Name: Enrichissement de série de souches et des cellules progénitrices des spermatogonies (SSC) dans la culture de dérivation de long terme Lines adultes CSE de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: Découvrez la culture de long terme des cellules souches spermatogoniales de souris adulte. Cette méthode utilise des cellules nourricières inactivées pour maintenir et enrichir les lignées SSC in vitro.

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Ce travail a été soutenu par le ministère État de New York de la Santé (C026878). MS était à New York Stem Cell Foundation Fellow Druckenmiller. Soutenu en partie par subvention de recherche n ° 5 FY11-571 de la Mars of Dimes Foundation.

1. Préparation de cellules nourricières Notez que tous les réactifs décrits ci-dessous doivent être préparés de manière stérile (voir les tableaux 1 et 2). Ce protocole utilise la lignée cellulaire JK1 (Cell Biolabs, Inc, catalogue # ABC-315) que les mangeoires qui est un dérivé de transformer des cellules adultes de souris somatiques testiculaires et a été décrit ailleurs 3. Notez également que toutes les procédures sur les animaux doit être effectuée conformément aux directives et règlements institutionnels. <ol><li> JK1 cellules peuvent être maintenues en culture et utilisées avec succès comme dispositifs d&#39;alimentation à passage 39. Culture JK1 cellules dans une boîte de 100 mm de culture cellulaire (BD Falcon, catalogue n ° 353003) avec 10 ml de milieu de croissance d&#39;alimentation stérilisée par filtration (DMEM supplémenté avec 10% de sérum bovin foetal [FBS], 2 mM de L-glutamine et des antibiotiques). Lorsque la culture atteint la confluence de 95%, divisez les cellules 1:06 -1:10 rapport. </li><li> Éliminer le milieu de confluence JK1 mono cellules nourricièrescouche. </li><li> Laver couche de cellules une fois avec du PBS sans calcium ni magnésium. </li><li> Ajouter préchauffé trypsine / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM d&#39;EDTA; Cellgro Corning, catalogue n ° 25-051-CI), et incuber à 37 ° C pendant 5-10 min. </li><li> Inactiver la trypsine avec un volume égal de milieu de croissance chargeur. Recueillir des cellules et centrifuger à 300 xg pendant 5 min. Remettre en suspension les cellules dans un milieu de croissance chargeur. </li><li> Pré-manteau plaques multi-puits culture cellulaire en ajoutant suffisamment de 0,4% solution de gélatine pour couvrir le puits et retirer au bout de 5 min à température ambiante. </li><li> Plaque ~ 250 cellules par mm 2 de gélatine revêtu plaque de culture cellulaire (par exemple le format 48-puits ou 6-puits). Incuber la culture à 37 ° C pendant 16 à 24 heures. </li><li> Retirer milieu de culture à partir de puits. ATTENTION: Pour désactiver la croissance des cellules, ajouter une nouvelle solution de mitomycine C à 10 pg / ml dilué dans du DMEM à chaque puits (par exemple, 200 pl / puits d&#39;une plaque de 48 puits). Mitomycine C est toxique. Manipulez et jetez-le avec soin. Incuber à37 ° C pendant 4 h. </li><li> Retirer la mitomycine C solution de cellules. Laver 3 fois avec du DMEM avant des cellules souches de placage. </li><li> Retirer du DMEM à partir de cellules nourricières puits et ajouter suffisamment de support de cellules souches (100 pl / puits d&#39;une plaque 48 puits, voir le tableau 3) pour éviter la dessiccation des mangeoires au cours de passages. Ajouter SSC Le même jour, tel que décrit ci-dessous dans les sections 3.1 ou 3.4, avec des tailles indiquées de puits contenant des mangeoires. </li></ol> 2. Dissociation de la souris testicule tissu pour obtenir des cellules germinales des bailleurs de fonds <ol><li> Testicules de souris adultes récolte de façon stérile et stocker temporairement les testicules dans un plat recouvert de Petri (sans ajout de liquide). Le plat doit immédiatement placé sur la glace pour empêcher la dessication et de maintenir la viabilité des cellules. </li><li> En utilisant une pince fine stériles et un ciseau bien dans une hotte de culture cellulaire, faire une incision transversale dans la tunique albuginée sans complètement sectionnant le testicule (c.-à-cut ~ ½ - ¾ à distance through) et utiliser une pince pour faire sortir les tubes séminifères dans un coin de la plaque; tunique de défausse et tissus ci-joint. Gardez la plaque sur la glace tout au long de garder les tissus réfrigérés, et sauvegardent ainsi leur intégrité et prévenir l&#39;évaporation. </li><li> Rapidement émincer tubules avec des ciseaux à ressort fines au moins 3 min par les testicules, tout en gardant la plaque sur la glace. </li><li> Ramassez les fragments de tubules dans un tube conique de 50 ml et laver à ~ 40 ml de sérum de veau glacée PBS / 1% d&#39;albumine. </li><li> Centrifuger à 60 g pendant 10 minutes pour séparer les fragments de tubules de spermatozoïdes et de débris. Rejeter le surnageant. </li><li> Dans un tube de 15 ml conique, remettre en suspension le culot dans 3 ml par de testicule préchauffé tampon de dissociation (DMEM, la trypsine 0,05%, 0,03% collagénase de type I, 80% d&#39;U / ml de DNAse I et la sérum albumine bovine 0,5; Voir Tableau 2 pour des détails plus spécifiques de tampon de dissociation). </li><li> Placer le tube conique horizontalement dans un support en un ensemble agitateur à 150 tours par minute à 37 ° C pendant 15 min afin de maximiser unegitation. </li><li> Centrifuger à 60 g pendant 10 minutes pour séparer les cellules individuelles de morceaux non dissociées. </li><li> Enregistrer les morceaux culot contenant jusqu&#39;à l&#39;étape suivante. Recueillir le surnageant de l&#39;étape 2.8 et ajouter 3 ml DMEM/10% de sérum de veau foetal à neutraliser tampon de dissociation. Placer le tube sur la glace temporairement. </li><li> Répétez l&#39;étape 2,6 à 2,7 avec le culot de l&#39;étape sauvé 2,9 à re-digérer les morceaux restants après l&#39;étape 2.8. </li><li> Ajouter un volume égal de DMEM/10% de FBS pour neutraliser tampon de dissociation. </li><li> Suspension de l&#39;étape recombinent avec suspension cellulaire 2,11 sauvegardé à l&#39;étape 2.9. Centrifuger pendant 5 min à 300 x g. </li><li> Resuspendre le culot dans un milieu de cellules souches dans un volume de 16 ml par paire de testicules (voir le tableau 3). </li></ol> 3. Placage de suspension de cellules testiculaires <ol><li> Planche 2 ml de suspension cellulaire par puits dans des cellules de 6 puits plaque d&#39;alimentation contenant mitotiquement-inactivé par la mitomycine C et placer dans un incubateur de culture cellulaire à 37 ans &amp;deg; C dans 5% de CO 2. </li><li> Après 48 heures, moyen aspiration, ajouter 2 ml de milieu frais et revenir à l&#39;incubateur. </li><li> Après 48 heures, on ajoute 0,5 ml de milieu frais de cellules souches dans chaque puits et retourner à l&#39;incubateur. </li><li> Après 48 heures, puis nourrir les cellules trois fois par semaine par la suite jusqu&#39;à ce que suit grandes colonies discrètes (&gt; 50 cellules) semble (dans les 7 à 21 jours). Pour la première et la deuxième nourrir chaque semaine (par exemple le lundi et le mercredi) supprimer ~ 50% de la moyenne et rajouter 50% en volume de milieu frais. Pour l&#39;alimentation du tiers (par exemple vendredi), aspirer tout moyen et remplacez-le par 2 ml de milieu frais. Cette approche est basée sur l&#39;idée que l&#39;évitement des changements de milieu complet minimise les fluctuations dans les concentrations de signaux paracrines qui sont sécrétées dans le milieu de culture 9. </li></ol> 4. Cueillette colonie de Premier Passage <ol><li> Retirer moyen de puits contenant des colonies à être repiquées et ajouter du milieu frais sur les cellules souches. </li><li> Identifier les colonies en utilisant un objectif 10x. Avec le microscope légèrement défocalisé, les colonies SSC au bord du puits apparaît comme homogènes amas brillants, composées de nombreuses cellules 11-12 pm de diamètre, dans laquelle il est difficile, voire impossible, de discerner les bordures des cellules individuelles, puisque les cellules apparaissent fusionnés (figure 1A). Non-SSC colonies peuvent apparaître plus foncées, plus granulaire, ou moins homogène, avec des frontières discernables (figure 1A, en médaillon). </li><li> En utilisant une pointe de pipette 200 ul, avec l&#39;ensemble pipetteman à 50 pi, tout d&#39;abord prendre moyennes du puits et expulser pour mouiller la pointe. Ensuite, pousser gentiment la colonie avec la pointe avant de retirer rapidement 50 ul de milieu de déloger la colonie par aspiration dans la pointe (figure 1B). </li><li> Expulser le milieu contenant la colonie dans un puits d&#39;une plaque à 48 puits contenant des cellules nourricières inactivées avec 100 ul de milieu de cellules souches (figure 1C). </li><li> Répétez l&#39;étape4.3 et ajouter jusqu&#39;à 8 colonies au même puits sans excéder 500 pi par puits. </li><li> Répétez les étapes 4,3 à 4,5 pour préparer d&#39;autres puits de la plaque de 48 puits avec des colonies de passage SSC un. </li><li> Wells sera prêt à diviser en 7-14 jours ou après de grosses touffes de jusqu&#39;à 500 cellules ont vu le jour (figure 1D). </li></ol> 5. L&#39;expansion ultérieure et repiquage des SSC par trituration <ol><li> Cellules à passage ne doit être repiquée sur mangeoires frais après un maximum de 14 jours à un rapport de division de 1:2 pour les 3 premiers passages, puis 01 heures 04-01:06 (tous les 7 jours) par la suite comme suit. Doucement triturer colonies hors d&#39;un puits semi-confluente (par exemple ~ 300.000 SSC / puits de 6-puits) avec une pointe de pipette 1 ml de milieu de lavage à travers les cellules. Les colonies peuvent être vus se détacher. Trop de force avec le courant de liquide pourrait causer des cellules nourricières indésirables à se détacher aussi. </li><li> Recueillir des cellules triturées dans un tube conique et centrifuger à 300 xg pendant5 min. Remarque: Une étape trypsination peuvent être ajoutés en toute sécurité ici si désiré par l&#39;investigateur. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de cellules souches frais en fond de pipetage de haut en bas de perturber les colonies. </li><li> SSC plaque sur des cellules nourricières inactivées fraîchement préparés avec de la mitomycine-C, comme décrit dans la section 1. </li><li> Nourrir les cellules trois fois par semaine comme suit. Pour l&#39;alimentation premier et le deuxième (par exemple le lundi et le mercredi) ajouter 50% en volume de milieu frais. Pour l&#39;alimentation du tiers (par exemple vendredi), aspirer tout moyen et remplacez-le par 2 ml de milieu frais. Plaques deviendra confluente dans les 7-10 jours. Les cultures doivent être composé de cellules germinales&gt; 98% (c.-à &lt;1% contaminants cellules somatiques) après des passages 5-7, basé sur immunomarquage (par exemple en utilisant la souris sur les cellules germinales marqueur GCNA) pour distinguer les cellules germinales à partir de cellules somatiques 10. Remarque: Ces méthodes ont été développées dans le respect des règlements et des exigences fixées par l&#39;institutionprotection des animaux et le Comité al utilisation au Weill Cornell Medical College. </li></ol>

<ol><li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li>
<li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125%2B+germline+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li>
<li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD34%2B+testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li>
<li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li>
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<li>Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+mouse+male+germ+line+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro.</a> Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).</li>
<li>Csaszar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells+by+automated+control+of+inhibitory+feedback+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling.</a> Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).</li>
<li>Enders, G. C., May, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmentally+regulated+expression+of+a+mouse+germ+cell+nuclear+antigen+examined+from+embryonic+day+11+to+adult+in+male+and+female%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female.</a> 163, 331-340 (1994).</li>
<li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+spermatogonial+stem+cell+self-renewal+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).</li>
<li>Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spermatogenesis+following+male+germ-cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Spermatogenesis following male germ-cell transplantation.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).</li>
<li>Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+Cell+Transplantation+and+Testis+Tissue+Xenografting+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice.</a> J. Vis. Exp. (60), e3545(2012).</li>
<li>Arnold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox2%28%2B%29+adult+stem+and+progenitor+cells+are+important+for+tissue+regeneration+and+survival+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice.</a> Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).</li>
<li>Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+short-term+in+vitro+assay+for+mouse+spermatogonial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells.</a> Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).</li>
</ol>

MS reçoit des redevances d&#39;Weill Cornell Medical College grâce à une licence to Cell Biolabs, Inc pour distribuer JK1 cellules.

Cette méthode pour dériver SSC adultes utilisant des cellules nourricières testicule adulte dérivés est robuste et a réussi quand communs origines génétiques (par exemple FVB, C57BL6 et 129SV/C57Bl/6 mixte) et différentes souches mutantes ont été utilisées 2,3,7,14. En fait, le micro-environnement créé par le système de culture est suffisante pour surmonter certains des obstacles génétiques au maintien SSC adultes in vivo (par exemple dans le cas de PLZF - / - an...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluant pour tampon de dissociation </td></tr><tr><td> Trypsine / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-CI </td><td></td></tr><tr><td> Milieu de base de cellules souches (StemPro-34) </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td> Nécessite une complémentation selon Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> Tige suppléments moyen de cellules </td><td> divers </td><td> voir le tableau 3 </td><td> Nécessite une complémentation selon Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 cellules </td><td> Cellule Biolabs, Inc </td><td> ABC-315 </td><td> Peuvent se substituer aux cellules stromales adultes testiculaires que par Seandel et al. (2007) </td></tr><tr><td> mitomycine-C (ATTENTION) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4287 </td><td> Toxique; manipuler avec précaution. </td></tr><tr><td> Gélatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> Solution à 0,4% dans l&#39;eau </td></tr><tr><td> EVOS xl numérique microscope inversé </td><td> Groupe de microscopie avancée </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 1. Réactifs et équipements spécifiques. * Voir le tableau 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Diluant pour tampon de dissociation </td></tr><tr><td> trypsine (1:250) </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td> Tampon de dissociation: Final 0,05% p / v </td></tr><tr><td> collagénase, de type I, 235 U / ml </td><td> Worthington </td><td> CLS1 235 </td><td> Tampon de dissociation: Final 0,03% p / v </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Sigmun-Aldrich </td><td> DN25 </td><td> Tampon de dissociation: Final 80 U / ml </td></tr><tr><td> sérum albumine bovine </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE-100g </td><td> Tampon de dissociation: Final 0,5% p / v </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Tampon de dissociation </td></tr><tr><td> StemPro-34 GDF </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 supplément nutritif </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> Des frais supplémentaires ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Non-acides aminés essentiels </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM vitamine solution </td><td> Life Technologies </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> sérum albumine bovine </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> Antibiotique-antimycotique Solution </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8769 </td><td> 6 mg / ml </td></tr><tr><td> β-estradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E2758 </td><td> 30 ng / ml </td></tr><tr><td> progestérone </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 ng / ml </td></tr><tr><td> sérum de veau fœtal </td><td> variable </td><td> n / a </td><td> 1% </td></tr><tr><td> holo-transferrine bovine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1283 </td><td> 100 pg / ml </td></tr><tr><td> insuline </td><td> Gémeaux Bioproduits </td><td> 700-112P </td><td> 25 pg / ml </td></tr><tr><td> GDNF humain </td><td> Vie Technologies </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF humain </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> EGF de souris </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> putrescine </td><td> Biologique Recherche </td><td> 0778P </td><td> 60 uM </td></tr><tr><td> sélénite de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> acide pyruvique </td><td> Alfa Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 pg / ml </td></tr><tr><td> Acide DL-lactique </td><td> JT Baker </td><td> 0196-04 </td><td> 1 pg / ml </td></tr><tr><td> β-mercaptoéthanol </td><td> Life Technologies </td><td> 21985-023 </td><td> 50 pM </td></tr><tr><td> l&#39;acide ascorbique </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> 100 pM </td></tr><tr> &lt;td&gt; D-biotine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4639 </td><td> 10 pg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 3. Tige milieu cellulaire </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Remarque: Ajoutez les suppléments ci-dessous avant d&#39;utiliser à moyen terme. Stériliser par filtration et le conserver à 4 ° C. Le milieu est stable pendant au moins 2 semaines. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** Nous avons utilisé différents fabricants, les formulations, et / ou des numéros de lot de ces réactifs, sans effets délétères apparents. En général, les réactifs de culture de cellules de qualité doivent être employées. </td></tr></tbody></table>

enrichissement de série de souches et des cellules progénitrices des spermatogonies (ssc) dans la culture de dérivation de long terme lines adultes cse de souris

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonies souches et des cellules progénitrices (CSP) du testicule représentent un exemple classique de cellules souches adultes de mammifères et préserver la fertilité de près la vie de l&#39;animal. Bien que les mécanismes précis qui régissent l&#39;auto-renouvellement et la différenciation in vivo sont difficiles à l&#39;étude, différents systèmes ont été développés précédemment pour propager SSC murins in vitro en utilisant une combinaison de milieux de culture spécialisées et cellules nourricières 1-3. Dans la plupart des incursions in vitro sur la biologie des SSC ont dérivé des lignées de cellules de nouveau-nés, probablement en raison de la difficulté d&#39;obtenir des lignées de cellules adultes 4. Toutefois, le testicule continue d&#39;évoluer jusqu&#39;à environ 5 semaines d&#39;âge dans la plupart des souches de souris. Au début des années période post-natale, des changements dramatiques se produisent dans l&#39;architecture du testicule et de la biologie à la fois somatique et les cellules spermatiques, y compris les changements dans les niveaux d&#39;expression de cellules souches multiples liésgènes. Par conséquent, la période néonatale lignées dérivées de CSE ne peut pas totalement récapituler la biologie des SSC adultes qui persistent après le testicule adulte a atteint un état d&#39;équilibre. Plusieurs facteurs ont entravé la production de lignées de CSE adultes historiquement. Tout d&#39;abord, la proportion de cellules souches fonctionnelles peuvent diminuer pendant l&#39;âge adulte, soit en raison de facteurs intrinsèques ou extrinsèques 5,6. En outre, comme avec d&#39;autres cellules souches adultes, il a été difficile pour enrichir SSC suffisamment partir de cellules adultes au total des testicules sans l&#39;aide d&#39;une combinaison de stratégies de tri immunosélection ou autres 7. Stratégies couramment utilisées comprennent l&#39;utilisation de souris cryptorchides comme source de cellules du donneur en raison d&#39;un ratio plus élevé de cellules souches à d&#39;autres types cellulaires 8. Sur la base de l&#39;hypothèse que l&#39;élimination des cellules somatiques de la culture initiale perturbe les interactions avec la niche de cellules souches qui sont essentiels pour la survie SSC, nous avons déjà développé des méthodes pour calculer l adulteines qui ne nécessitent pas immunosélection ou des donateurs cryptorchides mais plutôt employer l&#39;enrichissement de série des SSC de la culture, ci-après dénommés SESC 2,3. La méthode décrite ci-dessous implique une procédure simple pour dériver adultes lignes SSC en dissociant l&#39;adulte donneur de tubes séminifères, suivie par dépôt de cellules sur les départs constitués d&#39;une ligne de cellules stromales testiculaire (JK1) 3. Grâce passage en série, fortement adhérent, contaminant les cellules non germinales sont dépourvues de la culture à l&#39;enrichissement concomitant des SSC. Cultures produites de cette manière contiennent un mélange de spermatogonies à différents stades de différenciation, qui contiennent des SSC, basée sur le long terme la capacité d&#39;auto-renouvellement. Le point crucial de la méthode SESC est qu&#39;il permet SSC pour rendre le passage difficile de l&#39;auto-renouvellement in vivo à long terme d&#39;auto-renouvellement in vitro dans un micro-environnement radicalement différent, produit à long terme des lignes SSC, libre de contaminationcellules somatiques, et permet ainsi une manipulation expérimentale subséquente des SSC.

L&#39;apparition de passage à zéro de type sauvage, adultes colonies SSC après 7 jours est illustré à la figure 1. Tridimensionnelles colonies sont constituées d&#39;une couche de cellules plates fixées à des dispositifs d&#39;alimentation ou de la matrice extracellulaire subalterne déposés par les dispositifs d&#39;alimentation avec des couches multiples de SSC croissance sur le dessus. Bien SSC sains sont brillamment réfringente et uniformément de 11 à 12 um de diamètre, les bordures de cellule sont d...

Une méthode simple pour obtenir et maintenir la tige spermatogonies et des lignées de cellules souches de souris adultes est présenté ici. La méthode utilise des cellules nourricières en provenance du compartiment des cellules somatiques du testicule de souris adultes. Cette technique est applicable à des souches de souris communes, y compris transgénique, knock-out, et souris knock-in.

Enrichissement de série de souches et des cellules progénitrices des spermatogonies (SSC) dans la culture de dérivation de long terme Lines adultes CSE de souris

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des cultures à long terme de souris adultes, de spermatogonies, de cellules souches et de cellules progénitrices ou SSC. Pour ce faire, il faut d’abord préparer des cellules nourricières inactivées par un ton tonique. Ensuite, une suspension de cellules testiculaires est préparée par dissociation enzymatique du tissu testiculaire adulte.Ensuite, les cellules testiculaires sont plaquées sur les cellules nourricières pour permettre la formation de colonies SSC. La dernière étape de la procédure consiste à prélever manuellement les colonies de SSC présumées pour la sous-culture dans de petits puits de culture. En fin de compte, le renouvellement cellulaire à long terme et l’expansion des SSC sur de nombreux passages in vitro peuvent être confirmés par immunocoloration pour les marqueurs largement exprimés des cellules germinales ou plus spécifiquement des SSC.Et par analyse fonctionnelle par transplantation SSC in vivo. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car l’identification de petites colonies de SSC par microscopie de phase est extrêmement difficile. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de sélection des colonies sont difficiles à apprendre car il peut être difficile de voir les colonies SSC dans un contexte complexe d’autres types de cellules présentes dans les premiers stades des cultures.Pour commencer, préparez les cellules nourricières en cultivant des cellules JK dans une boîte de culture cellulaire de 100 millimètres avec 10 millilitres de milieu de croissance nourricier stérilisé par filtre. Lorsque la culture atteint 95 % de confluence, divisez les cellules dans un rapport de un à six à un à 10 en lavant d’abord les cellules une fois avec du PBS ne contenant ni calcium ni magnésium au préchauffage. Essayez la trypsine EDTA et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq à 10 minutes avec un volume égal de croissance nourricière.Réduisez la trypsine, collectez les cellules et centrifugez à 300 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, les cellules sont remises en suspension dans la croissance nourricière. Des plaques de culture cellulaire multi-puits préco moyennes en ajoutant suffisamment de solution de gélatine à 0,4 % pour couvrir le puits, incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, retirez toute plaque de solution excédentaire d’environ 250 cellules par millimètre carré dans les plaques enrobées de gélatine et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 16 à 24 heures. Ensuite, retirez le milieu de culture des puits. Ensuite, inactivez la croissance cellulaire en ajoutant une solution fraîche de mitomycine C.Incubez à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.Ensuite, retirez la solution de mitomycine C des cellules et lavez-les trois fois avec du DMEM. Après avoir retiré le lavage final du DMEM, ajoutez suffisamment de milieu de cellules souches pour éviter la dessiccation des mangeoires pendant l’emballage. Ajoutez temporairement des CSS le même jour après avoir récolté des testicules de souris adultes de manière stérile.Conservez-les dans une boîte de Pétri couverte et placez-les immédiatement sur de la glace pour éviter la dessiccation et maintenir la viabilité cellulaire dans une hotte de culture cellulaire. À l’aide d’une pince fine stérile et d’un ciseau fin, faites une incision transversale dans la tunique abia sans couper complètement les testicules et utilisez une pince pour presser les tubes séminifères dans un coin de la plaque tout en maintenant la plaque sur de la glace. À l’aide de ciseaux à ressort fins, frappez rapidement les tubules pendant au moins trois minutes par paire de testicules.Prélevez les fragments de tubules dans un tube conique de 50 millilitres et lavez-les dans environ 40 millilitres de 1 % BSA réfrigéré dans une centrifugeuse PBS à 60 fois G pendant 10 minutes. Pour séparer les fragments de tubules des spermatozoïdes et des débris, jetez le surnageant pour chaque paire de testicules. Resus suspend la pastille dans trois millilitres de tampon de dissociation chauffé librement.Placez le tube conique horizontalement dans une grille dans un agitateur réglé à 150 tr/min à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Pour maximiser l’agitation. Faites tourner à 60 fois G pendant 10 minutes pour séparer les cellules individuelles des morceaux non associés.Recueillir le surnageant dans un tube conique séparé de 15 millilitres contenant trois millilitres de DMEM 10 % FBS pour neutraliser le tampon de dissociation. Placez le tube sur de la glace, soumettez temporairement les morceaux non associés à un autre cycle de dissociation, suivi d’une neutralisation, et combinez le premier tube avec le deuxième tube centrifuger pendant cinq minutes à 300 fois. G resus.Suspendre la pastille dans un milieu de cellules souches à un volume de 16 millilitres par plaque testiculaire. Deux millilitres de suspension cellulaire par puits dans une plaque à six puits contenant des cellules nourricières. Inactivé mitotiquement avec de la mitomycine C.Incuber à 37 degrés Celsius dans 5 % de dioxyde de carbone après 48 heures.Aspirez le support. Ajoutez deux millilitres de milieu frais et remettez les échantillons dans l’incubateur. 48 heures plus tard.Ajoutez 0,5 millilitre de milieu de cellules souches fraîches dans chaque puits et retournez dans l’incubateur après 48 heures supplémentaires. Nourrissez les cellules trois fois par semaine comme suit, jusqu’à ce que de grandes colonies discrètes de plus de 50 cellules apparaissent pour l’alimentation et l’alimentation de routine. Deux. Retirez environ 50 % du milieu et ajoutez un volume équivalent de milieu frais pour le troisième. Alimentation.Aspirez tout le milieu sous un endroit avec deux millimètres de milieu frais. Après avoir remplacé le milieu par un milieu de cellules souches fraîches, les cellules ont d’abord utilisé des objectifs 10 x et 20 x pour identifier les colonies avec le microscope légèrement non focalisé. Les colonies de SSC au bord du puits apparaîtront comme des amas homogènes et brillants composés de nombreuses cellules de 11 à 12 microns de diamètre dans lesquelles il est difficile, voire impossible, de discerner les limites cellulaires individuelles.Comme les cellules semblent fusionnées, les colonies non SSE peuvent apparaître plus foncées, plus granulaires ou moins homogènes avec des bords discernables. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres avec le pipette envoyé à 50 microlitres, prélevez le milieu du puits et expulsez-le pour mouiller la pointe. Ensuite, à l’aide de la pointe, poussez doucement la colonie avant de prélever rapidement 50 microlitres de milieu pour déloger la colonie par aspiration dans la pointe, expulsez le milieu contenant la colonie dans un puits d’une plaque de 48 puits contenant des cellules nourricières inactivées avec 100 microlitres de milieu de cellules souches.Ajoutez jusqu’à huit colonies dans le même puits sans dépasser 500 microlitres par puits et préparez des puits supplémentaires de la plaque de 48 puits. Avec le passage d’une colonie SSC en sept à 14 jours, ou après l’émergence de grands amas allant jusqu’à 500 personnes, les puits seront prêts à se diviser en cellules de sous-culture lors de ce passage. Un sur des faders frais.Utilisez une pointe de pipette d’un millilitre pour bien mélanger les colonies d’un semi-confluent en lavant doucement le milieu sur les cellules pour détacher les colonies sans déranger les cellules nourricières indésirables. Collectez les cellules triturées dans un tube conique et centrifugez à 300 fois G pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans un milieu de cellules souches fraîches en pipetant soigneusement de haut en bas pour perturber les colonies.Plaquez les SSC sur des cellules nourricières fraîchement préparées inactivées avec la mitomycine C comme décrit précédemment dans cette vidéo, en les divisant dans un rapport de un à deux pour les trois premiers passages, puis de un à quatre à un à six. Par la suite, utilisez l’horaire de trois repas par semaine comme décrit précédemment. Les plaques devraient devenir confluentes au bout de sept à 10 jours après cinq à sept passages.Les cultures doivent être composées de plus de 98 % de cellules germinales montrées ici sont de passage. Après sept jours, les colonies tridimensionnelles sont composées d’une couche de cellules plates attachées aux mangeoires ou d’une matrice extracellulaire sous-jacente déposée par les mangeoires avec plusieurs couches de SSC poussant sur le dessus. Alors que les SSC sains sont des tuiles réfractaires brillantes et uniformément de 11 à 12 microns de diamètre, les limites cellulaires sont difficiles à distinguer et la taille des colonies peut être très variable, à la fois à l’intérieur du puits et entre les puits préparés à partir de différentes souris.Notez que la morphologie des cellules nourricières changera progressivement après le passage de DMEM 10 % au milieu de culture de cellules souches après inactivation avec la mitomycine C. On voit ici de grandes colonies de plus de 50 cellules qui sont transférées manuellement dans un nouveau puits. La structure noire est la pointe de la pipette à titre de comparaison. Les cellules d’alimentation JK one inactivées sont illustrées ici.En l’absence de SSC, de grandes colonies serrées seront présentes avant la sous-culture habituelle, comme le montre cette image, et peut-être étroitement ou faiblement ancrées à la surface sous-jacente. Avec de la pratique, ces colonies peuvent être collectées en tapotant ou en lavant doucement la plaque sans perturber gravement les cellules nourricières. En dessous, les colonies collectées peuvent être brisées mécaniquement en pipetant de haut en bas, ou en suivant cette procédure.D’autres méthodes, comme la greffe de cellules souches de spermatogonies, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la fraction de cellules germinales dans un ensemble particulier de conditions de culture qui représentent des SSC fonctionnels authentiques in vivo. Après avoir regardé cette vidéo, vous aurez une bonne compréhension de la façon d’identifier visuellement les colonies et d’établir des cultures à long terme.

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Enrichissement de série de souches et des cellules progénitrices des spermatogonies (SSC) dans la culture de dérivation de long terme Lines adultes CSE de souris

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