Name: Un indicateur moléculaire de ladaptation à long terme olfactive dans C. elegans (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Découvrez un indicateur moléculaire de l'adaptation olfactive à long terme chez C. elegans en utilisant EGL-4 marqué à la GFP. Cette méthode permet de visualiser la localisation nucléaire dans les neurones AWC et de corréler les événements moléculaires avec les comportements d'adaptation.

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Nous tenons à remercier Scott Hamilton, et des membres du laboratoire O&#39;Halloran la lecture attentive de ce manuscrit. Nous remercions également notre relecteur anonyme pour d&#39;excellentes suggestions et commentaires pertinents.

1. Construction de la GFP Tagged EGL-4 animaux exprimant <ol><li> Cloner la fusion traductionnelle GFP :: EGL-4 sous le promoteur pour le gène odr-3 (2678 pb utilisation directement en amont du codon d&#39;initiation): (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4. L&#39;expression ODR-3 disques de promoteur dans les paires de neurones amphid: AWA, AWB, AWC, et faiblement dans l&#39;ASH. </li><li> Injecter le plasmide (p) odr-3 :: GFP :: EGL-4 de type sauvage dans (N2) animaux à 50 ng / ul avec les marqueurs de co-injection en utilisant des techniques de transformation de la lignée germinale 8: (p) ofm-1: : GFP 9 (25 ng / pl) et (p) odr-1 :: dsRED 10 (25 ng / pl). Le odr-1 promoteur dirige l&#39;expression dans l&#39;AWC et AWB amphid paires de neurones, et la ofm-1 promoteur dirige l&#39;expression dans les coelomocytes. </li><li> Soumettre les animaux transgéniques exprimant les tableaux détaillés extrachromosomiques à l&#39;étape 1.2 de l&#39;ultra-violet (UV) / triméthylpsoralène (TMP) protocole d&#39;intégration11. </li><li> Bleach synchroniser les 12 animaux et de les cultiver sur des nématodes croissance des médias (NGM) des plaques contenant OP50 E. coli à la phase de L4. Lavez-L4 animaux assiettes NGM avec M9 tampon pour éliminer OP50 E. coli. </li><li> Éliminer le tampon M9 et ajouter 50-100 ul de 30 pg / ml solution TMP travail sur le culot à vis sans fin dans le tube de 1,5 ml. Enroulez le tube de 1,5 ml dans du papier pour bloquer la lumière ambiante et agiter doucement sur un agitateur pendant 15 min dans la feuille gainé de tube de 1,5 ml. Transfert vers dans la solution TMP / ver sur une plaque non ensemencée NGM grande. </li><li> Exposer les vers sur la plaque NGM aux UV 350 pJ (X100) à l&#39;aide de 2400 Stratalinker. Ensuite, ajoutez les vers à une plaque OP50 NGM contenant et laisser incuber dans l&#39;obscurité pendant 5 heures. </li><li> Choisissez 50 vers transgéniques à environ 10 plaques ensemencées (2-5 vers chaque plaque). Transfert P0 est à chaque nouvelles plaques de 24 h pendant 3 jours. </li><li> Choisissez une 250 F1 clonalenimals (1 animal par plaque). Cloner 2-4 animaux F2 de chaque plaque F1. Vérifiez animaux F3 pour rechercher une ligne de transmission de 100% en consultant d&#39;(p) ofm-1 :: GFP modèle d&#39;expression sous une loupe binoculaire fluorescent. </li><li> Outcross la dernière ligne intégrée (s) avec les animaux de type sauvage N2 5 fois. Nous nous référerons à la dernière ligne intégrée pyIs500, et la GFP-étiqueté EGL-4 molécule GFP :: EGL-4. </li></ol> 2. La culture et l&#39;entretien des animaux d&#39;analyses de translocation nucléaire <ol><li> Cultiver les animaux pyIs500 à 25 ° C sur des plaques standard de 10 cm NGM (voir ci-dessous pour la recette) ensemencé avec OP50 E. coli 13 (figure 1). </li><li> Le jour 1, ramasser quatre à cinq L4 pyIs500 animaux de plaques cultivées à 25 ° C sur cinq différentes 10 cm OP50 E. coli ensemencées plaques et incuber à 25 ° C (c&#39;est, 4-5 L4 animaux par plaque). </li><li> Le jour 4, lavez adulte populations de pyIs500 animaux hors des plaques NGM volumineux à l&#39;aide de S-basale tampon (voir ci-dessous pour la recette). Utiliser des pipettes en verre à usage unique pour transférer les animaux, car ils adhérer à la paroi de pointes de pipettes en plastique. </li></ol> 3. À long terme Odeur induite analyses translocation nucléaire <ol><li> Laver les animaux pyIs500 3 fois dans S-basale pour éliminer les bactéries. Ne pas centrifuger les animaux entre les lavages, mais plutôt permettre aux animaux de se déposer par gravité dans un stationnaire tube de 1,5 ml. Il est essentiel de s&#39;assurer que toutes les bactéries est retiré, et que les pâtés NGM sont exempts de contamination, car les bactéries résiduelles affectera négativement le résultat du test de translocation. En outre, nous avons constaté que l&#39;autoclave de 1,5 ml microtubes produit un &quot;collant&quot; bien sur les parois intérieures du tube qui entraîne les animaux à coller aux parois, et ainsi utiliser non autoclavé tubes de 1,5 ml microtubes. </li><li> Alors que les animaux s&#39;installent entre les lavages, maquillage til adaptation solution. Ajouter 100 ml de S-basale tampon pour un cylindre de 100 ml diplômés. Ajouter adapter l&#39;odeur de la S-basale et scelle le cylindre à l&#39;aide d&#39;une bande de parafilm. Si vous effectuez l&#39;adaptation benzaldéhyde ajouter 7,5 ul de benzaldéhyde dans 100 ml de S-basale, d&#39;adaptation butanone ajouter 11 ul de 2-butaone à 100 ml de S-basale. Retourner doucement (ne pas secouer) le cylindre contenant diplôme S-basales et les odeurs 30 fois pour créer une émulsion uniforme. </li><li> Après le lavage final dans S-basale, permettre aux animaux de se déposer et retirer tout le liquide. Une étiquette tube &quot;+ ve&quot; ou &quot;adapter&quot; et l&#39;autre tube &quot;-ve&quot; ou &quot;unadapt&quot;. Puis ajouter 1 ml du mélange adaptation au microtube adaptation (+ ve) et ajouter 1 ml de S-basale de la microtube de contrôle inadapté (-ve). Essayer de maintenir le nombre d&#39;animaux entre 100 et 200 dans chaque tube. Avec un peu de pratique, il est possible d&#39;estimer le nombre approximatif d&#39;animaux dans une pastille à l&#39;oeil. </li><li> Placer un tube de 1,5 ml capuchon protecteurdans chaque tube (empêche les couvercles de popping ouvert) et placer les tubes sur un agitateur pendant 80 min. Nous avons trouvé que l&#39;exposition odeur entre 60 min et 80 min donne des résultats similaires (à la fois en raison des mesures d&#39;adaptation à long terme). Cependant, 80 min exposition fournit des résultats plus cohérents dans nos mains. Ainsi, tous nos essais d&#39;adaptation à long terme sont normalisés en utilisant une exposition odeur min 80 (figure 2). </li><li> Après 80 min, laver les animaux 3 fois en S-basale. Permettre aux animaux de se déposer par gravité entre chaque lavage. </li></ol> 4. À court terme induits par l&#39;odeur analyses de translocation nucléaire <ol><li> Dans le cas de l&#39;adaptation odeur de courte durée, utiliser le même protocole que par des essais à long terme translocation odeurs provoquées par étapes (3.1-3.4), mais au lieu d&#39;incubation des animaux à s&#39;adapter pyIs500 odeur pendant 80 minutes, utilisez une exposition de 30 min . La quantification des odeurs provoquées par des tests de translocation nucléaire décrites ci-dessous (étape 5) est le même à long terme et à court terexpositions m. </li></ol> 5. Notation de l&#39;événement odeur induite par translocation nucléaire <ol><li> Faire 2% d&#39;agarose contenant des plaquettes de 5 mM d&#39;azoture de sodium (NaN 3) en dissolvant dans l&#39;électrophorèse sur gel d&#39;agarose 2 0 dH. Placez une seule goutte d&#39;agarose fondu contenant NaN 3 sur une lame de microscope en verre. Placer immédiatement une autre lame de microscope en verre sur la première diapositive pour aplatir la goutte d&#39;agarose fondu. Laissez-le pendant 30 secondes, puis doucement démêler le microscope glisse en laissant une lame de microscope avec une semelle d&#39;agarose de ~ 1 mm. </li><li> Après le lavage final dans S-basale, permettre aux vers de terre pour s&#39;installer dans le tube de 1,5 ml et éliminer tout le liquide. Ensuite, ajoutez les animaux goutte à goutte sur les plages d&#39;agarose de plusieurs lames de microscope. Il est important de garder le nombre d&#39;animaux par lame entre 50 et 100. Trop d&#39;animaux par lame va compliquer la notation et créent souvent une lueur bleu-après disperser la lumière d&#39;excitation. L&#39;excès de liquide peutêtre méchant du tampon d&#39;agarose en utilisant un petit Kim-wipe. Placez un verre 0,5 mm lamelle sur le tampon et laisser reposer pendant 2 minutes pour permettre le NaN 3 à immobiliser les animaux. Remarque, les animaux peuvent être récupérés à partir des diapositives après avoir marqué. Les animaux se remettre de l&#39;anesthésie NaN 3 après ~ 1 h en cas de transfert d&#39;une plaque ensemencée NGM dans une goutte de tampon M9. </li><li> A ce stade, il est impératif que chaque expérimentateur élaborer une clé de suivre coulissant est l&#39;expérimental (+ ve) coulissant et qui glissent est le contrôle (-ve) coulissant, et passer les diapositives à une autre personne qui aveuglément marquer la GFP: EGL-4 modèle de localisation. Ceci permet de contrôler les biais de l&#39;expérimentateur. </li><li> Score entre 50 et 100 animaux par lame à l&#39;aide d&#39;un microscope droit fluorescent avec objectifs à fort grossissement 10X, 40X et 63X et GFP / RFP filtres. Tout d&#39;abord, localiser les animaux sous un grossissement 10X en utilisant éclairage sur fond clair. Ensuite, localisez le neurone AWC en éteignant l&#39;bright-champ d&#39;éclairage et en utilisant le filtre DP. Les (p) odr-1 :: lecteurs dsRED expression dans les neurones et AWB AWC. Les neurones ont AWC distinctifs ovales en forme de corps cellulaires par rapport aux corps cellulaires AWB qui sont plus petits et de forme circulaire (figure 2). </li><li> Une fois que le corps de la cellule AWC a été localisé, passer au filtre GFP et d&#39;enregistrer la localisation de la GFP: EGL-4 comme le nucléaire ou cytoplasmique. En utilisant un compteur permet à l&#39;expérimentateur de garder regarder dans l&#39;oculaire tout en marquant la diapositive. Note: 5.1 à 5.5 étapes sont répétées au moins 3 fois à des jours différents pour produire des données statistiquement significatives (figures 1-2). </li></ol> 6. Surveillance GFP-étiqueté EGL-4 lors de la récupération de l&#39;adaptation odeur à long terme <ol><li> Après l&#39;étape 3.5, diviser les populations d&#39;animaux pyIs500 en aliquotes multiples et notes pour la GFP nucléaire par rapport cytoplasmique :: EGL-4 dans l&#39;AWC à zéro point dans le temps (c&#39;est-à-après 80 min d&#39;exposition) et multiples points de temps ultérieurs (figure 3). </li><li> Transfert à la fois le contrôle (-ve) et expérimentales (+ ve) animaux utilisant des pipettes en verre jetables sur des plaques NGM. </li><li> Permettre aux animaux de récupérer pour différentes longueurs de temps et de réexaminer la localisation de la GFP :: EGL-4in AWC à chaque point dans le temps comme dans les étapes 5.1 à 5.5. </li></ol> 7. Matériels Plaques NGM: Pour ajouter 1 L à 1 L ddH 2 0: 21 g de Bacto-Agar, 3 g Chlorure de sodium (NaCl), 2,5 g de Bacto-peptone. Médias autoclave. Après autoclavage, refroidir la gélose jusqu&#39;à ce que la température indique 54 ° C Ajouter les solutions suivantes: 25 ml de tampon phosphate de potassium 1M, 1 ml 1 M Sulfate de magnésium (MgSO 4), 1 ml chlorure de calcium 1 M (CaCl 2); 1 Cholestérol ml dans de l&#39;éthanol (5 mg / ml). 1 M dibasique K 2 HPO 4 174,2 g / mol: 500 ml Pour: Dans 400 ml ddH O 2, dissoudre 87,1 g Dibasic K 2 HPO 4. Réglez le volume à 500 L avec ddH 2 O. Stériliser par filtration à l&#39;aide d&#39;une unité de 500 ml stérile filtre. 1 M monobasique KH 2 PO 4 136,1 g / mol: Pour 1 L: Dans 800 ml ddH O 2, dissoudre 136,1 g monobasique KH 2 PO 4. Réglez le volume à 1 L avec ddH 2 O. Stériliser par filtration à l&#39;aide d&#39;une unité de 500 ml stérile filtre. 1 M de phosphate de potassium (K 3 PO 4) pH 6,0 Tampon: Pour 1 L: Dans un 1 L Unité de filtration stérile, ajouter 868 ml de 1 M monobasique KH 2 PO 4. Laissez l&#39;appareil à filtrer à travers, puis ajouter ml 132 de 1 M dibasique K 2 HPO 4. Laissez l&#39;appareil pour filtrer tout le liquide. Retirez l&#39;unité de filtre et ajuster le pH à 6,0. Conservez-la à température ambiante. S-basale: Pour 1 litre: ajouter 50 ml 1M K 3 PO 4 tampon, pH ~ 6,0, et 20 ml de NaCl 5M aq. Remplir à 1 L avecddH 2 O. Solution autoclave. M9: Pour 1 litre: 3 g KH 2 PO 4, 6 g de Na 2 HPO 4, 5 g de NaCl, 1 ml 1 M MgSO 4, H 2 O. Remplir à 1 L avec ddH 2 0. Stériliser à l&#39;autoclave.

<ol><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14 (4), 803(1995).</li>
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</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

L&#39;entrée des odeurs nucléaire induite d&#39;une GFP-étiqueté EGL-4 molécule décrite ici fournit une lecture solide moléculaire de l&#39;adaptation olfactive chez C. elegans. Les analyses des odeurs provoquées par translocation nucléaire sont simples et ne nécessitent que quelques jours de temps de préparation. L&#39;animal pyIs500 que nous avons construit pour ces essais, exprime un marqueur qui illumine le neurone AWC ainsi que l&#39;expression de la GFP-étiqueté EGL-4 protéines. Ainsi, nous estim...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Bacto Agar </td><td> Difco </td><td> DF0140-07-4 </td><td> Plaques NGM </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium </td><td> Fisher Chemical </td><td> S671-10 </td><td> Plaques NGM </td></tr><tr><td> Bacto Peptone </td><td> Difco </td><td> DF0118-07-2 </td><td> Plaques NGM </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium dibasique </td><td> Fisher Chemical </td><td> S375-500 </td><td> S-basale tampon et plaques NGM </td></tr><tr><td> Phosphate de potassium monobasique </td><td> Fisher Chemical </td><td> P285-500 </td><td> S-basale tampon et plaques NGM </td></tr><tr><td> Kimwipes - Petit </td><td> Kimberly-Clark </td><td> LS2770 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol à 100% </td><td> Shield Gold chimiqueCie. </td><td> 43196-115 </td><td> les odeurs de dilution pour les essais de chimiotaxie </td></tr><tr><td> Chlorure de calcium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C8106-500G </td><td> Plaques NGM </td></tr><tr><td> Sulfate de Magnésium </td><td> MP Biomédical </td><td> 150136-500G </td><td> Plaques NGM </td></tr><tr><td> D&#39;azoture de sodium à 99% </td><td> Fisher Scientific </td><td> ICN10289180 </td><td> Anesthésique </td></tr><tr><td> Agarose - UltraPure </td><td> Invitrogen </td><td> 16500-500 </td><td> Coussinets d&#39;agarose </td></tr><tr><td> Benzaldéhyde </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B1334-100G </td><td> Odeur AWC </td></tr><tr><td> Butanone, ACS grade </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 360473-500ML </td><td> Odeur AWC </td></tr><tr><td> Microtubes à centrifuger - 1,5 ml de couleur </td><td> Denville </td><td> LS8147 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette Pasteur en verre jetable 5-3/4 &quot; </td><td> Fisher Scientific </td&gt; <td> 13-678-20B </td><td></td></tr><tr><td> Stratalinker </td><td> Stratagene </td><td> Stratalinker 2400 </td><td> L&#39;intégration UV </td></tr><tr><td> Bouteille vide Filter - 500 ml </td><td> Nalgene </td><td> 09 à 740-25B </td><td></td></tr></tbody></table>

un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; c. elegans</em

A Molecular Readout of Long-term Olfactory Adaptation in C. elegans

Lors d&#39;une stimulation soutenue des neurones sensoriels les plus adaptera sa réponse en diminuant leur sensibilité au signal. La réponse d&#39;adaptation permet l&#39;attention de forme et protège également les cellules de la sur-stimulation. L&#39;adaptation dans le circuit olfactif de C. elegans a d&#39;abord été décrit par Colbert et Bargmann 1,2. Ici, les auteurs ont défini les paramètres du paradigme d&#39;adaptation olfactive, dont ils se servaient pour concevoir un crible génétique pour isoler des mutants défectueux dans leur capacité à s&#39;adapter aux odeurs volatiles captées par les cellules Wing Amphid de type C (AWC) des neurones sensoriels. Lorsque de type sauvage C. elegans animaux sont exposés à une jolie AWC-senti l&#39;odeur 3 pour 30 minutes, ils vont adapter leur réactivité à l&#39;odeur et ensuite ignorer l&#39;odeur adaptation dans un essai de chimiotaxie comportement pendant ~ 1 heure. Lorsque de type sauvage C. elegans animaux sont exposés à une jolie AWC-senti l&#39;odeur pendant ~ 1 heure ils seront alors ignorer l&#39;odeur adaptation en achemotaxis analyse comportementale pour ~ 3 h. Ces deux phases d&#39;adaptation olfactive chez C. elegans ont été décrits comme adaptation à court terme olfactif (induite après une exposition de 30 min odeur), et adaptation à long terme olfactif (induite après exposition de 60 min odeur). Des travaux ultérieurs de L&#39;Etoile et al., 4 découvert une protéine kinase G (PKG) a appelé EGL-4 qui est nécessaire à la fois pour l&#39;adaptation à court terme et à long terme dans les neurones olfactifs AWC. La EGL-4 protéine contient une séquence de localisation nucléaire qui est nécessaire à long terme des mesures d&#39;adaptation olfactifs, mais dispensable à court terme des mesures d&#39;adaptation olfactifs dans les 4 AWC. Par le marquage EGL-4 avec une protéine fluorescente verte, il était possible de visualiser la localisation de EGL-4 dans l&#39;AWC lors d&#39;une exposition prolongée odeur. L&#39;utilisation de ce entièrement fonctionnel GFP-étiqueté EGL-4 (GFP :: EGL-4) molécule que nous avons pu développer une lecture moléculaire adaptation à long terme olfactive dans les 5 AWC. L&#39;utilisation de ce mlecture olecular d&#39;adaptation olfactive, nous avons été en mesure d&#39;effectuer les deux écrans avant et arrière génétiques pour identifier les animaux mutants qui présentent des modèles défectueux localisation subcellulaire de la GFP :: EGL-4 dans l&#39;6,7 AWC. Nous décrivons ici: 1) la construction de la GFP :: EGL-4 animaux exprimant; 2) le protocole pour la culture des animaux à long terme analyses de translocation induite par l&#39;odeur nucléaires, et 3) la notation de long terme induite par l&#39;odeur Si la translocation nucléaire et la récupération (re-sensibilisation) de la GFP nucléaire :: EGL-4 Etat.

Un exemple de modèle de localisation de la GFP :: EGL-4in l&#39;AWC avant et après exposition prolongée odeur est montré dans la figure 2. Avant l&#39;exposition prolongée odeur, la GFP :: EGL-4 est localisée dans le cytosol de la AWC (figure 2B), et après 80 min d&#39;exposition odeur GFP :: EGL-4 est localisée dans le noyau de l&#39;AWC (figure 2D). Au niveau comportemental, les animaux avec cytosolique GFP :: EGL-4 dans AWC sont attirés par une source ponctuelle de l...

Nous décrivons ici une lecture moléculaire adaptation à long terme olfactif<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt;. La protéine kinase G, EGL-4, est nécessaire pour les mesures d&#39;adaptation stables dans la paire de neurone sensoriel primaire appelé AWC. Pendant de longues odeur d&#39;exposition EGL-4 translocation du cytosol vers le noyau de l&#39;AWC.

Un indicateur moléculaire de l&#39;adaptation à long terme olfactive dans<em&gt; C. elegans</em

Lors d'une stimulation prolongée, la plupart des neurones sensoriels adaptent leur réponse en diminuant leur sensibilité au signal. La réponse d'adaptation permet...

L'objectif général de cette vidéo est de détailler le développement et la mise en œuvre d'un indicateur moléculaire de l'adaptation olfactive à long terme chez l'échinoderme marin, qui décrit l'état d'adaptation d'un animal. Ceci est réalisé en marquant une protéine kinase G appelée egg L four avec une molécule de protéine fluorescente verte et en exprimant cette fusion protéique dans les cellules amphi wing de type C, ou neurones AWC. Dans un deuxième temps, les animaux exprimant la forme marquée par GFP de egg L four dans les neurones AWC sont cultivés sur des boîtes de milieu de croissance pour nématodes contenant la source alimentaire bactérienne OP 50. Ensuite, après quatre jours, une population d'animaux est récupérée par lavage depuis les boîtes de culture et exposée à une odeur détectée par les AWC pendant 80 minutes afin de favoriser l'adaptation olfactive à long terme.Les résultats montrent une localisation nucléaire de la GFP marquée egg L quatre dans les AWC des animaux adaptés, par rapport à une localisation cytoplasmique de la GFP marquée ALE quatre chez les animaux contrôles non adaptés. En créant une copie fonctionnelle des champs ALE quatre, les deux protéines vertes fluorescentes. Nous pouvons suivre la localisation subcellulaire de ACO quatre dans les AWC et décrire l'état comportemental de l'animal en fonction de la localisation de la GFP. Cet outil moléculaire nous permet d'explorer rapidement le rôle de divers mutants ou traitements dans la modulation de la réponse cellulaire après une stimulation neuronale prolongée.Ce protocole commence par la construction d'animaux exprimant des œufs marqués par la GFP au stade larvaire quatre, comme décrit dans la procédure écrite accompagnant cette vidéo. La lignée intégrée finale est désignée par I as 500, et la molécule d'œuf marquée par la GFP est appelée GFP egg L four. Cultivez les animaux IS 500 à 25 degrés Celsius sur des boîtes de milieu NGM standard de 10 centimètres, ensemencées avec des bactéries OP 50 E coli. Le jour un, sélectionnez quatre à cinq animaux is 500 au stade larvaire quatre à partir de boîtes cultivées à 25 degrés Celsius et transférez-les sur des boîtes de 10 centimètres ensemencées avec OP 50 E coli, en utilisant un fin fil de platine appelé « pick » pour prélever et déplacer les animaux.Répétez cette opération pour quatre plaques supplémentaires. Incubez les plaques à 25 degrés Celsius le quatrième jour. Lavez les populations adultes de 500 animaux IS à partir des grandes plaques NGM en ajoutant un tampon basal sur la plaque et en agitant doucement.Cela décolle les animaux de la surface de la plaque et les fait passer en solution tampon. À l’aide de pipettes en verre jetables, aspirez les animaux de la plaque et transférez-les dans un tube einor de 1,5 millilitre. Commencez les tests de translocation en lavant 500 animaux dans du s basil afin d’éliminer les bactéries ; ne pas centrifuger.Animaux entre les lavages. Laisser plutôt les animaux se déposer par gravité dans un tube de microcentrifugeuse stationnaire de 1,5 millilitre. Il est essentiel de s'assurer que toutes les bactéries sont éliminées et que les plaques NGM sont exemptes de contamination, car les bactéries résiduelles affecteraient négativement le résultat du test de translocation.Répétez le lavage avec du basilic deux fois. Préparez la solution d'adaptation en ajoutant 100 millilitres de tampon S basil à un cylindre gradué de 100 millilitres. Si vous effectuez une adaptation par aldéhyde, ajoutez 7,5 microlitres d'aldéhyde à 100 millilitres d'ESP basil et scellez le cylindre à l'aide d'une bande de param.Retournez doucement le cylindre gradué contenant du basilic et de l’odeur 30 fois. Pour obtenir une émulsion homogène, ajoutez des animaux dans chaque tube en essayant de maintenir le nombre d’animaux entre 100 et 200 par tube. Avec un peu d’entraînement, il est possible d’estimer approximativement le nombre d’animaux sur une palette à l’œil nu une fois que les animaux se sont déposés.Après le lavage avec le S basil, retirez tout liquide du tube epi ou orph, étiquetez un nouveau tube comme positif et l'autre nouveau tube comme négatif. Ajoutez ensuite un millilitre du mélange d'adaptation dans le tube microcentrifuge positif d'adaptation et un millilitre de S basil dans le tube microcentrifuge négatif témoin non adapté. Placez un protecteur de bouchon de tube microcentrifuge de 1,5 millilitre sur chaque tube et placez les tubes sur un agitateur rotatif pendant 80 minutes.Après 80 minutes, laver les animaux trois fois dans du S basil, en laissant les animaux se déposer par gravité entre chaque lavage. Préparer des pastilles d'aros à 2 % contenant de l'azoture de sodium à cinq millimolaire en dissolvant de l'aros pour électrophorèse sur gel. Dans de l'eau distillée, déposer une goutte unique de mol et d'aros contenant de l'azoture de sodium sur une lame de microscope en verre, puis placer immédiatement une autre lame de microscope en verre par-dessus la première lame afin d'aplatir la goutte de matériau fondu. Laisser pendant 30 secondes, puis séparer délicatement les lamelles, en laissant une lamelle avec un tampon aros plat d’environ un millimètre. À ce stade, il est impératif que chaque expérimentateur élabore une clé permettant d’identifier les lamelles correspondant à l’expérience positive et celles correspondant au témoin négatif. Ensuite, une fois que les vers se sont déposés après le dernier lavage dans du basil, retirer tout liquide, puis ajouter les animaux goutte à goutte sur les tampons aros de plusieurs lamelles.Il est important de maintenir le nombre d'animaux par lame entre 50 et 100. Un trop grand nombre d'animaux par lame compliquera le comptage et provoquera souvent une diffusion lumineuse. Après excitation par lumière bleue, l'excès de liquide peut être absorbé depuis le tampon aros à l'aide d'un petit morceau de papier absorbant.Placer un coverslip en verre de 0,5 millimètre sur le tampon et laisser reposer deux minutes afin que l'azoture de sodium immobilise les animaux. Ensuite, transmettre les lames à une autre personne qui évaluera de manière aveugle le motif de localisation des œufs GFP au stade L4. Ceci permettra de contrôler tout biais expérimental en analysant entre 50 et 100 animaux par lame à l'aide d'un microscope à fluorescence droit équipé d'objectifs de 10 x, 40 x et 63 x, et de filtres G-F-P-R-F-P.Tout d'abord, localisez les animaux sous un grossissement de 10 x à l’aide de l’éclairage en champ clair. Ensuite, localisez le neurone A WC en désactivant l’éclairage en champ clair et en utilisant le filtre RFP. Le promoteur odeur.Un DS rouge active l'expression dans des neurones WB et A WC. Les neurones A WC possèdent des corps cellulaires de forme ovale distincte, comparés aux corps cellulaires WB, qui sont plus petits et de forme circulaire. Une fois le corps cellulaire A WC localisé, passez au filtre GFP et notez la localisation de GFP egg L quatre comme étant nucléaire ou cytoplasmique.L'utilisation d'un compteur permet à l'expérimentateur de continuer à regarder dans l'oculaire tout en notant la lame. Ce processus est répété au moins trois fois à des jours différents afin d'obtenir des données statistiquement significatives. Un exemple du profil de localisation de GFP œuf L quatre dans l'A WC avant et après une exposition prolongée à une odeur est présenté avant l'exposition prolongée à l'odeur.GFP œuf L quatre est localisé dans le cytosol de l’A WC après 80 minutes d’exposition à l’odeur. GFP œuf quatre est localisé dans le noyau de l’A WC au niveau comportemental. Les animaux présentant un GFP œuf quatre cytosolique dans un WC sont attirés par une source ponctuelle d’odeur.Ce graphique a été généré à partir de résultats représentatifs de tests de chimiotaxie d'animaux non adaptés. Remarquez que l'indice de CHIMIOTAXIE est proche de un. Les animaux présentant une protéine G-F-P-E-L nucléaire quatre dans l'AWC ne sont pas attirés par une source ponctuelle de l'odeur d'adaptation.Ce graphique a été généré à partir de résultats représentatifs d'essais de CHIMIOTAXIE réalisés sur des animaux adoptés. Remarquez que l'indice de CHIMIOTAXIE est proche de zéro. Une fois que l'œuf L4 pénètre dans le noyau des neurones AWC, il provoque des modifications stables et durables de la physiologie des neurones AWC, qui persistent même lorsque l'œuf L4 n'est plus présent dans le noyau.Après 80 minutes d'exposition à l'odeur, les animaux ignorent une source ponctuelle de l'odeur d'adaptation, et cette adaptation persiste même après 120 minutes de récupération. Après 80 minutes d'exposition à l'odeur. GFP Egle four est observé dans le noyau de l'AWC. Cette entrée nucléaire NU est à la fois nécessaire et suffisante pour induire une adaptation à long terme dans l'AWC. Après 120 minutes de récupération, ces animaux n'exhibent plus de GFP Eagle four nucléaire, mais continuent néanmoins à ignorer une source ponctuelle de l'aldéhyde odorant d'adaptation au niveau comportemental, sans inclure les durées de culture.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quelques heures si elle est effectuée correctement.

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