Application locale de médicaments pour l'étude des fonctions récepteur de l'acétylcholine nicotinique dans des tranches de cerveau de souris

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la fonction des canaux ioniques ligands dépendants dans les neurones à partir de coupes de cerveau préparées avec soin dérivées de souris adultes. Ceci est accompli en extrayant d’abord un cerveau intact d’une souris adulte qui a été trans Cardi perfusé avec du liquide céphalo-rachidien artificiel spécialisé. La deuxième étape consiste à préparer des coupes de cerveau de la région cérébrale d’intérêt dans l’orientation souhaitée.

Ensuite, des tranches de cerveau individuelles sont placées dans une chambre d’enregistrement sous le microscope et des neurones individuels à l’intérieur de la tranche sont identifiés pour l’enregistrement. La dernière étape consiste en l’enregistrement d’un neurone par patch de cellule entière, suivi de l’application locale de médicaments pour activer les canaux ioniques ligand-dépendants à l’aide d’une deuxième micropipette en verre. En fin de compte, cette méthode d’étude des canaux ioniques ligand-dépendants est utilisée pour montrer les propriétés biophysiques des récepteurs natifs sur les neurones vivants.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’application de bain ou l’administration de médicaments sur YouTube, est que l’administration du médicament au neurone enregistré est très rapide et localisée. De petites quantités de médicament peuvent être administrées et plusieurs neurones peuvent être étudiés à partir d’une seule tranche. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine, telles que la détermination des récepteurs nicotiniques natifs impliqués dans les réponses biophysiques, biologiques et comportementales des cellules à la nicotine.

Dans cette procédure, après avoir sacrifié une souris adulte et obtenu le cerveau, coupez le cerveau dans l’orientation souhaitée pour inclure la zone d’intérêt sur une plaque de métal glacée. Ensuite, fixez le bloc cérébral avec de la super colle sur la surface sèche de la scène d’une trancheuse vibrante. Ensuite, immergez le bloc cérébral dans une solution de récupération NMDG de quatre degrés Celsius et faites bouillir continuellement la solution avec du carbogène.

Coupez ensuite les tranches de 250 microns d’épaisseur chacune dans la zone cérébrale d’intérêt. Ensuite, tirez une micro-pipette patch standard avec une résistance de quatre à six méga ohms à l’aide de l’extracteur brun flamboyant programmable. Remplissez la micropipette avec une solution d’enregistrement intracellulaire appropriée.

Ensuite, transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement sur la platine d’un microscope vertical, fusionnez continuellement la tranche avec un écran standard d’enregistrement gazéifié de 32 degrés Celsius à une dose de 1,5 à 2,0 millilitres par minute. Au microscope, localisez et centrez la zone cérébrale d’intérêt à l’aide d’un objectif aérien 10x. Après cela, visualisez les neurones individuels à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau proche infrarouge 40x connecté à l’optique de contraste interférentiel différentiel IR, et d’un dispositif à couplage chargé proche infrarouge à grande vitesse ou d’une caméra vidéo CCD Sous observation IR DIC, les neurones sains présentent une membrane plasmique gris clair lisse après la visualisation cellulaire.

Effectuer l’enregistrement de cellules entières à l’aide de techniques conventionnelles. Tirez maintenant une autre micropipette standard comme précédemment pour produire deux pointes sœurs identiques à partir du même morceau de verre avec une résistance optimale d’environ cinq méga ohms. Remplissez l’une des micropipettes avec la solution de médicament diluée dans un étalon gazeux en enregistrant Un LCR pointe la pointe vers le bas et actionne la micropipette remplie de médicament pour éliminer les bulles d’air emprisonnées dans la micropipette.

Ensuite, montez la micropipette remplie de médicament dans un porte-pipette fixé au manipulateur microm. Le porte-pipette doit être relié à la tubulure à un système d’éjection sous pression approprié. Éjectez manuellement la pression trois à quatre fois vers la micro-pipette afin d’accumuler une pression adéquate derrière la colonne de fluide.

Abaissez ensuite la pipette de médicament dans la tranche à l’aide du manipulateur microm à l’aide de I-R-D-I-C. Observation. Positionnez la micropipette à la surface de la tranche de tissu. Exécutez une éjection par pression et surveillez le voisinage de la pointe pour détecter tout mouvement de débris lié à l’éjection et à la pointe de la micro-pipette.

Pour tout signe que l’embout est bouché ou bloqué, si l’embout est bouché, rétractez la pipette et remplacez-la par une neuve. Approchez-vous de la cellule enregistrée en diagonale à partir du haut de la tranche. Lorsqu’elle est en position finale, l’extrémité de la pipette remplie de médicament se trouve dans le même plan focal que la cellule enregistrée et l’extrémité de l’électrode d’enregistrement, et elle se trouve à environ 10 à 40 microns de la cellule enregistrée.

Si l’extrémité de la pipette remplie de médicament se trouve au-dessus de la cellule enregistrée, la force de l’éjection de pression pourrait perturber l’étanchéité giga de la cellule, puis enregistrer l’acétylcholine et/ou la nicotine induit les courants cellulaires tout en maintenant les neurones en mode pince de tension. Bien que la réjection de la pression puisse être déclenchée manuellement lors de l’utilisation d’un pico spritzer trois pour des résultats plus reproductibles, il est conseillé de déclencher la réjection de la pression à l’aide du système d’acquisition et d’une impulsion TTL numérique. Pour améliorer l’expérience, le porte-pipette rempli de médicament peut être monté sur un traducteur électrique pizo unidimensionnel capable d’accepter une entrée de tension analogique, qui est ensuite monté sur le micromanipulateur de haute précision.

Un traducteur pizo électrique est utile car le mouvement de la pipette remplie de médicament à l’intérieur et à l’extérieur de la tranche, y compris le moment et la vitesse d’entrée, peut être plus facilement contrôlé et reproduit d’une expérience à l’autre. Ensuite, ajustez la tension à sa valeur maximale à l’aide du potentiomètre à commande manuelle de l’amplificateur à tension électrique pizo. À l’aide du micromanipulateur, positionnez la pipette remplie de médicament dans la tranche.

Rétractez la pipette en réduisant manuellement la tension à zéro sur l’amplificateur contrôlé par tension pazo électrique à l’aide d’un signal de sortie analogique du système d’acquisition d’enregistrement. Déplacez la pipette remplie de médicament dans la tranche avant que l’impulsion TTL d’éjection de pression ne se produise. Une fois l’impulsion produite, rétractez la pipette.

Cette figure montre la réponse représentative d’un neurone dopaminergique à 100 micromolaires d’acétylcholine appliquée localement, et cette figure montre la réponse représentative d’un autre neurone dopaminergique à 100 micromolaires de nicotine appliquée localement. Voici les potentiels d’action spontanée d’un neurone dopaminergique dans une tranche de cerveau de souris Alpha six L neuf prime S maintenue en mode de pince actuelle. L’application d’une micromolaire de nicotine à l’aide d’un rejet de pression de 250 millisecondes a induit des changements dans l’action, la vitesse de déclenchement potentielle et le potentiel de membrane au repos.

À l’aide de la recherche de seuil dans le logiciel P clamp, le taux de décharge instantané a été dérivé pour classer les neurones selon les types de réponse à l’acétylcholine : les neurones supérieurs individuels du colus. Dans une tranche de cerveau de souris Alpha six L neuf primes, on a été serré en tension, suivi de l’application locale d’une nicotine micromolaire par éjection de pression, les neurones de type un ont montré une augmentation des IPC. Après l’application de nicotine, les neurones de type deux ont présenté d’importants courants entrants et une augmentation des EPC en réponse à l’application de nicotine.

Le traducteur électrique Pizo offre une cohérence et protège contre les fuites de médicaments. Un neurone dopaminergique VTA dans une tranche de cerveau d’une souris Alpha six L neuf prime S a été enregistré en mode clap de tension. Lors de l’application d’une nicotine micromolaire, la pipette remplie de nicotine a été manœuvrée jusqu’à la position finale avant l’éjection par pression et rétractée après l’éjection à l’aide d’un traducteur pazo électrique.

Une deuxième réponse a été enregistrée deux minutes après la première pour démontrer qu’il n’y avait pas eu de désensibilisation N-A-C-H-R. Les expériences ont été répétées avec l’application de 10 micromolaires de nicotine. Encore une fois, aucune désensibilisation n’a été observée dans la deuxième réponse par rapport à la première.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en aussi peu que trois heures si elle est correctement faite. Dans certains cas, 10 à 15 neurones peuvent être étudiés à partir d’une seule tranche de cerveau en une journée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de positionner avec précision la pipette remplie de médicament pour maintenir un équilibre entre l’activation complète des récepteurs nicotiniques de surface et l’intégrité du joint giga.