réaction de transfert de glucose à l'aide de la β-glucoglucosyltransférase afin de transférer des groupements glucosyles azidés sur les résidus de cinq-hydroxyéthylcytidine de l'ADN, en utilisant la chimie Qlik. Liez un éclateur biotine salide au groupe azidé pour produire de l'ADN biotinylé. Ensuite, capturez de manière sélective les fragments d'ADN contenant la cinq-hydroxyéthylcytidine sur des billes de streptavidine, indépendamment de la densité.Les fragments d'ADN enrichis en cinq hydroxyéthylcytidine purifiés peuvent être utilisés pour des analyses en aval, notamment le séquençage de nouvelle génération. Le principal avantage de cette technique par rapport aux approches existantes, telles que les méthodes basées sur des anticorps, est que la capture de l'hydroxyéthylcytosine phy est indépendante de la densité de PHY C. Eugene Lee, chercheur associé senior dans le laboratoire, démontrera ce protocole.Tout d'abord, soniquez l'ADN génomique afin d'obtenir une gamme

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Le EpiMark 5-HMC et le kit d'analyse 5-MC peut être utilisé pour analyser et quantifier 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine au sein d'un locus de SPE spécifiques. Le kit distingue 5-MC à partir de 5-HMC par l'ajout de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-HMC via une réaction enzymatique utilisant β-glucosyltransférase (T4-TBG). Lorsque 5-HMC survient dans le contexte de la CCBG, cette modification convertit un site clivable Mspl à un site non clivable.

Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C

L'étalon-or pour l'analyse de la méthylation de l'ADN est le séquençage génomique de l'ADN au bisulfite convertis. Cette méthode tire parti de la sensibilité accrue de la cytosine par rapport à 5-méthylcytosine (5-MeC) au bisulfite désamination dans des conditions acides. Cytosines non méthylées peuvent être distingués des cytosines méthylées après amplification par PCR de l'ADN génomique cible.

Méthylation de l&#39;ADN: bisulfite de modification et d&#39;analyse

Cette vidéo décrit la technique du dot-blot pour déterminer le niveau de méthylation de l’ADN dans les chondrocytes humains in vitro via le transfert d’échantillons d’ADN sur une membrane en nylon et la visualisation ultérieure à l’aide d’anticorps monoclonaux. Cela permet de déterminer le phénotype des chondrocytes à différents stades de la culture.

5-Methylcytosine dot Blot pour déterminer l’étendue de la méthylation de l’ADN

Nous décrivons ici une méthode immunochimique sensible pour cartographier la distribution spatiale des dérivés d’oxydation 5mC basée sur l’utilisation d’anticorps secondaires conjugués à la peroxydase et l’amplification du signal tyramide.

Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

Nouvellement découvert des formes oxydées de la 5-méthylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5FC) et 5-carboxylcytosine (5caC) peut-être représenter des modifications d’ADN distinctes avec des rôles fonctionnels uniques. Un workflow semi quantitatif pour la visualisation de la répartition spatiale des oxi-mCs, profilage d’intensité de signal et colocalisation est décrit ici.

Immunostaining des Modifications de l’ADN : Computational Analysis of Images confocales

Nous avons décrit en détail deux protocoles de base chimique pour la culture des cellules souches embryonnaires de souris. Cette nouvelle méthode utilise des mécanismes synergiques de promouvoir l’oxydation induite par le Tet (par la vitamine C) et réprimant la synthèse de novo de la 5-méthylcytosine (par PD0325901) pour maintenir l’hypométhylation de l’ADN et la pluripotence des cellules souches embryonnaires de souris.

Une méthode de Culture Alternative pour maintenir l’hypométhylation génomique des cellules souches embryonnaires de souris à l’aide de MEK inhibiteur PD0325901 et vitamine C

Des protocoles détaillés pour introduire une enzyme machiné split-TET2 (cidre) dans des cellules de mammifères pour hydroxymethylation chimique d’ADN inductible et remodelage épigénétique sont présentés.

Une Enzyme machiné Split-TET2 pour Hydroxymethylation inductible par produit chimique de l’ADN et le remodelage épigénétique

Nous présentons ici un protocole pour permettre une quantification précise de la méthylation de l’ADN (ADN mitochondrial) mitochondriale. Dans ce protocole, nous décrivons une digestion enzymatique de l’ADN avec BamHI couplé avec un pipeline d’analyse bio-informatique qui peut être utilisé pour éviter une surestimation des niveaux de méthylation de l’ADNmt causée par la structure secondaire de l’ADNmt.

Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial

L’objectif de ce rapport est de décrire le protocole pour la détection immunohistochimique robuste de marqueurs épigénétiques, 5-méthylcytosine (5mC) et 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) dans le développement et postmitotiques rétine de souris.

La détection immunohistochimique de la 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine dans l’élaboration et de la rétine de souris ici

Ici, nous présentons un protocole pour détecter 5-hydroxymethylcytosine dans les cellules et les tissus cérébraux, utilisant la coloration d'immunofluorescence et les méthodes de point-blot d'ADN.

La détection de 5-Hydroxymethylcytosine dans les cellules souches neurales et le cerveau des souris

Cet article décrit un protocole pour la surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre.

Surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre

Découvrez la capture sélective de la 5-hydroxyméthylcytosine à partir d'ADN génomique. Cette méthode utilise la β-glucosyltransférase et la chimie click pour un enrichissement efficace et indépendant de la densité.

Capture d'sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l'ADN génomique

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