LeafJ: Un Plugin ImageJ pour semi-automatique de mesure Forme Feuille

L’objectif de cette procédure est d’automatiser la mesure de la forme des feuilles pour des expériences à haut débit. Pour ce faire, on dissèque d’abord les feuilles et on les imagerie à l’aide d’un scanner à plat. La deuxième étape de la procédure consiste à utiliser le plugin leaf J pour détecter et mesurer les feuilles.

La troisième étape consiste à préparer les feuilles pour la microscopie et à les photographier à l’aide d’un microscope composé. La dernière étape consiste à tracer les lignes de rupture de stock sur les images acquises à l’aide d’une tablette à écran tactile. En fin de compte, les résultats peuvent montrer des différences dans la forme des feuilles, la taille et le nombre de cellules grâce à cette combinaison d’analyse d’images.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est sa rapidité. C’est environ six fois plus rapide que la mesure manuelle. Les gens savaient que cette méthode pouvait avoir du mal à le faire, car le bon placement des feuilles est essentiel pour l’analyse en aval et le montage des feuilles sur les lames peut être techniquement difficile.

J’ai eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque j’ai réalisé que nous avions environ 15 000 feuilles à analyser, et que le faire à la main prendrait de nombreux mois et serait incroyablement ennuyeux. Un chercheur scientifique de mon laboratoire commence par préparer des feuilles de transparence de 8,5 x 11 pouces. Chaque feuille doit être divisée en cadres rectangulaires, suffisamment grands pour accueillir les feuilles d’une plante, effiler la deuxième feuille transparente sur la feuille imprimée pour servir de couverture pour empêcher les feuilles de se dessécher.

Étiquetez avec la plante, le génotype et l’état de croissance. Disséquez les feuilles des plantes de la 26e journée. Disposez les feuilles sur le transparent dans l’ordre tactique du plus jeune au plus âgé.

Positionnez les feuilles verticalement à l’intérieur du cadre sans toucher la bordure ni chevaucher d’autres feuilles. Sinon, des problèmes s’ensuivront Lors de l’analyse, il est important que les feuilles orientales ne se touchent pas verticalement, ne cadrent pas, ne se chevauchent pas avec les feuilles disposées. Sandwichez-les avec la deuxième feuille transparente vierge et une grille pour garder les feuilles à plat.

Générez ensuite une image à l’aide d’un scanner à plat d’une résolution d’au moins 600 points par pouce. Commencez par installer le plugin. Téléchargez l’image J et faites glisser le fichier leaf jja dans le dossier plugins de l’image J.Lorsque l’image J est utilisée, le plugin leaf J sera désormais disponible.

Procédez à l’ouverture du fichier d’image feuille dans l’image J.Assurez-vous que l’image J est de la version 1.45 s ou ultérieure. Divisez l’image en trois couches de couleur, rouge, vert et bleu en cliquant sur Couches de répartition des couleurs de l’image. Ensuite, appliquez un seuil à l’image dans le canal bleu.

Sélectionnez maintenant toutes les feuilles d’une plante à l’aide de l’outil de sélection rectangulaire, puis sélectionnez le plugin de feuille J. Le plugin va maintenant ouvrir une boîte qui permet de définir les différentes conditions de l’expérience, telles qu’un groupe expérimental et un génotype. Avant de continuer, modifiez ces options, puis sélectionnez les conditions pour les feuilles sélectionnées dans la région d’intérêt et fournissez un nom descriptif.

Appuyez sur Continuer et la feuille J tracera automatiquement le contour de chaque feuille avec une image de retour sur investissement unique. Les routines J s’adaptent à l’ellipse de la lame et calculent les axes majeurs et mineurs de cette ellipse si nécessaire. Modifiez les lignes de trace à partir de la fenêtre du gestionnaire de retour sur investissement.

Une tablette tactile connectée en tant que moniteur externe peut être utile pour cette procédure. Une fois les limites correctement définies, exécutez l’analyse en appuyant sur. D’accord, maintenant la feuille J produit la longueur des pétales et diverses géométries du limbe de la feuille.

Enfin, exportez les résultats de mesure et les informations associées vers une feuille de calcul. Après avoir scanné les feuilles, fixez-les dans F-A-A-F-A. Une feuille fixe peut être conservée à quatre degrés Celsius jusqu’à six mois.

Avancez d’une heure ou deux avant d’imager les feuilles pour éliminer les feuilles en remplaçant le fixateur de la FAA par une solution chlorhydrate. Une fois nettoyées, montez les feuilles sur des lames avec les trichomes vers le haut à l’aide d’un grossissement de 40 x sur une image au microscope composé, la couche de mesil du centre de chaque feuille de chaque côté de la veine principale, en évitant les cellules près des trichomes ou des veines. Pour éviter les difficultés de traitement d’image, il est important d’éliminer toutes les bulles d’air des diapositives lors du montage des vantaux et d’obtenir des images nettes à l’étape suivante.

Après avoir collecté les images souhaitées, ouvrez-en une dans l’image J et tracez les contours des cellules de feuille à l’aide de l’outil de gestion JROI d’image à l’aide de la tablette à écran tactile et d’un stylet. Il n’utilise pas le plugin LEAF J. Avant d’utiliser LEAF J pour l’expérimentation, la précision et la vitesse du plugin étaient comparées à celles d’un chercheur expérimenté. Total.

Leaf J a terminé 5,7 plus rapidement que les calculs manuels et la comparaison des données des deux méthodes a montré que les résultats étaient étroitement corrélés pour tous les paramètres mesurés des 3 532 comparés. Les points de données 172 étaient des valeurs aberrantes. Parmi ces valeurs aberrantes, 29 ont été causées par le plugin LEAF J, beaucoup moins que les 143 causées par l’erreur humaine.

Lors de la mesure manuelle, la feuille J a depuis été mise à jour pour réduire encore le nombre d’erreurs. S’appuyant sur les mesures de la LEAF J, il a été utilisé pour mesurer l’évitement de l’ombre à l’aide d’un modèle à effets mixtes. Le traitement et le nombre de feuilles étaient des effets fixes et la réplication était un effet aléatoire.

De nombreux paramètres ont été significativement affectés par le traitement de l’ombre. Alternativement, certains paramètres n’ont pas été significativement affectés par l’ombre. À l’aide d’une analyse imagée des paramètres cellulaires assistée par tablette, 67 génotypes d’Arabidopsis ANA ont été examinés, totalisant 8 629 cellules provenant de 877 feuilles de 224 plantes.

Les génotypes ont ensuite été regroupés en six classes. La plupart des génotypes ont une taille et un nombre normaux de cellules. Cependant, plusieurs avaient des cellules de plus grande taille avec un nombre de cellules normal.

Bien qu’il soit important d’essayer cette procédure d’utiliser la randomisation et la conception expérimentale lorsque vous cultivez vos plantes, rappelez-vous que travailler avec du formaldéhyde et du chlorhydrate peut être extrêmement dangereux. Des précautions telles que le port de gants et le travail dans la hotte doivent donc être prises lors de cette procédure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer un criblage à haut débit des phénotypes de forme de feuilles et de cellules en utilisant vos propres conditions expérimentales Après cette procédure.

Des méthodes supplémentaires comme le séquençage de l’ARN peuvent être utilisées pour répondre à des questions telles que les gènes qui façonnent efficacement.