Les explants blastomères à l'essai pour l'engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

La méthode présentée dans cette vidéo utilise des cartes de devenir de l’embryon opus au stade de clivage pour identifier la culture d’un seul blaser de manière isolée afin d’évaluer si le sulfate embryonnaire est déterminé par des instructions intrinsèques ou extrinsèques, les deux premiers embryons cellulaires sont collectés dans lesquels le premier sillon de clivage coupe en deux la zone légèrement pigmentée de l’hémisphère animal. Ces embryons sont cultivés lorsque les embryons atteignent 16 à 32 cellules, la membrane du vitel est ensuite retirée et les cellules voisines sont disséquées loin de la cellule choisie. Par exemple, le blaster disséqué est ensuite transféré dans une dépression dans une culture enduite à la tarière, bien et cultivée.

Une fois que l’explan atteint le stade souhaité, il est récolté pour évaluer l’expression génique ou protéique à l’aide de l’hybridation in situ QPCR ou de l’immunohistochimie. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres telles que la culture, de grands groupes de cellules embryonnaires ou d’organes lors de la connexion, est que les blasphémateurs embryonnaires uniques dont le destin développemental est connu grâce aux études de traçage de la lignée peuvent être cultivés sans facteurs de croissance ajoutés ou présence de cellules voisines. Ainsi, on peut tester directement si des facteurs intrinsèques à la cellule indiquent à ce blasphème de devenir le précurseur d’un tissu spécifique ou s’il nécessite des signaux des cellules environnantes.

La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car la dissection des Blair et leur transfert dans les puits de culture nécessitent des manipulations délicates au stéréomicroscope. Dans cette vidéo, j’utiliserai cette méthode pour démontrer si les ARNm d’origine maternelle biaisent les cellules vers un destin neuronal Travaillant sous un microscope de dissection. Affûtez quatre jeux de pinces à l’aide d’un film abrasif Illumina.

Une paire de pinces sert de sauvegarde au cas où une pointe serait endommagée pendant la procédure, autoclavez les quatre pinces et rangez-les dans un récipient stérile, fabriquez 500 millilitres chacun de 0,1 x et 1,0 x de solution saline de barth modifiée ou de MBS et stérilisez-les par filtre. Conservez ces solutions à une température de 14 à 18 degrés Celsius pendant des mois dans un flacon en verre à bouchon à vis, préparez 2 % d’électrophorèse dans 100 millilitres d’une culture X. Autoclave moyen pour dissoudre l’aros micro-ondes, pour liquéfier l’aros lors de la prochaine utilisation de l’aros pendant que l’aros est liquide.

Versez environ 0,5 millilitre au fond de chaque puits d’une plaque de culture stérile à 24 puits. Cela évitera que les implants ne collent au plastique. Versez ensuite environ deux à trois millilitres au fond de deux boîtes de Pétri de 360 millimètres et remuez doucement pour répartir.

Ceux-ci serviront de boîtes de dissection et l’aros empêche les embryons de coller au plastique. Une fois que leurs membranes sont retirées, lorsque l’aros a refroidi et durci la flamme, la pointe d’une pipette de pâturage de six pouces jusqu’à ce qu’elle fonde en boule. Recadrez brièvement la boule, puis touchez-la légèrement à la surface des aros dans un puits de la plaque de culture.

Cela créera une dépression peu profonde dans laquelle l’explan X sera placé. Répétez l’opération pour chaque puits de l’assiette. Ensuite, remplissez chaque puits de la plaque de culture avec un millilitre d’un milieu de culture stérile.

Remplissez ensuite la boîte de dissection avec 0,1 XMBS pour faciliter la séparation du blaster. Une fois les boîtes de dissection préparées, transférez les œufs fécondés avec les couches de gelée retirées dans des boîtes de Pétri de 100 millimètres contenant 0,5 x milieu de culture. Ceux qui ne sont pas utilisés immédiatement peuvent être cultivés à 14 degrés Celsius tandis que la première boîte est étudiée pour deux embryons cellulaires.

Examinez les embryons dans la première boîte de Pétri à l’aide d’un microscope de dissection à l’aide d’une pipette de transfert en plastique, transférez environ 101 cellules et deux embryons cellulaires dans une boîte séparée remplie de 0,5 x culture. Douleur moyenne. Placez la boîte de Pétri dans un incubateur à 14 degrés Celsius. La capacité de ce test à évaluer avec précision le potentiel de développement d’une cellule repose sur la dissection du blasphème correct basé sur des cartes de destin.

Par conséquent, il est crucial de choisir des embryons avec le bon modèle de pigmentation au stade deux cellules qui se conforment par conséquent aux modèles de clivage réguliers. Comme illustré ici. Les clivages réguliers ne se produisent souvent que d’un seul côté de l’embryon.

Ces embryons peuvent toujours être utilisés comme donneurs si la cellule du donneur provient du côté régulier. Lorsque les embryons atteignent le stade des deux cellules, triez ceux dans lesquels le premier sillon de clivage coupe en deux la zone légèrement pigmentée de l’hémisphère animal dans un plat séparé, triez environ cinq fois plus d’embryons que vous ne pourrez disséquer. Ce seront les donateurs de l’explan.

Conservez les deux embryons cellulaires restants dans une boîte séparée à côté des embryons du donneur tout au long de la procédure pour servir de témoins aux frères et sœurs pour stadifier l’explan. Une fois les embryons triés et disséqués, retournez dans les plats de l’incubateur pour trouver plus d’embryons d’une cellule et de deux cellules. Étant donné qu’il faut environ 90 minutes à la division d’un embryon cellulaire, cela peut être fait jusqu’à deux heures après le prélèvement des ovules.

Pour préparer l’explan, placez cinq à 10 embryons dans une boîte de dissection. Positionnez ensuite le premier embryon de manière à ce que la membrane transparente du vitel puisse être saisie à l’aide d’une pince. Il n’est généralement pas visible, mais peut être saisi au pôle de l’animal où il est séparé par un espace peral clair au-dessus de la surface de l’embryon.

À l’aide d’une pince aiguisée d’une main, saisissez à une certaine distance du blaster à disséquer pour éviter de l’endommager. Ensuite, avec une pince aiguisée, dans l’autre main, saisissez la membrane près de la pointe de l’autre pince et tirez doucement dans des directions opposées pour décoller la membrane. L’embryon s’aplatira lorsque la membrane aura été retirée.

Ensuite, saisissez une cellule voisine avec la pince et utilisez cette cellule comme poignée afin que la cellule à disséquer ne soit pas directement touchée avec la pince dans l’autre main, éloignez doucement les cellules voisines restantes du blasphème souhaité. Si des cellules de la ligne médiane qui partagent le même sort sont ciblées, elles peuvent être retirées ensemble en tant que paire. Enfin, disséquez la cellule de la poignée.

Prélevez le blasphème ou la paire de blasphème à l’aide d’une pipette en verre stérile, en évitant les bulles d’air et l’aspiration excessive. Placez la pointe de la pipette de pâturage sous la surface du milieu de culture dans un puits de la boîte de culture X explan et expulsez doucement le blaster. Il devrait glisser dans la dépression peu profonde par gravité.

Les blasphémateurs de plus d’un embryon peuvent être combinés en un seul explan en les déposant dans la même dépression d’une culture. Eh bien, répétez cette procédure avec les embryons restants dans la boîte de dissection un par un. Après environ 10 embryons, la boîte de dissection sera remplie de débris cellulaires.

Lorsque cela se produit, passez à la parabole de dissection suivante. Une fois toutes les dissections terminées, vérifiez si les explans se trouvent dans les dépressions peu profondes. Sinon, ils peuvent être doucement poussés dans la dépression à l’aide d’une boucle de cheveux stérilisée à 70 % d’éthanol et d’implants d’incubation séchés à l’air à température ambiante sur le banc environ une heure après la dernière dissection.

Retirez les débris entourant l’explan cicatrisé à l’aide d’une culture à pipette de pâturage en verre stérile. La plaque d’explan à 14 à 20 degrés Celsius à côté de la boîte de Pétri contenant les embryons témoins de la fratrie. Les embryons de la fratrie indiqueront le stade de développement de l’explan du blasphème.

Après environ une à deux heures de culture, les blastomères explantés se seront divisés environ quatre fois et se seront débarrassés de la plupart des débris restants des cellules voisines endommagées. Après 20 heures, ils forment de petites boules de cellules robustes. Lorsque les frères et sœurs atteignent le stade de développement souhaité, récoltez l’explan.

Ces explants survivent assez bien, même si certaines cellules se désintègrent. Par conséquent, s’il y a une masse nuageuse dans la culture, explorez-la avec une boucle de cheveux ou une pince pour déterminer si un explan sain est enterré à l’intérieur. Prélevez l’explan dans un petit volume de solution de culture avec un verre près de votre pipette et expulsez-les doucement dans un fixateur ou un tampon de lyse approprié pour le test à effectuer.

Deux blasphémateurs dorsaux ou deux blasphémateurs ventraux ont été disséqués au stade de 16 cellules et cultivés dans un XMBS à 14 degrés Celsius jusqu’à ce que les embryons de la fratrie atteignent les premiers stades de la plaque neurale. Chaque échantillon a été analysé pour l’expression d’une plaque neurale zygotique. Gene Sox deux par hybridation in situ, qui est considérée comme le produit de réaction bleu.

Les résultats de ce test démontrent que la majorité des blasphémateurs animaux dorsaux, qui sont des précurseurs de la plaque neurale, peuvent exprimer SOX deux de manière autonome. C’est-à-dire sans signalisation supplémentaire provenant d’autres régions de l’embryon. Les explans qui n’expriment pas SOX 2 peuvent avoir été mal identifiés au moment de la dissection.

En revanche, aucun des blasphémateurs animaux ventrals, qui sont des précurseurs de l’épiderme ventral, n’exprime SOX deux. Ces données indiquent que les blasphémateurs animaux dorsaux ont une capacité intrinsèque à former du tissu neural, alors que les blasphémateurs animaux ventraux ne le notent pas. Une partie de l’explan dorsal a également allongé une morphologie indiquant la formation du mésoderme dorsal.

Ces blastomères sont également estompés pour former le Noor dans l’embryon intact et une culture explane exprime une protéine marqueur Noor pour tester l’effet de la modification des niveaux endogènes d’un gène neural exprimé par la mère. Cinq ARNm de Fox D ont été injectés dans les huit cellules des blasphémères précurseurs ventraux. Comme le montre ici, la majorité des implants ventraux exprimaient SOX deux.

Inversement, lorsque le niveau endogène de Fox D cinq a été réduit par l’injection d’oligonucléotides de morphe antisens dans les blasters de précurseurs dorsaux à huit cellules, seuls quelques explans dorsaux ont exprimé SOX deux. Ces expériences indiquent que l’expression maternelle de Fox D five joue un rôle dans la capacité intrinsèque des blasphémateurs dorsaux à acquérir un destin neuronal antérieur à cette procédure. D’autres méthodes, telles que l’injection dans les Blairs pour être disséqués, soit des ARNm pour le gain de fonction, soit des oligonucléotides morphosens antisens pour la perte de fonction, peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires.

Par exemple, quels gènes sont impliqués dans la capacité intrinsèque des cellules à donner naissance à un destin développemental spécifique ? De plus, on peut tester les facteurs de signalisation connus en ajoutant des facteurs purifiés au milieu de culture. Cette approche peut également être utilisée pour transplanter des blasphémateurs individuels à de nouveaux endroits dans l’embryon intact.

Cette information est essentielle pour définir les mécanismes cellulaires par lesquels une cellule embryonnaire pluripotente s’engage à devenir le précurseur d’un tissu défini.