Name: Les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine Amphibian (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Découvrez la préparation de tranches rétiniennes chez Ambystoma tigrinum pour enregistrements électrophysiologiques simultanés de photorécepteurs et neurones de second ordre. Cette méthode permet d'étudier les interactions synaptiques rétiniennes.

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Ce travail a été financé par la recherche pour prévenir la cécité et Institutes of Health subvention EY10542 nationale.

1. Tranches rétinienne Préparation <ol><li> Assemblez la chambre (conception illustrée dans la Figure 1). Placer deux billes de graisse à vide, espacée ~ 8-10 mm d&#39;intervalle, à travers la chambre d&#39;enregistrement pour former un canal pour superfusat et dans lequel les tranches de pouvoir incorporer la rétine. Ajouter un second cordon de graisse de quelques millimètres plus loin au-delà de chacun de ces deux bourrelets de graisse pour agir comme un lever et limite débordement. Placer un petit morceau triangulaire de Kimwipe à l&#39;extrémité de la chambre pour assurer un contact de fluide avec l&#39;électrode de référence. </li><li> Appuyer sur un morceau de membrane de nitrocellulose (~ 5 x 10 mm, 0,8 pores um) à plat sur la lame de microscope en verre en deux petites billes de graisse à vide. Évitez de mettre la graisse directement sous le centre de la membrane de nitrocellulose, car cela peut empêcher la rétine d&#39;adhérer. </li><li> Pour préparer la trancheuse de tissu, rompre une lame de rasoir double tranchant en 4 morceaux et joindre une au bras de tranchage. Couper une fine tranche de nitrocellulMembrane ose faire en sorte que le bord coupant de la lame de rasoir à plat contre la chambre d&#39;enregistrement et donc découpe proprement à travers la membrane de nitrocellulose. </li><li> Gardez un petit bécher de solution saline amphibiens (tableau 1) sur la glace à la station de dissection. </li><li> Euthanasier salamandre par décapitation. Hemisect la tête sagittal et la moelle par la moelle épinière. Placer la moitié de la tête sur un morceau de coton imbibé de sérum physiologique amphibien au sommet d&#39;un bloc de linoléum. L&#39;autre moitié de la tête peut être enveloppé d&#39;une serviette en papier humide et conservé à 4 ° C pour une utilisation ultérieure dans la journée. </li><li> Énucléer l&#39;œil. L&#39;utilisation de petits Vannas ciseaux, couper la peau reliant l&#39;oeil à l&#39;orbite environnante. Après avoir libéré l&#39;avant de l&#39;oeil du tissu orbital autour, tirer l&#39;œil vers l&#39;avant et faites glisser les ciseaux sous l&#39;œil de couper à travers les muscles de l&#39;œil et le nerf optique, ce qui libère l&#39;œil de l&#39;orbite. </li><li> Placez l&#39;œil énucléé sur un lit de coton sur lede bloc de linoléum. Jeter la demi-tête. Coupez l&#39;excédent de graisse orbitale à l&#39;arrière de l&#39;oeil. </li><li> Faire une petite incision dans le centre de la cornée avec une lame chirurgicale pointu. Retirez la cornée en glissant Vannas ciseaux fins dans l&#39;incision et l&#39;extension de la coupe radialement vers l&#39;ora serrata. Couper la circonférence autour de l&#39;ora serrata en tournant le bloc de linoléum ou le coton entre les coupes. </li><li> Après avoir coupé tout autour de l&#39;œil, retirez la cornée et le cristallin en tirant sur le côté de l&#39;œilleton. Déplacer l&#39;œilleton résultant sur une surface dure du bloc de linoléum humidifié avec une solution saline amphibiens. Coupez-les en tiers avec une lame de rasoir, en utilisant un mouvement de scie bien à ce que vous avez coupé tout le chemin à travers la sclérotique. </li><li> Placez un ou deux morceaux de œilleton sur la membrane de nitrocellulose avec la surface de la rétine vers le bas. Plonger les morceaux restants avec une solution saline supplémentaire et placez-les au réfrigérateur à 4 ° C ~ </li><li> Geappuyez sur ntly le morceau de œilleton contre la membrane de nitrocellulose avec une pince fine. Plonger la membrane de nitrocellulose et un morceau de l&#39;œilleton avec quelques gouttes de solution saline froide et épongez amphibien sur les bords avec Kimwipe pour aider la rétine d&#39;adhérer. Une fois encore, plonger l&#39;œilleton et la membrane de nitrocellulose avec quelques gouttes de solution saline amphibien froid et décoller la sclérotique / choroïde / épithélium pigmentaire rétinien pour isoler la rétine (qui peut apparaître rose en raison de la présence d&#39;écru rhodopsine). Si nécessaire, couper le nerf optique pour libérer la rétine. </li><li> Si la rétine n&#39;a pas adhéré hermétiquement, drainer la solution saline avec un Kimwipe pour tirer la rétine plus fermement vers le bas sur la membrane de nitrocellulose. Remplacer la solution saline. Répétez si nécessaire. </li><li> Remplir la chambre avec amphibien froide salée et le transférer dans le stade de la trancheuse de tissus. Tranche de la rétine et de la membrane de nitrocellulose en fines lamelles, de marche d&#39;une extrémité à l&#39;autre en faisant tourner le micromètre vernierdans 125 incréments um. Appuyez sur la lame de rasoir doucement mais fermement à travers la rétine et la membrane de nitrocellulose. </li><li> Transférer les tranches de la rétine par le déplacement des bandes de membrane de nitrocellulose sur la voie principale de la chambre d&#39;enregistrement. Soulever une bande de membrane libre et ensuite le maintenir en place tout en déplaçant la chambre en dessous, en vous assurant de garder les tranches submergés. Incorporer les bords de la membrane de nitrocellulose dans les bandes de la graisse à vide, de les faire pivoter de 90 degrés pour afficher les couches rétiniennes. </li><li> Appuyer le plat de la membrane de nitrocellulose sur la surface de verre. Même s&#39;il n&#39;y a pas rétine sur chaque pièce, placez les bandes de membrane de nitrocellulose à intervalles réguliers (~ 1 mm d&#39;intervalle) sur toute la longueur de la voie de perfusion afin de briser la tension de surface et d&#39;améliorer l&#39;écoulement du fluide. </li></ol> 2. Les enregistrements de cellules entières paires <ol><li> Après que toutes les tranches ont été transférés, déplacez la chambre d&#39;enregistrement de la scène d&#39;un montant, fixemicroscope de la scène et fixer l&#39;électrode de plomb de référence. Concentrez-vous sur les tranches à l&#39;aide d&#39;une longue distance travailleur, immersion dans l&#39;eau, 40-60X objectif. Le microscope doit être placé sur une table d&#39;air pour amortir les vibrations et enfermé dans une cage de Faraday pour réduire les interférences électriques. </li><li> Superfuse les tranches en continu à un débit de 1 ml / min avec une solution saline amphibie barboter avec 100% de O 2. Connectez l&#39;aspiration, en s&#39;assurant que les entrées et sorties sont équilibrées. Sortie peut être réglée par rotation de l&#39;extrémité biseautée de l&#39;aiguille d&#39;aspiration ou en déplaçant le Kimwipe à l&#39;extrémité de la chambre près ou plus loin de l&#39;aiguille d&#39;évacuation. La préparation peut être conservée à la température ambiante ou refroidi avec un dispositif à effet Peltier ou tout simplement par la fixation d&#39;un sac de glace sur la platine du microscope. </li><li> Examiner les tranches en faible lumière ou infra-rouge et d&#39;identifier une paire de cellules - un photorécepteur (tige ou cône) et la cellule horizontale ou bipolaire à proximité - à la cible pour l&#39;enregistrement de cellule entière. Tiges peuvent être iindéterminés par leurs organes de grandes cellulaires et en forme de tige segments extérieurs de premier plan (figure 2A). Les cônes sont plus petits que des tiges et ont de petits segments extérieurs coniques. Cellule bipolaire et soma des cellules horizontales sont dans la rangée extérieure de corps cellulaires dans la couche nucléaire interne (INL; figures 2B et 2C). </li><li> Avant de préparer tranches, utiliser un extracteur pipette pour la fabrication de pipettes à partir de verre borosilicate (1,2 mm de diamètre extérieur, 0,95 mm de diamètre intérieur avec un filament de verre). L&#39;extrémité de chaque micropipette doit être ~ 1-2 microns de diamètre. </li><li> En utilisant une aiguille de remplissage non métallique (par exemple celui fabriqué à partir d&#39;une seringue de 1 cc ou un Microfil), remplissez pipettes avec la solution intracellulaire (tableau 1) et le fixer au porte-électrode. </li><li> Élever légèrement l&#39;objectif du microscope. Positionner la pipette de photorécepteur sous l&#39;objectif, puis l&#39;abaisser afin que la pointe est positionnée juste au-dessus des tranches. Répéter l&#39;opération avec til seconde pipette. </li><li> Réglez tout décalage dans le niveau actuel de référence sur l&#39;amplificateur. Vérifier la résistance de la pipette avec une mV impulsion de dépolarisation 5-10. Nous utilisons généralement pipettes qui vont de 10 à 15 MQ, le résultat de la longue cône de l&#39;arbre et à faible osmolarité des solutions pipette amphibiens. Avec les solutions de mammifères d&#39;osmolarité plus, ces mêmes pipettes présentent des valeurs de résistance de ~ 8-12 MQ. Bien que nous ayons utilisé des diamètres de pointe avec des valeurs de résistance de 3-4 MQ dans les solutions d&#39;amphibiens, les avantages offerts par une résistance d&#39;accès inférieur sont compensées par une plus grande difficulté à étanchéité sur les membranes cellulaires et un aperçu plus rapide des courants de calcium et d&#39;autres second messager réponses sensibles. </li><li> Tout en appliquant une légère pression, la position favorable de la pipette post-synaptique afin qu&#39;il communique avec l&#39;organisme de cellules horizontale ou bipolaire. Ensuite, positionner la pipette présynaptique de telle sorte qu&#39;il contacte le corps de cellule d&#39;un photorécepteur tige ou de cône. Enregistrements appear soit plus stable lorsque les embouts de pipette contacter le segment interne plutôt que le soma, en particulier dans les cônes. </li><li> Lors de la surveillance de la résistance, relâchez la pression positive sur la pipette post-synaptique. Parfois, la libération de la pression positive est suffisante pour former un joint d&#39;étanchéité gigaohm. Sinon, appliquer une aspiration douce avec une seringue de 1 ml ou par la bouche. Après la résistance de pointe a augmenté à&gt; 100 MQ, appliquer un potentiel de maintien de -60 mV. Après l&#39;obtention d&#39;un joint gigaohm, null sur les transitoires de capacité de pipette et répétez la procédure d&#39;étanchéité pour la pipette photorécepteur, en appliquant un potentiel de maintien de -70 mV. </li><li> Rupture du patch à l&#39;aide de votre bouche ou une seringue pour appliquer une aspiration à chaque cellule à son tour. Bâtonnets, cônes et les cellules bipolaires sera typiquement rupture avec aspiration douce. L&#39;obtention de la configuration à cellules entières avec une cellule horizontale peut nécessiter une plus grande aspiration (c&#39;est à dire avec une seringue de 3 cc) en combinaison avec de fortes impulsions de tension rapide fourni avec le f &quot;zapping&quot;eature de l&#39;amplificateur de patch-clamp. La rupture de la membrane et la mise en place de configuration de la cellule entière est évident par l&#39;apparition de transitoires de capacité de cellule entière. </li><li> Confirmer l&#39;identité de la cellule post-synaptique physiologique en appliquant un flash de lumière et offrant une série de mesures de tension de -120 à 40 mV en incréments de 20 mV (figures 3 et 4). </li><li> Pour évaluer si la paire de cellules sont synaptique reliée, de livrer un bref (25-100 msec), 60 mV étape dépolarisation au photorécepteur (à -10 mV, près de la pointe de la L-type actuel calciques voltage-dépendants) et Look pour des courants post-synaptiques dans la deuxième neurone de commande (figure 5). Une étape de dépolarisation solide doit évoquer un courant entrant rapide, transitoire post-synaptiques dans la cellule bipolaire horizontale ou OFF post-synaptique provoquée par une explosion de la libération des vésicules à partir du cône (figure 5). </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La préparation de la tranche la rétine s&#39;est avérée très utile pour analyser les circuits et les mécanismes utilisés par la rétine pour traiter l&#39;information visuelle. La possibilité d&#39;obtenir des enregistrements de cellules entières simultanément à partir de neurones pré-et post-synaptique a été particulièrement utile à cet égard. Enregistrements de cellules entières paires sont beaucoup plus faciles à réaliser avec des tranches qu&#39;avec plate-Préparatifs pour le montage de la rétine parce que les différentes couches de la rétine sont exposées. En outre, en raison de leurs grandes neurones rétiniens, les salamandres ont une longue histoire en tant que préparation de la rétine et fournissent donc un système modèle particulièrement bien caractérisés. Avec la pratique, tranches saines de salamandre rétine peuvent être préparés régulièrement. Quelques étapes clés peuvent faire la différence entre le succès et l&#39;échec. 1) Assurez-vous que la lame de rasoir est monté sur la trancheuse de tissu de sorte qu&#39;il repose à plat sur la surface du verre et des tranches proprement si les deux le tissu et underlyimembrane de nitrocellulose ng. Si vous avez fait une coupe nette à travers la membrane de nitrocellulose, vous devriez entendre un léger clic que la lame de rasoir frappe la surface de la lame de verre. 2) Assurez-vous que la rétine a adhéré à la membrane de nitrocellulose. Sinon, la rétine peut flotter loin de la membrane à n&#39;importe quelle étape de la procédure. 3) Ne pas exposer les tranches coupées à l&#39;air, car cela pourrait endommager la plupart des cellules superficielles. 4) Assurez-vous que les tranches et la membrane de nitrocellulose reposent à plat sur la lame de verre afin que les couches de la rétine sont visibles sous la loupe binoculaire. 5) Balance des taux d&#39;entrée et de sortie superfusat afin d&#39;éviter tout débordement de la chambre d&#39;enregistrement. Cela évite des changements soudains dans les niveaux de la solution, qui peut causer des mouvements brusques de tissus. 6) Sélectionner une paire de cellules saines proches l&#39;une de l&#39;autre. Les cellules avec cytoplasme lisse sont en meilleure santé que les cellules avec un cytoplasme granuleux. Les cellules les plus profondes dans la tranche sont plus susceptibles de conserver intact con synaptiquetacts. 7) Assurez-vous que la pointe de la pipette n&#39;a pas rompu ou brossé contre d&#39;autres tissus ou de débris sur le chemin vers les cellules. 8) Vérifier la résistance pipette pour s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;est pas obstrué par des débris ou une bulle, à la fois de ce qui peut rendre difficile l&#39;obtention d&#39;un enregistrement cellules entières qualité. Plutôt que de fixer la rétine de papier filtre de nitrocellulose, certains chercheurs intègrent rétines dans un bloc de gélose et utilisent un vibratome à couper des tranches rétiniennes. Bien que nous n&#39;avons pas essayé cette approche, Kim et al. 11 discuter des avantages des deux approches. Dans leur expérience, l&#39;approche à base de gélose fournit un rendement plus uniforme des tranches plates avec des couches rétiniennes bien délimités mais l&#39;approche du filtre papier donne des photorécepteurs sains. Bâtonnets et les cônes sont responsables de la transduction lumière des changements dans le potentiel de membrane. Avec les enregistrements par paires, le potentiel de membrane des tiges ou des cônes peut être manipulés directement et donc la capacité de générer des réponses lumineuses, tout en étant utiles pour identifier les types de cellules, peut-être pas indispensable. Nous préparons donc souvent tranches en lumière blanche. Cependant, même quand il est préparé sous un éclairage lumineux, les neurones rétiniens salamandres peuvent générer des réactions légères comme l&#39;illustrent les réponses dans la figure. 3. Ceci est partiellement dû à un nombre relativement important réservoir de chromophore dans le grand volume du segment externe, mais peut aussi refléter la capacité des cellules à se régénérer Müller 11-cis-rétinal pour cônes 12. Pour obtenir des réponses lumineuses entièrement adaptés à l&#39;obscurité, on peut préparer les tranches sous un éclairage infrarouge. Pour dissections sous la lumière infrarouge, nous attachons GenIII intensificateurs d&#39;image (Nitemate Nav3, Litton Industries, Tempe, AZ) pour les oculaires du microscope à dissection et illuminer le tissu avec une lampe de poche LED infrarouge. Pour trancher et d&#39;autres procédures qui sont menées sous la loupe binoculaire, nous employons un visiocasque image amplificateur. Pour le placement des pipettes de patch, nous visualisons tranches à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD sensible à l&#39;infrarouge (par exemple Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY) monté à la verticale microscope, fixe la scène. Avec ces précautions, on peut obtenir des réponses de tige présentant une sensibilité unique photon 6, 13. Une limitation de travailler en tranches rétine est que les processus cellulaires longues de grands neurones rétiniens de terrain risquent de perdre beaucoup de leurs dendrites lors de la procédure de trancher. Préparations de tranche rétiniennes sont donc plus utile pour étudier la physiologie des cellules, dans lequel les contacts synaptiques impliquant des processus près du corps de la cellule. Rétines d&#39;amphibiens et de mammifères partagent plusieurs des mêmes types de cellules et utilisent des mécanismes physiologiques similaires 14-16. Alors que la salamandre rétine est un bon modèle pour de nombreux aspects de la rétine des mammifères, une différence importante semble être la présence d&#39;une voie de tige dédié chez les mammifères qui involves contacts des cellules bipolaires tige spécialisées sur les cellules AII amacrine 14. Une autre limite de la rétine salamandre est le petit nombre d&#39;outils génétiques développés spécifiquement pour cette espèce. Cependant, les anticorps et les réactifs shRNA qui ciblent des régions bien conservées dans d&#39;autres espèces peuvent être utilisés avec succès dans salamandre, tout comme de nombreux inhibiteurs de petites molécules et des réactifs peptidiques. En outre, avec quelques modifications dans la technique, des tranches rétiniennes peuvent être préparés à partir d&#39;autres espèces dans lequel certains de ces outils sont plus facilement disponibles. Au-delà de son utilité pour l&#39;enregistrement de cellule entière jumelé, la préparation de tranches rétinienne salamandre est également prête à une variété d&#39;autres approches. Comme indiqué ci-dessus, des tranches rétiniennes peuvent être utilisées pour étudier les réponses de lumière en combinaison avec différents protocoles de serrage de tension 17. Neurones rétiniens peuvent aussi être chargés avec des colorants fluorescents sensibles au Ca 2 +, Cl -, ou Na+ Introduit par la pipette de patch ou par bain-application 15,18-20. Un peptide fluorescent qui se lie au ruban synaptique 21 peut être introduit à travers la pipette de patch et utilisée pour l&#39;imagerie du ruban 10, ou, lorsqu&#39;il est conjugué à la fluorescéine, de façon aiguë et d&#39;endommager sélectivement le ruban 22. Nous avons également utilisé des tranches rétiniennes en combinaison avec des points quantiques pour surveiller les mouvements des canaux calciques individuels à bâtonnets et des cônes terminaisons synaptiques 23. Ainsi, la tranche verticale rétinienne est une préparation expérimentale polyvalente pour l&#39;étude des mécanismes synaptiques de base et des fonctions de traitement spécifiques effectuées lors de la première synapse de la voie de signalisation visuelle.

<table><tbody><tr><td>Trancheuse à tissus</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir à double tranchant</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>Membranes nitrocellulosiques</td><td>Millipore</td><td>AAWP02500</td><td>Type AAWP 0,8 mm pore</td></tr><tr><td>Pipettes en verre borosilicaté</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW120F-4</td><td>1,2 mm OD 0,95 mm ID</td></tr><tr><td>Ag/AgCl pellet</td><td>Warner</td><td>E206</td><td></td></tr><tr><td>MicroFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Aiguille de remplissage de calibre 34, longueur 67 mm</td></tr></tbody></table>

les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine amphibian

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

L&#39;une des tâches centrales de la rétine neurosciences est de comprendre les circuits de neurones de la rétine et la façon dont ces liens sont responsables de la mise en forme des signaux transmis au cerveau. Les photons sont détectés dans la rétine par des bâtonnets et des cônes photorécepteurs, qui convertissent cette énergie en un signal électrique, le transmettre aux autres neurones de la rétine, où il est traité et transmis à des cibles dans le centre de cerveau par le nerf optique. Importants premiers aperçus dans les circuits de la rétine et le traitement visuel provenaient des études histologiques de 1,2 Cajal et, plus tard, à partir d&#39;enregistrements électrophysiologiques de l&#39;activité de dopage des cellules ganglionnaires de la rétine - les cellules de sortie de la rétine 3,4. Une compréhension détaillée du traitement visuel dans la rétine nécessite une compréhension de la signalisation à chaque étape de la voie de photorécepteur de cellules ganglionnaires de la rétine. Cependant, de nombreux types de cellules rétiniennes sont burIED en profondeur dans le tissu et donc relativement inaccessible pour l&#39;enregistrement électrophysiologique. Cette limitation peut être surmontée en travaillant avec des tranches verticales, dans lequel les cellules résidant dans chacune des couches de la rétine sont clairement visibles et accessibles pour l&#39;enregistrement électrophysiologique. Ici, nous décrivons un procédé de fabrication sections verticales des rétines de larves de salamandres tigrées (Ambystoma tigrinum). Bien que cette préparation a été développé à l&#39;origine pour des enregistrements avec des microélectrodes pointus 5,6, nous décrivons une méthode pour les enregistrements de serrage de tension de cellules entières double de photorécepteurs et des cellules horizontales et bipolaires second ordre dans lequel nous manipulons le potentiel de membrane du photorécepteur tout en enregistrant simultanément post- réponses synaptiques dans les cellules horizontales ou bipolaire. Les photorécepteurs de la salamandre tigrée sont beaucoup plus grandes que celles des espèces de mammifères, ce qui en fait une préparation idéale pour entreprendre tson approche expérimentale techniquement difficile. Ces expériences sont décrites avec un oeil vers sonder les propriétés de signalisation du ruban synaptique - une structure synaptique spécialisée trouvé dans une seule une poignée de neurones, y compris les bâtonnets et des cônes photorécepteurs, qui est bien adapté pour le maintien d&#39;un taux élevé de tonique libération de neurotransmetteurs 7 , 8 - et comment il contribue aux propriétés uniques de signalisation de cette première synapse rétine.

Traces représentatif de réponses lumière de neurones en tranches verticales de salamandre rétine sont présentés dans la figure 3. Le cône, cellule horizontale, et OFF cellules bipolaires affichent tous un courant vers l&#39;extérieur en réponse à l&#39;apparition de la lumière. L&#39;éminent courant entrant après le flash de lumière dans les enregistrements de cellules horizontales et bipolaire est causé par l&#39;augmentation de la libération de glutamate par les photorécepteurs comme ils dépolarisent à compenser la lumière. La cellule bipolaire ON répond par un courant entrant à l&#39;apparition de lumière résultant d&#39;un récepteur métabotropique du glutamate cascade de signalisation et l&#39;activation des canaux 9 TRPM1 signe inversion. Les cellules horizontales et les cellules bipolaires peuvent être distingués les uns des autres par leurs relations IV (figure 4). Les cellules horizontales ont typiquement une résistance d&#39;entrée linéaire ou rectification entrante IV et faible (&lt;500 MQ; figure 4A) alors que les cellules bipolaires ont une résistance d&#39;entrée élevée(0,5-2 GQ) et vers l&#39;extérieur de rectification I - V (figure 4B) La figure 5 montre des résultats représentatifs à partir d&#39;enregistrements d&#39;une paire de cellules de cône horizontal (figure 5A) et une paire de cellules bipolaires cône OFF (figure 5B).. Dans chaque cas, le cône de dépolarisation à -10 mV partir d&#39;un potentiel de maintien de -70 mV évoqué un courant dans le cône vers l&#39;intérieur et RPEC rapide dans la cellule horizontale ou bipolaire calciques voltage-dépendants. Cette forte stimulation est suffisante pour vider la piscine facilement libérable de ~ 20 vésicules à partir de chaque ruban synaptique, résultant en une RPEC de ~ 47 pA / ruban 10. L&#39;EPSC cellulaire horizontale sur la figure 5A était de 232 pA, ce qui suggère qu&#39;il a reçu 5 contacts ruban du cône présynaptique. Une estimation similaire du 178 pA EPSC dans la cellule bipolaire off (figure 5B) suggère qu&#39;il a reçu 4 contacts ruban du cône présynaptique. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Amphibian saline </td><td> Pipette présynaptique </td><td> Pipette Postsynaptic </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mM </td><td> 3,5 mM </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl2 </td><td> 1,8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-glutamate * </td><td></td><td> 40 mM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-gluconate ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> le chlorure de tétraéthylammonium </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mm </td><td> 9 mm </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolarité **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsm </td></tr></tbody></table> * Cs-glutamate est réalisée par neutralisation mM d&#39;acide L-glutamique 40 avec 40 mM de CsOH dans la solution de la pipette. A 1 M ** magasin de Cs-gluconate est effectuée par neutralisation d&#39;une solution de CsOH avec 45 à 50% d&#39;acide D-gluconique. *** Le pH doit être ajusté avec NaOH à la solution extracellulaire et CsOH pour les solutions pipette. **** Garder l&#39;osmolarité des solutions pipette juste en dessous de celle de la solution extracellulaire empêche le gonflement des cellules et améliore la longévité de l&#39;enregistrement. Tableau1. Composants et paramètres pour les solutions intracellulaires et extracellulaires standards utilisés dans le présent protocole. <img alt="Figure 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Figure 1. conception de la chambre d&#39;enregistrement. (AC) Haut, latérale et une vue en coupe de la chambre d&#39;enregistrement indiquant les dimensions. La chambre est usiné à partir d&#39;un morceau épais de 2 mm d&#39;acrylique. (D) chambre assemblé. Superfusat pénètre dans la chambre par le biais d&#39;une longueur de 10 cm d&#39;un tube en téflon (tube d&#39;alimentation, le type 24LW). Superfusat est éliminée par application d&#39;une aspiration légère à un tube métallique de calibre biseauté 20 de l&#39;autre côté de la chambre. À côté de ce tube de sortie est une électrode de référence Ag / AgCl culot. La tête de cette électrode de référence est reliée à l&#39;entrée de référence du headstage. Un petit triangle de Kimwipeest placée sur l&#39;électrode de référence pour le maintenir en contact avec la solution et régler le débit de la solution dans le tube d&#39;écoulement. Le fond de la chambre est formé en plaçant une lame de microscope en verre dans les bords en retrait de la chambre. La lame est maintenue en place par un cordon de graisse à vide. Des bandes de membrane de nitrocellulose avec des tranches rétiniennes sont intégrés dans des billes de graisse à vide qui forment un canal pour solution à couler. Avant de faire des tranches, un x 10 mm morceau de membrane de nitrocellulose 5 est fixée sur la chambre avec deux petites billes de graisse à vide. Un morceau de l&#39;œilleton est placé côté vitré bas sur cette membrane de nitrocellulose et décollée une fois la rétine adhère. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Figure 2. Paires de cellules remplies de teinture en vepréparation de tranches rticale. A) Images d&#39;une barre horizontale et la cellule synaptique couplé qui ont rempli contrastant avec des colorants fluorescents introduits par la pipette de patch lors de l&#39;enregistrement de cellule entière simultanée. Lucifer jaune (2 mg / ml) a été inclus dans la solution pipette tige (jaune) et sulfarhodamine B (1 mg / ml) a été inclus dans la solution de la pipette de cellules horizontale (violet). Des images fluorescentes ont été capturées à l&#39;aide d&#39;un disque en rotation microscope confocal (Perkin Elmer Ultraview LCI) équipé d&#39;une caméra CCD refroidie (orque ER) et monté sur le microscope à platine fixe (Nikon E600 FN avec 60X, 1,0 NA objectif à immersion dans l&#39;eau). Ces images ont été superposées sur des images de champ lumineux des tranches rétiniens correspondants en utilisant Adobe Photoshop. B) Images d&#39;un cône et synaptiquement couplés OFF cellule bipolaire. Le terminal axone de la cellule bipolaire se ramifie dans les régions ultrapériphériques sublamina (S1) de la couche plexiforme interne près de la frontière avec la couche nucléaire interne. <strong&gt; C) Images d&#39;un cône et la cellule horizontale synaptique couplé. Notez que les bornes coniques sont considérablement plus grand que le terminal axone de la tige. Bien que les cellules horizontales peuvent être identifiés par la forme oblongue de leurs corps cellulaires, les corps cellulaires des ON et les cellules bipolaires hors-type dans l&#39;INL ne peuvent pas être facilement distingués avant l&#39;enregistrement. Cependant, on peut cibler déplacées cône chassé cellules bipolaires qui ont des corps cellulaires dans l&#39;ONL et peuvent être distingués des cônes par l&#39;absence de segments intérieur et extérieur. La barre d&#39;échelle est de 20 um. <img alt="Figure 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Figure 3. Courants enregistrés sous la bride de tension de quatre neurones rétiniens différents en réponse à un lumineux 500 ms flash de lumière blanche lumineuse évoquée. Le cône (A), la cellule horizontale <strong&gt; (B), et hors cellule bipolaire (C) tous répondu à la lumière avec un courant vers l&#39;extérieur. (D) sur la cellule bipolaire a répondu à la même stimulus lumineux avec un courant entrant. Le bruit de base présenté par la cellule off bipolaire (C) reflète une libération continuelle de vésicules synaptiques dans l&#39;obscurité qui diminue lorsque photorécepteurs hyperpolarisent à la lumière. Les réponses à ces quatre cellules ont été obtenues dans des enregistrements distincts en utilisant des tranches préparés sous une lumière blanche. L&#39;intensité du stimulus de lumière blanche utilisée dans ces exemples produit des réponses dans les cellules horizontales et bipolaires équivalent à 580 nm flux de photons de 1 x 10 5 photons / s / um 2. <img alt="Figure 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> Figure 4. Cette tension relations (IV) de hles cellules bipolaires orizontal et hors service. (A) panneau supérieur, les courants de membrane suscitées par une série de 150 msec tension étapes de -120 à 40 mV appliquée en 20 incréments mV (panneau de fond) vers une cellule horizontale. Les cellules horizontales ont généralement une faible résistance d&#39;entrée et des relations linéaires IV ou de rectification vers l&#39;intérieur (B). Relation IV d&#39;une cellule bipolaire bloqué en réponse à une série d&#39;échelons de tension. Cellules bipolaires ont une plus grande résistance d&#39;entrée et un IV de rectification vers l&#39;extérieur, du fait de l&#39;activation des courants potassiques voltage-dépendants. <img alt="Figure 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Figure 5. Exemples d&#39;enregistrement des données appariées. (A) Enregistrement du courant calcique voltage-gated cône (cône I Ca </sUB&gt;) en réponse à une étape ms à -10 mV partir d&#39;un potentiel de maintien de -70 mV (cône V m) 100. Fuite et la capacité transitoires ont été soustraites en utilisant un protocole soustraction de fuite P / 8. Un rapide excitateur courant post-synaptique (EPSC; HC PSC) a été enregistré en même temps à partir d&#39;une cellule horizontale, montrant que ces deux cellules sont synaptiquement couplées (B) Une RPEC a été enregistré dans une cellule bipolaire arrêt en réponse au même stimulus à un autre. cône.

Nous décrivons la préparation de tranches minces de la rétine aquatique salamandres tigrées (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) Et expliquer comment nous utilisons ces tranches d&#39;étudier le traitement synaptique dans la rétine par l&#39;obtention d&#39;enregistrements de serrage de tension de cellules entières double de photorécepteurs et des cellules horizontales et bipolaire du second ordre.

Les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine Amphibian

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

L’objectif global de cette procédure est de préparer de fines tranches de tissu de la rétine de la salamandre tigrée aquatique et de les utiliser pour des enregistrements simultanés de pinces de tension de cellules entières à partir de photorécepteurs et de cellules horizontales et bipolaires de second ordre. Pour ce faire, on dissèque d’abord l’œil d’une salamandre et on isole la rétine sur un morceau de membrane de nitrocellulose. La deuxième étape consiste à couper de fines tranches de rétine et à les positionner dans la chambre d’enregistrement.Ensuite, la chambre est placée sur un microscope à platine fixe verticale et des pipettes patch sont positionnées au-dessus des coupes rétiniennes. La dernière étape consiste à obtenir des enregistrements cellulaires entiers à partir d’une cellule présynaptique, photoréceptrice et postsynaptique horizontale ou bipolaire. En fin de compte, des enregistrements de cellules entières appariés peuvent être utilisés pour manipuler la libération synaptique et étudier les interactions entre les cellules de la rétine.La préparation de la coupe rétinienne a été développée à l’origine dans les laboratoires de Frank Werblin et Sam Wu.Contrairement aux préparations unicellulaires, les préparations de tranche ont conservé un contact ntique intact, et contrairement aux préparations de rétine entière, le tranchage de la rétine expose diverses couches rétiniennes, permettant un accès facile à tous les différents types de cellules. Dans la tranche de rétine. Les préparations peuvent être utilisées pour des enregistrements électrophysiologiques, y compris l’enregistrement simultané de plusieurs cellules et pour des expériences d’imagerie.Cette préparation s’est avérée extrêmement précieuse pour l’étude des interactions synaptiques entre les neurones rétiniens. Dans cette vidéo, nous décrivons la préparation des tranches à l’aide de la rétine de la salamandre tigrée et soulignons certains des petits détails qui peuvent faire la différence entre le succès et l’échec. Commencez cette procédure en assemblant la chambre.Placez deux billes de graisse sous vide espacées de huit à 10 millimètres à travers la chambre d’enregistrement pour former un canal pour le super fase et pour incruster les tranches de rétinol à un deuxième battement de graisse, quelques millimètres au-delà de chacune de ces deux billes de graisse pour agir comme un prélèvement afin de limiter les débordements. Placez ensuite un petit morceau triangulaire de lingette Kim à l’extrémité de la chambre pour assurer le contact du fluide avec l’électrode de référence. Après cela, appuyez un morceau de membrane de nitrocellulose à plat contre le microscope en verre.Glisser sur deux petits cordons de graisse sous vide. Pour préparer le trancheur de tissus. Cassez une lame de rasoir à double tranchant en quatre morceaux.Fixez ensuite l’un d’eux au bras de tranchage. Assurez-vous que le tranchant de la lame du rasoir repose à plat contre la chambre d’enregistrement en coupant une fine tranche de papier filtre nitrocellulosique. Ensuite, après avoir euthanasié une salamandre par décapitation, nucléez l’œil à l’aide d’une paire de petits ciseaux de Venise sous le microscope, coupez la peau qui relie l’œil à l’orbite environnante.Ensuite, tirez l’œil vers l’avant et glissez les ciseaux en dessous pour couper les muscles oculaires et le nerf optique. Ensuite, placez l’œil énucléé sur un lit de coton sur un bloc de linoléum. Faites maintenant une petite incision au centre de la cornée avec une lame chirurgicale tranchante.Retirez la cornée en glissant les fins ciseaux de Venise dans l’incision et en étendant la coupe radialement vers l’aura Serrata. Ensuite, coupez circonférentiellement autour de l’aura serrata en faisant pivoter le bloc de linoléum ou le coton entre les coupes. Après avoir coupé tout autour de l’œil, retirez la cornée et le cristallin en les retirant du côté de l’œilleton.Transférez l’œilleton restant sur une surface dure du bloc de linoléum humidifiée avec une solution saline d’amphibiens. Coupez-le en trois avec une lame de rasoir tranchante dans un mouvement de sciage fin pour vous assurer qu’il coupe tout le chemin de la sclère. Placez ensuite un ou deux morceaux d’IUP sur la membrane de nitrocellulose avec la surface rétinienne vers le bas.Immergez les morceaux restants avec une solution saline supplémentaire. Après cela, placez-les dans un réfrigérateur au cas où des tranches supplémentaires seraient coupées plus tard. Maintenant, appuyez doucement le morceau d’IUP contre la membrane de nitrocellulose avec une paire de pinces fines.Immergez la membrane de nitrocellulose et le morceau IUP avec plusieurs gouttes de solution saline amphibienne froide. Ensuite, égouttez la solution saline en touchant un morceau de lingette Kim sur les bords de la membrane de nitrocellulose et iup. Après cela, immergez l’IUP dans une membrane de nitrocellulose avec plusieurs gouttes de solution saline d’amphibien froide.Encore une fois, enlevez ensuite l’épithélium pigmentaire rétinoïde choroïde de la sclérotique pour isoler la rétine. Si la rétine n’a pas bien adhéré, égouttez la solution saline avec une lingette kim. Afin de tirer plus fermement la rétine sur la membrane de nitrocellulose, remplacez la solution saline et répétez la procédure si nécessaire.Ensuite, remplissez la chambre de solution saline amphibienne froide. Transférez-le sur l’étage de la trancheuse à tissus. Ensuite, coupez la membrane de la rétine et de la nitrocellulose en bandes fines de 125 microns en appuyant doucement mais fermement sur la lame du rasoir à travers elles.Après avoir coupé toute la rétine en tranches, transférez les tranches rétiniennes une par une sur le canal principal de la chambre d’enregistrement. Pour transférer une tranche, maintenez une bande de membrane en place tout en faisant glisser la chambre en dessous. Assurez-vous de garder la tranche immergée lorsqu’elle se trouve au-dessus de la partie centrale de la chambre.Intégrez les bords de la membrane de nitrocellulose dans les bandes de graisse sous vide et faites-la pivoter de 90 degrés. Pour voir les couches rétiniennes, appuyez la membrane de nitrocellulose à plat contre la surface du verre, même s’il n’y a pas de rétine sur chaque pièce. Placez des bandes de membrane de nitrocellulose à des intervalles réguliers d’environ quelques millimètres pour aider à briser la tension superficielle et ainsi améliorer l’écoulement du fluide.Continuez à transférer les tranches une par une jusqu’à ce qu’elles aient été placées sur toute la longueur du canal de perfusion. Une fois que toutes les tranches ont été transférées, déplacez la chambre d’enregistrement sur la platine d’un microscope à platine fixe droit. Connectez le fil de l’électrode de référence à un fil de terre sur la tête de l’amplificateur.Concentrez-vous sur les tranches à l’aide d’une longue distance de travail : immersion dans l’eau, objectif de 40 à 60 x. Prochain super. Fusionnez les tranches à raison d’un millimètre par minute avec une solution saline d’amphibiens bouillonnée d’oxygène.Connectez la conduite d’aspiration à la conduite de sortie de la chambre. Ajustez ensuite le débit sortant pour équilibrer le flux entrant en tournant l’extrémité biseautée de l’aiguille d’aspiration ou en rapprochant ou en éloignant la lingette kim à l’extrémité de la chambre de l’ouverture à l’extrémité de l’aiguille de sortie. Examinez les tranches sous une lumière tamisée ou infrarouge.Ensuite, identifiez une paire de cellules, un photorécepteur et une cellule horizontale ou bipolaire voisine pour la vente en gros. Pipette d’enregistrement Philip préparée avant les expériences avec la solution intracellulaire, montez-la sur le porte-électrode. Ensuite, élevez légèrement l’objectif du microscope.Placez la pipette photoréceptrice sous l’objectif. Abaissez-le ensuite de manière à ce que la pointe soit positionnée juste au-dessus de la tranche et ajustez la mise au point simultanément. Pour éviter d’aller trop loin.Répétez cette procédure avec la deuxième pipette. Ensuite, vérifiez la résistance de la pipette à l’aide d’une impulsion de dépolarisation de cinq à 10 millivolts. Ajustez n’importe quel décalage du niveau de courant de base sur l’amplificateur.Après cela, appliquez une légère pression positive et, pendant ce temps, positionnez la pipette postsynaptique de manière à ce qu’elle entre en contact avec le corps cellulaire horizontal ou bipolaire. Positionnez ensuite la pipette présynaptique de manière à ce qu’elle entre en contact avec le corps cellulaire d’un photorécepteur à bâtonnets ou à cônes. Lors de la surveillance de la libération de la résistance, de la pression positive sur la pipette postsynaptique, la libération de la pression positive est parfois suffisante pour former un joint giga ohm.Une fois que la résistance de la pointe a augmenté à plus de 100 méga ohms, appliquez un potentiel de maintien de moins 60 millivolts. Ensuite, lorsqu’un joint giga om est obtenu, annulez le transitoire de capacité de la pipette. À l’aide du circuit de compensation de capacité de l’amplificateur patch clamp, répétez la procédure de plafond avec la pipette photoréceptrice, en appliquant un potentiel de maintien de moins 70 millivolts et annulez la capacité de la pipette.Transitoire, puis rompt le patch en appliquant une succion sur chaque cellule. La rupture du patch est évidente par l’apparition d’un transitoire de capacité de cellule entière. Maintenant, confirmez l’identité physiologique de la cellule postsynaptique en appliquant un flash lumineux et en délivrant une série d’échelons de tension de moins 120 à plus 40 millivolts par incréments de 20 millivolts.Pour évaluer si les cellules sont connectées synaptiquement, délivrez une tension de 25 à 100 millisecondes de 60 millivolts. Effectuez une dépolarisation progressive vers le photorécepteur et recherchez des courants post-synaptiques. Dans le neurone du second ordre, voici les traces représentatives des réponses lumineuses des neurones dans les tranches verticales de la rétine de la salamandre.La cellule horizontale conique et la cellule bipolaire désactivée affichent toutes un courant vers l’extérieur en réponse à l’apparition de la lumière. Le courant intérieur proéminent suivant le flash lumineux dans les enregistrements cellulaires horizontaux et bipolaires est causé par la libération accrue de glutamate par les photorécepteurs lorsqu’ils se dépolarisent au décalage de la lumière. La cellule bipolaire on répond par un courant vers l’intérieur au début de la lumière, ce qui résulte d’un signe inversant la cascade de signalisation du récepteur métabotropique du glutamate et de l’activation des canaux tripm un.Les cellules horizontales et les cellules bipolaires se distinguent les unes des autres par leurs relations de tension de courant. Les cellules horizontales ont généralement des relations de tension de courant linéaires ou redressantes vers l’intérieur avec une résistance d’entrée inférieure à 500 mégaohms, les cellules bipolaires ont une relation de tension-courant redressante vers l’extérieur et une résistance d’entrée plus élevée entre 0,5 et deux giga ohms. Cette figure montre les résultats représentatifs des enregistrements d’une paire de cellules horizontales coniques et d’une paire de cellules bipolaires coniques.Dans chaque cas, la dépolarisation du cône à moins 10 millivolts à partir d’un potentiel de maintien de moins 70 millivolts a provoqué un courant calcique dépendant de la tension dans le cône et un postsynaptique rapide vers l’intérieur. Courant dans la cellule horizontale ou bipolaire Tranche rétinienne. Les préparations ont été utilisées dans des centaines d’études sur l’anatomie et la physiologie de la rétine.Ils sont particulièrement avantageux pour examiner les réponses de plusieurs cellules simultanément, car ils facilitent l’enregistrement et l’imagerie de plusieurs cellules en même temps. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer la rétine, de couper de fines tranches rétiniennes, de les positionner dans la chambre d’enregistrement et d’obtenir des enregistrements en gros à partir de paires de soi synaptiquement connectés.

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Cette vidéo montre le processus de la cellule entière enregistrements pince de tension dans la tranche la rétine de la salamandre aquatique tigre. Nous démontrons la préparation de la tranche ainsi que la façon d'effectuer des enregistrements de patch-clamp pendant la stimulation visuelle de la rétine.

Cellules entières Recordings of Light évoqués courants synaptiques excitateurs dans la tranche la rétine

Nous décrivons ici une procédure pour générer adaptés à l'obscurité des tranches de la rétine de souris pour les enregistrements électrophysiologiques.

Enregistrements Patch Clamp à partir de neurones rétiniens souris dans une préparation adaptés à l&#39;obscurité Slice

Cet article fournit une description de la manière de disséquer et d'enregistrer à partir de la préparation isolée de la rétine chez la souris. En particulier, nous décrivons comment enregistrer les réponses de lumière provenant d'une population de cellules ganglionnaires marqués par fluorescence et par la suite identifier et d'analyser sa morphologie.

Une préparation isolée rétinienne pour enregistrer la réponse de Lumière génétiquement marqués cellules ganglionnaires rétiniennes

Nous décrivons ici un protocole pour la préparation de l'agar-intégrés tranches rétiniennes qui sont appropriés pour l'électrophysiologie et d'imagerie de Ca2 +. Cette méthode permet d'étudier un ruban de type synapses dans la rétine à l'aide de microcircuits directe de patch-clamp des enregistrements de simples terminaisons nerveuses présynaptiques.

Patch-clamp mesures de capacité et de Ca 2 + Imagerie à terminaisons nerveuses rétiniennes unique en tranches

Cet article décrit l'enregistrement des cellules individuelles de fluorescence taggés populations neuronales dans la rétine de souris intactes. En utilisant deux photons d'excitation infrarouge cellules transgenetically étiquetés ont été ciblés pour patch-clamp pour étudier leurs réponses lumière, les propriétés des champs réceptifs, et la morphologie.

Populations cellulaires Caractérisation électrophysiologique des exprimant la GFP dans la rétine intacte

Cette vidéo montre l’enregistrement des réponses post-synaptiques évoquées par la lumière dans une préparation de coupe de tissu rétinien de souris adaptée à l’obscurité. La tranche rétinienne est placée dans une chambre d’enregistrement, et une pipette d’enregistrement est utilisée pour établir une continuité électrique avec une cellule ganglionnaire rétinienne. Des impulsions lumineuses sont appliquées pour générer des potentiels post-synaptiques excitateurs dans les cellules ganglionnaires,...

Réponses postsynaptiques évoquées par la lumière dans les neurones de coupes rétiniennes de souris

Nous montrerons comment préparer des coupes rétiniennes à partir de l’œil de souris et enregistrer les réponses lumineuses dans les neurones rétiniens. L’ensemble de la procédure est effectué dans des conditions adaptées à l’obscurité.

Enregistrement Light-réponses évoquées dans les neurones post-synaptiques dans Dark-adaptés, Préparations rétine de la souris tranche en utilisant des techniques de patch clamp

Ce protocole montre comment effectuer des cellules entières d'enregistrement patch clamp sur les neurones de la rétine à partir d'une préparation plate-montage.

Patch Clamp Enregistrement de cellules amacrines Starburst dans un plat de montage Préparation de Deafferentated Souris Retina

Nous avons développé une préparation de tranche horizontale de la rétine adulte de mammifère avec le plan de la coupe parallèle à la surface de la rétine. champs dendritiques des neurones rétiniens orientés nonradially ne sont pas tronquées, permettant l'étude du traitement du signal avec des techniques de patch-clamp et d'imagerie.

Préparation des horizontales Tranches de souris adultes Retina pour les études électrophysiologiques

Dans cet article, nous discutons trois préparations de cerveau utilisées pour l’enregistrement de germes entiers patch clamp pour étudier le circuit rétino des têtards de Xenopus laevis . Chaque préparation, avec ses propres avantages spécifiques, contribue à la traçabilité expérimentale du têtard de Xenopus comme modèle pour étudier la fonction des circuits neuronaux.

Préparations et protocoles pour toute cellule Patch Clamp enregistrement des neurones Tectal Xenopus laevis

Ce travail présente une préparation alternative de rétine à montage plat dans laquelle l’ablation des corps cellulaires photorécepteurs permet une diffusion plus rapide des anticorps et un meilleur accès des pipettes patch aux neurones rétiniens internes pour l’immunohistochimie, l’hybridation in situ et les expériences d’électrophysiologie.

Split Retina en tant que préparation améliorée à montage plat pour l’étude des neurones de la couche nucléaire interne dans la rétine des vertébrés

Découvrez la préparation de tranches rétiniennes chez Ambystoma tigrinum pour enregistrements électrophysiologiques simultanés de photorécepteurs et neurones de second ordre. Cette méthode permet d'étudier les interactions synaptiques rétiniennes.

Les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine Amphibian (Vidéo) | JoVE Journal

Les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine Amphibian

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