Name: Les explants blastomères à lessai pour lengagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 8 s
Description: Découvrez la culture d'explants de blastomères isolés chez Xenopus pour étudier les facteurs intrinsèques et extrinsèques déterminant le destin cellulaire embryonnaire en biologie du développement.

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Les auteurs tiennent à remercier le GWU Harlan bourse de soutien de Paaqua Grant et le GWU Luther Rice bourse de soutien de Mona Herold. Ce travail a été soutenu par la National Science Foundation subvention MCB-1121711.

1. Préparation des instruments, de la Culture et des Médias Plats <ol><li> Aiguisez quatre pinces à l&#39;aide de film abrasif d&#39;alumine. Pour ce faire, sous un microscope à dissection pour contrôler la taille de la pointe. Une paire de pince sert de back-up au cas où un embout est endommagé lors de la procédure. Autoclaver les quatre pinces et conserver dans un contenant stérile. </li><li> Assurez 500 ml de milieu de culture 0,1 X 1,0 X et (que ce soit Sonneries Marc jour [MMR] ou modification de Barth Saline [MBS]; recettes à 15) et le filtre à stériliser. Nous utilisons régulièrement MBS (1X = 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM de CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM d&#39;HEPES [pH 7,8], 2,5 mM NaHCO 3). Entreposer à 14-18 ° C pendant plusieurs mois. </li><li> Faire une solution à 2% d&#39;agarose dans un milieu de culture (2 g d&#39;électrophorèse d&#39;agarose de qualité dans 100 ml de milieu de culture 1X dans une bouteille en verre bouchon à vis). Autoclaver à dissoudre l&#39;agarose. Cela peut être conservé à 4 ° C pendant des mois, et au micro-ondes pour liquéfier la gélose lors de sa prochaine nécessaire. </li><li> Alors que l&#39;agarose est liquide, verser environ 0,5 ml sur le fond de chaque puits d&#39;une plaque de culture de 24 puits stérile. Cela permettra d&#39;éviter les explants de coller au plastique. </li><li> Alors que l&#39;agarose est liquide, verser environ 2-3 ml sur le fond de deux à trois boîtes de Pétri de 60 mm, et agiter doucement pour s&#39;assurer que le fond est couvert. Ils serviront de plats de dissection et l&#39;empêche d&#39;agarose embryons de coller à la fois les membranes en matière plastique sont retirés. </li><li> Lorsque la gélose a refroidi et durci, la flamme de la pointe d&#39;une pipette 6 &quot;Pasteur jusqu&#39;à ce qu&#39;il fonde en boule, et légèrement toucher à la surface de la gélose dans chaque puits de la plaque de culture. Cela va créer une dépression peu profonde dans laquelle l&#39;explant sera placé. </li><li> Remplir chaque puits de la plaque de culture avec 1X milieu de culture stérile. </li><li> Lorsque la gélose a refroidi et durci, remplissez le plat dissection avec un milieu de culture diluée (0,1 X 0,1 X MMR ou MBS) pour faciliter la séparation de blastomères. </li&gt; </ol> 2. Sélection des embryons <ol><li> Obtenir des œufs fécondés et enlever le manteau de gelée selon les protocoles standard de 15. Les transférer à 0.5X milieu de culture dans une boîte de Petri de 100 mm. </li><li> Lorsque les embryons atteignent le stade 2-cellules, trier ceux dans lesquels le sillon premier clivage divise la zone légèrement pigmenté dans l&#39;hémisphère animal (figure 1) dans un plat à part. Ce seront les bailleurs de fonds pour les explants. Gardez le reste des 2-cellules d&#39;embryons dans un plat séparé à côté des embryons donateurs tout au long de la procédure pour servir de témoins frères et sœurs de mettre en scène les explants. </li></ol> 3. Préparation des explants <ol><li> Placez embryons 5-10 dans un plat de dissection, mais ne fonctionne que sur un seul embryon à la fois. </li><li> Positionner le premier embryon de sorte que la membrane vitelline transparent on peut le voir, il est séparé par un espace libre (espace périvitellin) au-dessus de la surface du pôle animal de l&#39;embryon. En utilisant une force aiguiséps dans la main sous-dominante (la main gauche si on est droitier), saisissez la membrane vitelline au-dessus de l&#39;espace périvitellin. En utilisant une pince aiguisée dans l&#39;autre main, saisir la membrane proche de la première pointe pince et tirez doucement dans des directions opposées à peler la membrane de suite. Faire la saisie initiale à une distance à partir de la cellule qui doit être découpé, de sorte que la cellule cible n&#39;est pas endommagé lors du retrait de la membrane. On peut dire que la membrane a été supprimé parce que l&#39;embryon va aplatir. </li><li> Saisir une cellule voisine avec la pince à la main et sous-dominante d&#39;utiliser cette cellule comme une &quot;poignée&quot; si la cellule doit être découpé n&#39;est pas directement touchée. Avec la pince dans l&#39;autre main, tirez doucement sur les cellules restantes voisins loin du blastomère désiré. Si les cellules médianes, qui partagent le même sort, sont ciblés, ils peuvent être enlevés ensemble comme une paire. Enfin, disséquer l&#39;écart de la «poignée» de cellules. </li><li> Décrochez le blastomère (ou une paire blastomère), avec une solution stérile, Pipette Pasteur en verre, en évitant les bulles d&#39;air et d&#39;aspiration excessive. La pipette peut être polie au feu pour éliminer les bords coupants qui pourraient endommager la cellule, mais nous ne sommes pas systématiquement faire. Placer la pointe de la pipette Pasteur sous la surface du milieu de culture dans un puits de la boîte de culture d&#39;explant, et doucement expulser le blastomère. Il doit glisser dans la dépression peu profonde par gravité. Le blastomère même de plus d&#39;un embryon peuvent être combinés en un seul explant. </li><li> Répétez cette procédure avec les embryons restants dans le plat de dissection, un par un. Après environ 10 embryons, le plat de dissection sera rempli de débris cellulaires. Lorsque cela se produit, changez pour un plat de dissection douce. </li><li> Après toutes les dissections sont faites, vérifiez si les explants sont dans les dépressions peu profondes. Sinon, ils peuvent être doucement poussée dans la dépression avec une boucle de cheveux qui a été stérilisé dans de l&#39;éthanol 70% et séché à l&#39;air. </li><li> Environ une heure après la dissection dernière, enlever les débris surrounding les explants guéris avec une solution stérile, une pipette Pasteur en verre. </li><li> Culture de la plaque d&#39;explants à 14-20 ° C à côté de la boîte de Pétri contenant de la fratrie, embryons témoins. Embryons frères et sœurs indiquera le stade de développement des explants blastomères. </li></ol> 4. Les explants de récolte pour l&#39;analyse <ol><li> Récolter les explants lorsque les frères et sœurs atteindre le stade de développement souhaité. Ces explants survivent très bien, même si certaines des cellules se désintégrer. Par conséquent, s&#39;il ya une masse nuageuse dans le puits de culture, l&#39;explorer avec une boucle de cheveux ou une pince pour déterminer si un explant de santé est enterré à l&#39;intérieur. </li><li> Procurez-vous des explants dans un petit volume de solution de culture avec une pipette Pasteur en verre, et doucement les expulser dans un tampon de lyse approprié fixateur ou pour le dosage à effectuer. </li></ol>

<ol><li>Dale, L., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+32-cell+stage+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fate map of the 32-cell stage of Xenopus laevis.</a> Development. 100, 279-295 (1987).</li>
<li>Masho, R., Kubota, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+fates+of+blastomeres+of+the+eight-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth%2C+Diff%22%5BJournal%5D)">Developmental fates of blastomeres of the eight-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Growth, Diff. 30, 347-359 (1988).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+16-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 119, 560-578 (1987).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell+stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell stage Xenopus embryo.</a> Dev. Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Moody, S. A., Kline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+fate+during+cleavage+of+frog+%28Xenopus+laevis%29+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Segregation of fate during cleavage of frog (Xenopus laevis) blastomeres.</a> Anat. Embryol. 182, 347-362 (1990).</li>
<li>Takasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+and+roles+of+the+presumptive+organizer+region+in+the+32-cell+embryos+in+normal+development+of+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth%2C+Diff%22%5BJournal%5D)">Fates and roles of the presumptive organizer region in the 32-cell embryos in normal development of Xenopus laevis.</a> Dev. Growth, Diff. 29, 141-152 (1987).</li>
<li>Sullivan, S. A., Moore, K. B., Moody, S. A. Chapter 20 Early events in frog blastomere fate determination. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+SA+%22Cell+Fate+and+Lineage+Determination%22">Cell Fate and Lineage Determination</a>. Moody, S. A. , Academic Press. 297-321 (1999).</li>
<li>Moore, K. B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal-vegetal+asymmetries+influence+the+earliest+steps+in+retinal+fate+commitment+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal-vegetal asymmetries influence the earliest steps in retinal fate commitment in Xenopus.</a> Dev. Biol. 212, 25-41 (1999).</li>
<li>Yan, B., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+competence+of+Xenopus+blastomeres+to+produce+neural+and+retinal+progeny+is+repressed+by+two+endo-mesoderm+promoting+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The competence of Xenopus blastomeres to produce neural and retinal progeny is repressed by two endo-mesoderm promoting pathways.</a> Dev. Biol. 305, 103-119 (2007).</li>
<li>Gallagher, B. C., Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+differentiation+of+dorsal+axial+structures+from+an+animal+cap+cleavage+stage+blastomere+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Autonomous differentiation of dorsal axial structures from an animal cap cleavage stage blastomere in Xenopus.</a> Development. 112, 1103-1114 (1991).</li>
<li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenopus+maternal+mRNAs+from+a+dorsal+animal+blastomere+induce+a+secondary+axis+in+host+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Xenopus maternal mRNAs from a dorsal animal blastomere induce a secondary axis in host embryos.</a> Development. 116, 347-3345 (1992).</li>
<li>Godsave, S. F., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+mesoderm+formation+in+the+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of mesoderm formation in the Xenopus embryo.</a> Development. 111, 523-530 (1991).</li>
<li>Hainski, A. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+activin-like+signal+activates+a+dorsal-specifying+RNA+between+the+8-+and+16-cell+stages+of+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">An activin-like signal activates a dorsal-specifying RNA between the 8- and 16-cell stages of Xenopus.</a> Dev. Genetics. 19, 210-221 (1996).</li>
<li>Pandur, P. D., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+maternal+influences+on+dorsal-ventral+fate+of+Xenopus+animal+blastomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Multiple maternal influences on dorsal-ventral fate of Xenopus animal blastomeres.</a> Dev. Dyn. 225, 581-587 (2002).</li>
<li>Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSive%2C+HL+%22A+Laboratory+Manual%22">A Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Sullivan, S. A., Akers, L., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((foxD5a%2C+a+Xenopus+winged+helix+gene%2C+maintains+an+immature+neural+ectoderm+via+transcriptional+repression+that+is+dependent+upon+the+C-terminal+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">foxD5a, a Xenopus winged helix gene, maintains an immature neural ectoderm via transcriptional repression that is dependent upon the C-terminal domain.</a> Dev. Biol. 232, 439-457 (2001).</li>
<li>Yan, B., Neilson, K. M., Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxD5+plays+a+critical+upstream+role+in+regulating+neural+fate+and+onset+of+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">FoxD5 plays a critical upstream role in regulating neural fate and onset of differentiation.</a> Dev. Biol. 329, 80-95 (2009).</li>
<li>Vincent, J. -P., Gerhart, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcortical+rotation+in+Xenopus+eggs%3A+an+early+step+in+embryonic+axis+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Subcortical rotation in Xenopus eggs: an early step in embryonic axis specification.</a> Dev. Biol. 123, 526-539 (1987).</li>
<li>Peng, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appendix+A%3A+Solutions+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Appendix A: Solutions and Protocols.</a> Methods in Cell Biology. 36, 657-662 (1991).</li>
<li>Klein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+cleavage+furrow+demarcates+the+dorsal-ventral+axis+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos.</a> Dev. Biol. 120, 299-304 (1987).</li>
<li>Masho, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+correlation+between+the+first+cleavage+plane+and+the+body+axis+in+early+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Growth+Diff%22%5BJournal%5D)">Close correlation between the first cleavage plane and the body axis in early Xenopus embryos.</a> Dev. Growth Diff. 32, 57-64 (1990).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les étapes les plus importantes pour la culture réussie des blastomères individuels sont les suivants: 1) identifier correctement le blastomère d&#39;intérêts; 2) le maintien d&#39;un stérile, culture saine; 3) les cellules de dissection à la partie appropriée du cycle cellulaire, et 4) l&#39;élaboration du manuel nécessaire dextérité pour éviter des dommages lors de la dissection et de transférer à la culture bien. Pour manipuler blastomères spécifiques, il est essentiel d&#39;être capable ...

Xenopus laevis embryons ont été utilisés à grande échelle pour identifier les mécanismes par lesquels les cellules embryonnaires acquérir leurs destins particuliers parce que leurs œufs sont assez grands pour permettre des approches de microchirurgie. En outre, ils développent l&#39;extérieur sans la nécessité d&#39;une supplémentation nutritionnelle du milieu de culture, parce que chaque cellule contient une alimentation riche intracellulaire de plaquettes vitellines qui fournissent un accumulateur d&#39;énergie intrinsèque. Un atout important pour l&#39;étude des mécanismes par lesquels le destin des cellules est déterminée est l&#39;ensemble complet de cartes sort des blastomères stade de division (à partir de 2 - à 32 cellules étapes) 1, 2, 3, 4, 5, 6. Ces cartes ont été construits par micro-injection d&#39;une molécule détectable en un seul blastomère identifiables et suivi plus tard dans le développement de tissus qui sont peuplées par les descendants étiquetés. Les cartes compatibles sont destin possible parce que les axes cardinaux des embryons peuvent être identifiés de façon fiable dans de nombreux embryos. Tout d&#39;abord, dans tous les embryons de type sauvage de l&#39;hémisphère animal est pigmenté, alors que l&#39;hémisphère végétatif est pas. Deuxièmement, l&#39;entrée des spermatozoïdes lors de la fécondation provoque une contraction de la pigmentation hémisphère animal vers le côté ventral avenir, dans de nombreux embryons une différence de pigmentation peuvent donc être utilisés pour discriminer entre les côtés dorsal et ventral. En troisième lieu, le premier sillon de clivage se rapproche du plan médian sagittal dans la plupart des embryons, et peut donc être utilisée pour identifier les bords droit et gauche de l&#39;embryon. Les cartes sort aussi compter sur le fait que, naturellement, les oeufs fécondés fréquemment fendra par des motifs réguliers qui font que chaque blastomère identifiable à travers une large population d&#39;embryons. Alors il existe une variabilité au sein et entre les couvées d&#39;œufs sur des patrons de pigmentation et le décolleté, en utilisant les procédures de sélection décrite ici permet cellules avec des destins prescrites pour être identifié avec environ 90% de précision. Destins cellulaires peuvent être dissuader lesextrait au cours de l&#39;embryogenèse par plusieurs mécanismes. Les facteurs intrinsèques, tels que différemment héritées des ARNm cytoplasmiques ou des protéines, contribuent à plusieurs aspects de la structuration précoce. Par exemple, certains ARNm maternels déterminer les cellules qui contribuent à la lignée germinale, devenu l&#39;endoderme, ou de contribuer à l&#39;axe du corps dorsale (pour revue 7). Les facteurs extrinsèques fournis localement par les cellules voisines ou plus lointainement à partir d&#39;un centre embryonnaire de signalisation, sont responsables de l&#39;induction types spécifiques de tissus et de motifs presque tous les systèmes d&#39;organes. Exemples de centres de signalisation incluent l&#39;organisateur / noeud dans la gastrula qui induit l&#39;ectoderme neural et les modèles du mésoderme, et la zone d&#39;activité polarisante que les modèles de l&#39;axe antéro-postérieur du bourgeon de membre. Bien que les cartes destin d&#39;identifier les précurseurs des différents organes et de révéler la voie du développement pris par leurs descendants dans l&#39;embryon normal, ils ne peuvent pas distinguer intrinsèqueet les influences extrinsèques sur ces cellules. Ils ont également ne pas révéler le plein potentiel de développement d&#39;une cellule, dont les descendants se différencier dans l&#39;environnement complexe de signalisation de l&#39;embryon. Deux approches expérimentales pouvez tester si le destin d&#39;une cellule est déterminée par des facteurs intrinsèques ou est ensuite influencée par des facteurs externes: 1) la transplantation de la cellule à un emplacement roman dans l&#39;embryon, ou 2) la suppression de la cellule de l&#39;embryon suivie par la culture dans l&#39;absence de signaux exogènes. Les deux approches expérimentales ont été faisable chez Xenopus parce que les cellules sont assez grands pour être séparé manuellement. Par exemple, de nombreuses études ont supprimé des cellules individuelles à partir d&#39;embryons (pour changer interactions cellule-cellule) ou des cellules transplantées à des endroits nouveaux dans les embryons d&#39;accueil pour tester les modifications sort (commentaire en 7, 8, 9). En outre, la seconde approche de l&#39;explantation de petits nombres de cellules de différentes régions de l&#39;embryon iculture nto d&#39;élucider les interactions inductives tissulaires en l&#39;absence de facteurs exogènes est possible parce que les cellules de l&#39;embryon de Xenopus sont remplis d&#39;un magasin intracellulaire des nutriments, les plaquettes vitellines. Par conséquent, elles peuvent être cultivées pendant quelques jours dans un milieu défini sans sel supplémentation nutritionnelle ou facteur de croissance du milieu de culture. Nous avons utilisé cette approche pour montrer que les blastomères animaux dorsales ont une capacité autonome pour produire des neurones et des tissus mésodermiques dorsales dues à hérité de la mère ARNm 10, 11, et d&#39;autres ont montré que la spécification du mésoderme de 32 cellules blastomères s&#39;appuie à la fois sur l&#39;information intrinsèque et extrinsèque 12 . Un avantage de la culture de cellules comme explants, c&#39;est que le milieu peut également être complétée par des facteurs de signalisation définis afin de déterminer quelle cellule-à-cellule voie de communication pourrait influer sur le sort de la cellule explanté 12, 13, 14. En outre, on peut injecter le pr blastomèreIOR de culture avec de l&#39;ARNm de surexprimer un gène, ou par des oligonucléotides anti-sens pour prévenir la traduction des ARNm endogènes. Ceux-ci, gain et perte de fonction des analyses permettent d&#39;identifier les molécules sont nécessaires pour un destin autonome exprimé. Pour analyser le sort de l&#39;explant, l&#39;identification des types cellulaires spécifiques peuvent être effectuées par l&#39;expression des gènes standard (par exemple, l&#39;hybridation in situ, RT-PCR) et des tests immunocytochimiques. Ce protocole fournit un moyen simple, mais puissant, moyen de distinguer entre les mécanismes intrinsèques et extrinsèques qui régissent la façon dont une cellule embryonnaire se développe dans des tissus spécifiques.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Alumine film abrasif </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-38 </td><td> Cours (12 um), pour des réparations majeures des extrémités de la pince </td></tr><tr><td> Alumine film abrasif </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-46 </td><td> Moyen (3 um), pour bien aiguiser des extrémités de la pince </td></tr><tr><td> Alumine film abrasif </td><td> Thomas Scientific </td><td> # 6775E-54 </td><td> Fine (0,3 um), pour le polissage des extrémités de la pince </td></tr><tr><td> Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie N ° 5 </td><td> Outils Fine Science </td><td> # 11252-30 </td><td> Celles-ci ont les pointes fines qui n&#39;ont pas besoin d&#39;affûtage lors de la première acquisition. Résistant à la corrosion afin qu&#39;ils puissentêtre autoclavés. </td></tr><tr><td> Solution de gentamicine </td><td> Sigma </td><td> G1397 </td><td> Ajouter à moyenne le même jour que l&#39;utilisation </td></tr></tbody></table>

les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Cartes Destin, construits à partir de la lignée de traçage de toutes les cellules d&#39;un embryon, qui révèlent les tissus descendent de chaque cellule de l&#39;embryon. Bien que les cartes destin sont très utiles pour identifier les précurseurs d&#39;un organe et pour élucider la voie de développement par lequel les cellules descendants peuplent cet organe dans l&#39;embryon normal, ils n&#39;illustrent pas le plein potentiel de développement d&#39;une cellule précurseur ou d&#39;identifier les mécanismes par lesquels son sort est déterminé. Pour tester la volonté du destin cellulaire, on compare répertoire normal d&#39;une cellule de descendants dans l&#39;embryon intact (la carte sort) avec ceux qui sont exprimés après une manipulation expérimentale. Est le destin de la cellule fixe (engagé), indépendamment de l&#39;environnement cellulaire, ou est-elle influencée par des facteurs externes fournis par ses voisins? En utilisant les cartes complètes sort de l&#39;embryon de Xenopus, nous décrivons comment identifier, d&#39;isoler et de culture simples précurseurs stade de division, appelée blastomeres. Cette approche permet d&#39;évaluer si ces premières cellules se sont engagés à le devenir qu&#39;ils acquièrent dans leur environnement normal de l&#39;embryon intact, nécessitent des interactions avec leurs cellules voisines, ou peut être influencée à exprimer destins alternatifs s&#39;ils sont exposés à d&#39;autres types de signaux.

La capacité de ce test pour évaluer précisément le potentiel de développement de la cellule repose sur la dissection sur le blastomère correcte basée sur le sort des cartes 1, 2, 3, 4, 5, 6. Par conséquent, il est essentiel de choisir des embryons avec le motif de la pigmentation correcte au stade 2-cellules, comme illustré à la figure 1, qui par la suite se conformer aux habitudes régulières de clivage, comme l&#39;illustre la figure 2. Si l&#39;on observe les embryons triés...

Le destin d&#39;une cellule individuelle embryonnaire peut être influencé par des molécules héréditaires et / ou par des signaux provenant des cellules voisines. L&#39;utilisation de cartes sort de l&#39;embryon de Xenopus clivage stade, blastomères simples peuvent être identifiés pour la culture en vase clos pour évaluer les contributions des molécules héritées par rapport interactions cellule-cellule.

Les explants blastomères à l&#39;essai pour l&#39;engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

Les cartes de devenir, établies grâce au traçage de lignées de toutes les cellules d'un embryon, révèlent quels tissus dérivent de chaque cellule de l'embryon. Bien que les cartes de devenir...

La méthode illustrée dans cette vidéo utilise des cartes de destin des embryons au stade de segmentation afin d'isoler des cultures de blastomères uniques pour évaluer si le destin embryonnaire est déterminé par des instructions intrinsèques ou extrinsèques. Tout d'abord, des embryons à deux cellules sont collectés, dans lesquels le premier sillon de division traverse la zone légèrement pigmentée de l'hémisphère animal. Ces embryons sont cultivés jusqu'à ce qu'ils atteignent le stade de 16 à 32 cellules, puis la membrane vitelline est retirée et les cellules voisines sont disséquées autour de la cellule sélectionnée. Par exemple, le blastomère disséqué est ensuite transféré dans une dépression d'une cavité de culture recouverte d'agar et mis en culture.Une fois que l'explante atteint le stade désiré, il est récolté afin d'évaluer l'expression des gènes ou des protéines par hybridation in situ, QPCR ou immunohistochimie. Le principal avantage de cette technique par rapport à d'autres méthodes, telles que la culture de grands groupes de cellules embryonnaires ou d'organes en ligne, réside dans le fait que des blastomères embryonnaires individuels dont le destin développemental est co

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Un guide étape par étape pour générer ciblées embryons de poissons zèbres chimérique par transplantation au stade blastula ou de gastrula.

Génération embryons de poissons zèbres chimériques par transplantation

La technique de micro-disséqués explants est une méthode robuste et fiable pour isoler proliférative des cellules musculaires squelettiques de juvéniles, adultes ou embryonnaires muscles comme source de cellules souches du muscle squelettique. Uniquement, ces cellules ont été tirés par clonage pour produire des lignes squelettiques musculaires cellules souches utilisées pour la transplantation in vivo.

Adultes et embryonnaires Culture squelettique Microexplant musculaire et isolement de cellules souches du muscle squelettique

Le mésenchyme crânienne subit des mouvements morphogénétiques dramatiques qui fournit sans doute une force motrice pour l'élévation des plis...

Un test pour évaluer le comportement des explants cellulaires du mésenchyme crânienne

Nous démontrons une méthode pour greffer des cellules cultivées dans des sites définis d’embryons de souris précoces afin de déterminer leur potentiel in vivo. Nous introduisons également une méthode d’électroporation optimisée qui utilise des capillaires en verre de diamètre connu, permettant l’administration précise d’ADN exogène dans quelques cellules des embryons.

Méthodes de transfert localisé précisément de cellules ou de l&#39;ADN dans des embryons de souris après l&#39;implantation précoce

Dans les embryons de xénope, les cellules du toit du blastocèle sont pluripotentes et peuvent être programmées pour générer divers tissus. Ici, nous décrivons des protocoles permettant d’utiliser des explants de toit de blastocèle d’amphibiens comme système de test pour étudier les principales caractéristiques in vivo et in vitro du développement neuronal précoce.

Stem Cell-like<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonnaires explants à étudier les caractéristiques du développement précoce Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em

Ce protocole décrit la reprogrammation des primaires amniotique fluide et membrane de cellules souches mésenchymateuses sur les cellules souches pluripotentes induites en utilisant une approche épisomiques sans intégration dans des conditions totalement chimiquement définies. Les procédures d’extraction, la culture, la reprogrammation et la caractérisation des cellules souches pluripotentes induites qui en résulte par une méthodologie rigoureuse sont reprises.

Reprogrammation du liquide amniotique primaire et cellules de Membrane de pluripotence dans des Conditions sans Xeno

Les explantes de blastoderme de poisson-zèbre sont générées en isolant des cellules embryonnaires des centres de signalisation endogènes au sein de l’embryon précoce, produisant des amas cellulaires relativement naïfs facilement manipulables et cultivés ex vivo. Cet article fournit des instructions pour la fabrication de telles explants et démontre leur utilité en interrogeant les rôles de la signalisation nodale pendant la gastrulation.

Génération d’explants de blastodermes naïfs à partir d’embryons de poisson zèbre

Le test des billes trempées implique l’administration ciblée de réactif de test à n’importe quel moment du développement pour étudier la régulation de la différenciation cellulaire et de la morphogenèse. Un protocole détaillé, applicable à tout modèle animal expérimental, pour préparer trois types différents de perles trempées et les implanter dans l’interdigit d’un embryon de poulet est présenté.

Analyse de la différenciation cellulaire, de la morphogenèse et de la modelation au cours de l’embryogenèse du poulet à l’aide du test des perles trempées

Ole Isacson donne un aperçu concis de la maladie de Parkinson est, ses causes, les stratégies thérapeutiques et les progrès de la recherche sur le Parkinson.

Ole Isacson: développement de nouvelles thérapies pour la maladie de Parkinson

Ce protocole démontre comment maintenir en bonne santé, indifférencié souches embryonnaires humaines (ES) cellules.

Culture et entretien des cellules souches embryonnaires humaines

Découvrez la culture d'explants de blastomères isolés chez Xenopus pour étudier les facteurs intrinsèques et extrinsèques déterminant le destin cellulaire embryonnaire en biologie du développement.

Les explants blastomères à l'essai pour l'engagement du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire

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