Les enregistrements de cellules entières simultanées de photorécepteurs et les neurones de second ordre dans une préparation de tranches rétine Amphibian

L’objectif global de cette procédure est de préparer de fines tranches de tissu de la rétine de la salamandre tigrée aquatique et de les utiliser pour des enregistrements simultanés de pinces de tension de cellules entières à partir de photorécepteurs et de cellules horizontales et bipolaires de second ordre. Pour ce faire, on dissèque d’abord l’œil d’une salamandre et on isole la rétine sur un morceau de membrane de nitrocellulose. La deuxième étape consiste à couper de fines tranches de rétine et à les positionner dans la chambre d’enregistrement.

Ensuite, la chambre est placée sur un microscope à platine fixe verticale et des pipettes patch sont positionnées au-dessus des coupes rétiniennes. La dernière étape consiste à obtenir des enregistrements cellulaires entiers à partir d’une cellule présynaptique, photoréceptrice et postsynaptique horizontale ou bipolaire. En fin de compte, des enregistrements de cellules entières appariés peuvent être utilisés pour manipuler la libération synaptique et étudier les interactions entre les cellules de la rétine.

La préparation de la coupe rétinienne a été développée à l’origine dans les laboratoires de Frank Werblin et Sam Wu.Contrairement aux préparations unicellulaires, les préparations de tranche ont conservé un contact ntique intact, et contrairement aux préparations de rétine entière, le tranchage de la rétine expose diverses couches rétiniennes, permettant un accès facile à tous les différents types de cellules. Dans la tranche de rétine. Les préparations peuvent être utilisées pour des enregistrements électrophysiologiques, y compris l’enregistrement simultané de plusieurs cellules et pour des expériences d’imagerie.

Cette préparation s’est avérée extrêmement précieuse pour l’étude des interactions synaptiques entre les neurones rétiniens. Dans cette vidéo, nous décrivons la préparation des tranches à l’aide de la rétine de la salamandre tigrée et soulignons certains des petits détails qui peuvent faire la différence entre le succès et l’échec. Commencez cette procédure en assemblant la chambre.

Placez deux billes de graisse sous vide espacées de huit à 10 millimètres à travers la chambre d’enregistrement pour former un canal pour le super fase et pour incruster les tranches de rétinol à un deuxième battement de graisse, quelques millimètres au-delà de chacune de ces deux billes de graisse pour agir comme un prélèvement afin de limiter les débordements. Placez ensuite un petit morceau triangulaire de lingette Kim à l’extrémité de la chambre pour assurer le contact du fluide avec l’électrode de référence. Après cela, appuyez un morceau de membrane de nitrocellulose à plat contre le microscope en verre.

Glisser sur deux petits cordons de graisse sous vide. Pour préparer le trancheur de tissus. Cassez une lame de rasoir à double tranchant en quatre morceaux.

Fixez ensuite l’un d’eux au bras de tranchage. Assurez-vous que le tranchant de la lame du rasoir repose à plat contre la chambre d’enregistrement en coupant une fine tranche de papier filtre nitrocellulosique. Ensuite, après avoir euthanasié une salamandre par décapitation, nucléez l’œil à l’aide d’une paire de petits ciseaux de Venise sous le microscope, coupez la peau qui relie l’œil à l’orbite environnante.

Ensuite, tirez l’œil vers l’avant et glissez les ciseaux en dessous pour couper les muscles oculaires et le nerf optique. Ensuite, placez l’œil énucléé sur un lit de coton sur un bloc de linoléum. Faites maintenant une petite incision au centre de la cornée avec une lame chirurgicale tranchante.

Retirez la cornée en glissant les fins ciseaux de Venise dans l’incision et en étendant la coupe radialement vers l’aura Serrata. Ensuite, coupez circonférentiellement autour de l’aura serrata en faisant pivoter le bloc de linoléum ou le coton entre les coupes. Après avoir coupé tout autour de l’œil, retirez la cornée et le cristallin en les retirant du côté de l’œilleton.

Transférez l’œilleton restant sur une surface dure du bloc de linoléum humidifiée avec une solution saline d’amphibiens. Coupez-le en trois avec une lame de rasoir tranchante dans un mouvement de sciage fin pour vous assurer qu’il coupe tout le chemin de la sclère. Placez ensuite un ou deux morceaux d’IUP sur la membrane de nitrocellulose avec la surface rétinienne vers le bas.

Immergez les morceaux restants avec une solution saline supplémentaire. Après cela, placez-les dans un réfrigérateur au cas où des tranches supplémentaires seraient coupées plus tard. Maintenant, appuyez doucement le morceau d’IUP contre la membrane de nitrocellulose avec une paire de pinces fines.

Immergez la membrane de nitrocellulose et le morceau IUP avec plusieurs gouttes de solution saline amphibienne froide. Ensuite, égouttez la solution saline en touchant un morceau de lingette Kim sur les bords de la membrane de nitrocellulose et iup. Après cela, immergez l’IUP dans une membrane de nitrocellulose avec plusieurs gouttes de solution saline d’amphibien froide.

Encore une fois, enlevez ensuite l’épithélium pigmentaire rétinoïde choroïde de la sclérotique pour isoler la rétine. Si la rétine n’a pas bien adhéré, égouttez la solution saline avec une lingette kim. Afin de tirer plus fermement la rétine sur la membrane de nitrocellulose, remplacez la solution saline et répétez la procédure si nécessaire.

Ensuite, remplissez la chambre de solution saline amphibienne froide. Transférez-le sur l’étage de la trancheuse à tissus. Ensuite, coupez la membrane de la rétine et de la nitrocellulose en bandes fines de 125 microns en appuyant doucement mais fermement sur la lame du rasoir à travers elles.

Après avoir coupé toute la rétine en tranches, transférez les tranches rétiniennes une par une sur le canal principal de la chambre d’enregistrement. Pour transférer une tranche, maintenez une bande de membrane en place tout en faisant glisser la chambre en dessous. Assurez-vous de garder la tranche immergée lorsqu’elle se trouve au-dessus de la partie centrale de la chambre.

Intégrez les bords de la membrane de nitrocellulose dans les bandes de graisse sous vide et faites-la pivoter de 90 degrés. Pour voir les couches rétiniennes, appuyez la membrane de nitrocellulose à plat contre la surface du verre, même s’il n’y a pas de rétine sur chaque pièce. Placez des bandes de membrane de nitrocellulose à des intervalles réguliers d’environ quelques millimètres pour aider à briser la tension superficielle et ainsi améliorer l’écoulement du fluide.

Continuez à transférer les tranches une par une jusqu’à ce qu’elles aient été placées sur toute la longueur du canal de perfusion. Une fois que toutes les tranches ont été transférées, déplacez la chambre d’enregistrement sur la platine d’un microscope à platine fixe droit. Connectez le fil de l’électrode de référence à un fil de terre sur la tête de l’amplificateur.

Concentrez-vous sur les tranches à l’aide d’une longue distance de travail : immersion dans l’eau, objectif de 40 à 60 x. Prochain super. Fusionnez les tranches à raison d’un millimètre par minute avec une solution saline d’amphibiens bouillonnée d’oxygène.

Connectez la conduite d’aspiration à la conduite de sortie de la chambre. Ajustez ensuite le débit sortant pour équilibrer le flux entrant en tournant l’extrémité biseautée de l’aiguille d’aspiration ou en rapprochant ou en éloignant la lingette kim à l’extrémité de la chambre de l’ouverture à l’extrémité de l’aiguille de sortie. Examinez les tranches sous une lumière tamisée ou infrarouge.

Ensuite, identifiez une paire de cellules, un photorécepteur et une cellule horizontale ou bipolaire voisine pour la vente en gros. Pipette d’enregistrement Philip préparée avant les expériences avec la solution intracellulaire, montez-la sur le porte-électrode. Ensuite, élevez légèrement l’objectif du microscope.

Placez la pipette photoréceptrice sous l’objectif. Abaissez-le ensuite de manière à ce que la pointe soit positionnée juste au-dessus de la tranche et ajustez la mise au point simultanément. Pour éviter d’aller trop loin.

Répétez cette procédure avec la deuxième pipette. Ensuite, vérifiez la résistance de la pipette à l’aide d’une impulsion de dépolarisation de cinq à 10 millivolts. Ajustez n’importe quel décalage du niveau de courant de base sur l’amplificateur.

Après cela, appliquez une légère pression positive et, pendant ce temps, positionnez la pipette postsynaptique de manière à ce qu’elle entre en contact avec le corps cellulaire horizontal ou bipolaire. Positionnez ensuite la pipette présynaptique de manière à ce qu’elle entre en contact avec le corps cellulaire d’un photorécepteur à bâtonnets ou à cônes. Lors de la surveillance de la libération de la résistance, de la pression positive sur la pipette postsynaptique, la libération de la pression positive est parfois suffisante pour former un joint giga ohm.

Une fois que la résistance de la pointe a augmenté à plus de 100 méga ohms, appliquez un potentiel de maintien de moins 60 millivolts. Ensuite, lorsqu’un joint giga om est obtenu, annulez le transitoire de capacité de la pipette. À l’aide du circuit de compensation de capacité de l’amplificateur patch clamp, répétez la procédure de plafond avec la pipette photoréceptrice, en appliquant un potentiel de maintien de moins 70 millivolts et annulez la capacité de la pipette.

Transitoire, puis rompt le patch en appliquant une succion sur chaque cellule. La rupture du patch est évidente par l’apparition d’un transitoire de capacité de cellule entière. Maintenant, confirmez l’identité physiologique de la cellule postsynaptique en appliquant un flash lumineux et en délivrant une série d’échelons de tension de moins 120 à plus 40 millivolts par incréments de 20 millivolts.

Pour évaluer si les cellules sont connectées synaptiquement, délivrez une tension de 25 à 100 millisecondes de 60 millivolts. Effectuez une dépolarisation progressive vers le photorécepteur et recherchez des courants post-synaptiques. Dans le neurone du second ordre, voici les traces représentatives des réponses lumineuses des neurones dans les tranches verticales de la rétine de la salamandre.

La cellule horizontale conique et la cellule bipolaire désactivée affichent toutes un courant vers l’extérieur en réponse à l’apparition de la lumière. Le courant intérieur proéminent suivant le flash lumineux dans les enregistrements cellulaires horizontaux et bipolaires est causé par la libération accrue de glutamate par les photorécepteurs lorsqu’ils se dépolarisent au décalage de la lumière. La cellule bipolaire on répond par un courant vers l’intérieur au début de la lumière, ce qui résulte d’un signe inversant la cascade de signalisation du récepteur métabotropique du glutamate et de l’activation des canaux tripm un.

Les cellules horizontales et les cellules bipolaires se distinguent les unes des autres par leurs relations de tension de courant. Les cellules horizontales ont généralement des relations de tension de courant linéaires ou redressantes vers l’intérieur avec une résistance d’entrée inférieure à 500 mégaohms, les cellules bipolaires ont une relation de tension-courant redressante vers l’extérieur et une résistance d’entrée plus élevée entre 0,5 et deux giga ohms. Cette figure montre les résultats représentatifs des enregistrements d’une paire de cellules horizontales coniques et d’une paire de cellules bipolaires coniques.

Dans chaque cas, la dépolarisation du cône à moins 10 millivolts à partir d’un potentiel de maintien de moins 70 millivolts a provoqué un courant calcique dépendant de la tension dans le cône et un postsynaptique rapide vers l’intérieur. Courant dans la cellule horizontale ou bipolaire Tranche rétinienne. Les préparations ont été utilisées dans des centaines d’études sur l’anatomie et la physiologie de la rétine.

Ils sont particulièrement avantageux pour examiner les réponses de plusieurs cellules simultanément, car ils facilitent l’enregistrement et l’imagerie de plusieurs cellules en même temps. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer la rétine, de couper de fines tranches rétiniennes, de les positionner dans la chambre d’enregistrement et d’obtenir des enregistrements en gros à partir de paires de soi synaptiquement connectés.