Name: Application locale de médicaments pour létude des fonctions récepteur de lacétylcholine nicotinique dans des tranches de cerveau de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Découvrez l'application locale de médicaments pour étudier les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine dans des tranches de cerveau de souris adultes. Cette méthode combine le patch clamp et la micropipette pour une activation rapide et localisée des canaux ioniques.

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Ce travail a été soutenu par les Instituts Nationaux de Santé (NIH) DA030396 subvention. Merci aux membres du laboratoire Drenan de discussion utile et critique du manuscrit. Un merci spécial à Mi Ran Kim pour l&#39;assistance technique et Jonathan Thomas Ting pour obtenir des conseils en ce qui concerne les tranches de cerveau de souris adultes.

1. Préparation des solutions pour la préparation de tranches de cerveau et d&#39;électrophysiologie <ol><li> Solutions pour la préparation de coupes de cerveau ont été décrites précédemment 3, 4. Préparer la N-méthyl D-glucamine (NMDG)-en fonction de coupe et de récupération de la composition suivante (en mM): 93 N-méthyl D-glucamine, 2,5 KCl, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, HEPES 20, 25 glucose, 5 Na + ascorbate, 2 thiourée, 3 Na + pyruvate, 10 MgSO 4 • 7H 2 O, 0,5 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuster à 300-310 mOsm avec NMDG. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 10 N. <ol class="lalpha"><li> Dissoudre MgSO 4 • 7H 2 O et CaCl 2 • 2H 2 O dans de l&#39;eau millipore pour faire 2 solutions mères de chaque M. </li><li> Peser d&#39;autres composants dans l&#39;ordre indiqué et ajouter une fiole jaugée partiellement rempli d&#39;eau Millipore en remuant pour dissoudre. Une fois que tout est ajouté, remplissezfiole jaugée avec de l&#39;eau Millipore. </li><li> Mesurer le pH et l&#39;ajuster avec 10 HCl. </li><li> Mesurer l&#39;osmolarité et ajuster avec NMDG si nécessaire. </li></ol></li><li> Préparer HEPES maintien du liquide céphalorachidien artificiel (ACSF) ayant la composition suivante (en mM): NaCl 92, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 30 NaHCO 3, 20, 25 HEPES, 5 glucose Na + ascorbate, 2, 3 Na thiourée pyruvate +, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuster à 300-310 mOsm avec du saccharose. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 1 N ou NaOH. <ol class="lalpha"><li> Peser les composants dans l&#39;ordre indiqué et ajouter une fiole jaugée partiellement rempli d&#39;eau Millipore en remuant pour dissoudre. Une fois que tout est ajoutée, remplir fiole jaugée avec de l&#39;eau Millipore. </li><li> Mesurer le pH et ajuster avec NaOH ou HCl, si nécessaire. </li><li> Mesurer et ajuster l&#39;osmolarité de saccharose, si nécessaire. </li></ol></li><li> Préparer la solution étalon de aCSF enregistrement de la composition suivante (en mM): 124 NaCl, KCl 2,5, 1,2 NaH 2 PO 4, 24 NaHCO 3, 12,5 glucose, 2 MgSO 4 • 7H 2 O, 2 CaCl 2 • 2H 2 O. Ajuster à 300-310 mOsm avec du saccharose. Ajuster le pH à 7.3 à 7.4 avec HCl 1 N ou NaOH. </li></ol> 2. Préparation des tranches de cerveau aiguë <ol><li> Coupe de tranches de cerveau et de récupération sont effectuées comme décrit précédemment 3, 4. Plats bulle de cristal rempli de deux NMDG solution de récupération de l&#39;oxygène à 95% / 5% de CO 2 de gaz (carbogène), un plat sur ​​la glace, l&#39;autre à 33 ° C. </li><li> Une bulle de cristal plat rempli d&#39;HEPES maintien aCSF avec carbogène à température ambiante. </li><li> Anesthésier la souris adulte (âgée de 2 à 12 mois) avec du pentobarbital Na + (200 mg / kg, ip). Passez à la procédure lorsque l&#39;animal n&#39;a pas de réponse à un orteil-pincement. </li><li> Si nécessaire, couper la queue d&#39;un échantillon de tissu pour plus tard génotypagetion de l&#39;animal. </li><li> Ouvrez la cage thoracique, exposer le cœur, et serrer l&#39;aorte descendante. Lacérer l&#39;oreillette droite. </li><li> Transcardiaque perfuser animal avec 5-10 ml de 0-4 ° C NMDG-récupération de la solution. </li><li> Décapiter, détacher le cerveau et le placer dans 4 ° C NMDG-récupération de la solution pendant 1 min. </li><li> Sur une plaque de métal refroidi à la glace, couper le cerveau dans l&#39;orientation désirée (coronale, parasagittale, horizontal, etc) pour y inclure la zone d&#39;intérêt. </li><li> Fixez le bloc de cerveau avec de la colle à la surface de la platine à sec d&#39;une trancheuse vibrant (DSK-Zero 1; Dosaka), immerger le bloc du cerveau chez 4 ° C NMDG-récupération de la solution, et en continu la solution à bulles avec carbogène. </li><li> Couper les tranches de la zone du cerveau d&#39;intérêt. L&#39;épaisseur des tranches est de 200-400 um, en fonction de la zone du cerveau spécifique d&#39;intérêt, âge de l&#39;animal, et expérience à réaliser. </li><li> Immédiatement après la coupe, incuber les tranches souhaitées dans carbogenated, 33 ° C NMDG recouvrement des solutipendant exactement 12 min, puis transfert à carbogenated, HEPES température ambiante détenant solution pour une période initiale de 60 min. Après cette incubation 60 min, les tranches peuvent être utilisées pour l&#39;enregistrement. Tranches sont maintenus en solution HEPES maintien tout au long de la journée jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient utilisés pour l&#39;enregistrement. </li></ol> 3. Enregistrement de patch-clamp de neurones dans des tranches de cerveau <ol><li> Tirez une micropipette de raccordement standard avec un programmable Flaming-Brown extracteur (Sutter P-97 ou équivalent extracteur vertical). Pipettes qui sont optimales pour la formation de joint giga-ohms ont généralement une résistance de 4-6 MQ </li><li> Transfert d&#39;une tranche de la chambre d&#39;enregistrement (RC-27L, Instruments Warner) sur la platine d&#39;un microscope droit (Nikon PN-1). Continue superfuse (1,5 - 2,0 ml / min), la tranche avec carbogenated, enregistrement standard aCSF chauffée et maintenue à 32 ° C. En variante, des tranches peut être maintenu à la température ambiante. </li><li> Localisez et centre de la zone du cerveau d&#39;intérêt en utilisantun objectif 10X air (Nikon Plan Fluor 10X; NA 0,3; WD: 16 mm). </li><li> Visualisez les neurones individuels en utilisant un 40X proche infrarouge (IR) Objectif immersion dans l&#39;eau (APO Nikon 40XW; NA: 0,80; Roues motrices: 3,5 mm) relié à contraste d&#39;interférence différentiel IR (DIC) et un système optique à haute vitesse proche infrarouge dispositif couplé chargé caméra vidéo (CCD) (Hamamatsu C-7500). Sous IR-DIC observation, les neurones sains présentent une surface lisse, la membrane plasmique gris clair. </li><li> Remplir une micropipette avec une solution d&#39;enregistrement intracellulaire approprié. Pour la plupart des applications, nous utilisons la solution suivante (en mM): 135 gluconate de potassium, 5 EGTA, 0,5 CaCl2, MgCl2 2, 10 HEPES, 2 Mg-ATP, GTP et 0,1 (pH ajusté à 7,25 avec du Tris base, l&#39;osmolarité ajustée à 290 mOsm avec du saccharose). Établir un enregistrement de cellule entière d&#39;un neurone visualisées. </li></ol> 4. Application locale de médicaments à neurones de tranches <ol><li> Tirez une micropipette de raccordement standard de serrage comme décrit ci-dessus. Utilisationun extracteur pipette comme une Sutter P-97 qui produit deux «sœurs» identiques conseils de la même pièce de verre est avantageuse lorsque plusieurs solutions médicamenteuses doivent être utilisés sur la même cellule. Tailles de buses qui ont une résistance d&#39;environ 5 MW s&#39;ils ont été remplis avec la solution intracellulaire décrit ci-dessus sont optimales. </li><li> Remblai de la micropipette avec une solution de médicament dilué dans carbogenated, aCSF enregistrement standard. Pointer le bout vers le bas et secouez la micropipette remplie de médicaments pour éliminer les bulles d&#39;air piégées dans la colonne de solution. </li><li> Monter la micropipette remplie de médicament dans un support de pipette reliée à un tube de système d&#39;éjection de pression approprié, tel qu&#39;un Picospritzer III (General Valve Co.). Le porte-pipette doit être monté sur un micromanipulateur avec la même résolution que les manipulateurs couramment utilisé pour l&#39;enregistrement de patch-clamp (par exemple, Sutter MP-285). En outre, le manipulateur doit permettre un mouvement dans et hors diagonale de la tranche. Hommegressivement éjecter pression 3 à 4 fois dans la micropipette afin de faire monter la pression suffisant derrière la colonne de fluide. </li><li> Utilisation des commandes micromanipulateur, abaisser la pipette médicament dans la tranche tout en visualisant la pointe sous IR-DIC optique. Idéalement, on devrait identifier visuellement et au centre d&#39;un neurone à être enregistrés à partir, suivi par le positionnement de la pipette de drogue près de la cellule avant d&#39;abaisser la micropipette enregistrement dans la tranche. Le positionnement de la pipette de médicaments peuvent provoquer un déplacement du tissu dans le voisinage de la cellule enregistrée qui pourrait perturber l&#39;enregistrement si le médicament pipette est déplacée en position après l&#39;établissement d&#39;un joint d&#39;étanchéité gigaohm. </li><li> Utilisation de la vidéo IR, positionner la micropipette médicament à la surface supérieure de la tranche de tissu. Exécutez une pression d&#39;éjection et le moniteur 1) au voisinage de la pointe pour le mouvement des débris liés à l&#39;éjection, et 2) la pointe de la micropipette pour tous les signes que la buse est bouché ou bloqué. Si la pointe est bloqué / bouché, rétracter le pipette et le remplacer par un nouveau. </li><li> Approcher la cellule enregistrée en diagonale à partir de la partie supérieure de la tranche de telle sorte que lorsqu&#39;il est en position finale, l&#39;extrémité de la pipette est remplie de médicament 1) dans le même plan focal (ou légèrement inférieur) que la cellule enregistrée et l&#39;extrémité de l&#39;électrode d&#39;enregistrement , et 2) 10 à 40 um de la cellule enregistrée. Si la pointe de pipette remplie de médicament est enregistrée au-dessus de la cellule, la force de la pression d&#39;éjection pourrait perturber le joint gigaohm. </li><li> Enregistrer la réponse cellulaire désiré tout en maintenant la cellule en mode voltage imposé ou en mode pince de courant. Nous avons l&#39;habitude d&#39;enregistrer l&#39;acétylcholine et / ou à la nicotine a suscité des courants cellulaires tout en maintenant les neurones en mode voltage imposé. Bien que la pression d&#39;éjection peut être déclenchée manuellement lorsque vous utilisez un Picospritzer III, pour des résultats plus reproductibles, il est recommandé de déclencher l&#39;éjection sous pression à l&#39;aide du système d&#39;acquisition (Axon Digidata 1440 et pClamp 10,3) avec une impulsion TTL numérique. </li></ol> 5. ContrôleMicropipette la Drug-remplie avec un traducteur piézoélectrique <ol><li> Si possible, monter le support de pipette remplie de médicament à un traducteur piézo-électrique à une seule dimension (par exemple Piezojena PA-100 ou Burleigh PZM-150) qui est capable d&#39;accepter une entrée de tension analogique (encore une fois, à partir du système d&#39;acquisition), qui est ensuite monté sur le micromanipulateur de haute précision (Sutter MP-285). Un traducteur piézo-électrique est utile parce que le mouvement de la pipette remplie de drogue dans et hors de la tranche, y compris le calendrier et la vitesse d&#39;entrée / sortie, peuvent être plus facilement contrôlées et reproduites par une expérience à l&#39;. Lorsque l&#39;on étudie les nAChR, les effets de fuite de désensibilisation nicotine de la pipette remplie de médicament, ils doivent toujours se produire, sont réduits au minimum lorsque la pipette est déplacée uniquement à proximité de la cellule avec un traducteur piézo-électrique pour le moment de l&#39;éjection de pression. </li><li> L&#39;aide du potentiomètre à commande manuelle sur l&#39;amplificateur de commande de tension piézo-électrique, composez la tensionà sa valeur maximale. </li><li> À l&#39;aide du micromanipulateur, la position de la pipette remplie de médicament dans la tranche où la pipette est éjectée de son contenu sur la cellule enregistrée, et rétracter par la pipette manuelle réduire la tension de zéro sur l&#39;amplificateur de commande de tension piézo-électrique. </li><li> En utilisant un signal de sortie analogique à partir du système d&#39;acquisition d&#39;enregistrement, déplacer la pipette remplie de médicament dans la tranche sur une période de 250 ms 300 ms à partir de la pression d&#39;éjection avant TTL impulsion se produit. Rétracter la pipette sur une période de 250 ms, à partir 50 ms après l&#39;impulsion TTL extrémités. </li></ol>

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La méthode présentée dans cet article est généralement utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les préparations de tranches de cerveau. Cependant, il ya un certain nombre de facteurs qui vont affecter de manière significative la qualité et la reproductibilité des données expérimentales qui résultent de l&#39;utilisation de cette méthode. Par exemple, les courants évoqués sont très sensibles au diamètre de la pointe de la pipette remplie de médicament. Petits conseils provoquera des problèmes av...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Nom du réactif</strong</td&gt;<td<strong&gt; Société</strong</td&gt;<td<strongNuméro de catalogue&gt;</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; N-méthyl D-glucamine</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; M2004</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3911</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaH<sub&gt; 2</sub&gt; PO<sub&gt; 4</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9638</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaHCO<sub&gt; 3</sub</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S6014</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HEPES</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; H3375</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Glucose</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G5767</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Ascorbate</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A4034</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thiourée</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; T8656</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pyruvate</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P2256</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgSO<sub&gt; 4</sub&gt; • 7H<sub&gt; 2</sub&gt; O</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 230391</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CaCl<sub&gt; 2</sub&gt; • 2H<sub&gt; 2</sub&gt; 0</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 223506</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NaCl</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; S9625</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Na<sup&gt; +</sup&gt; Pentobarbital</td&gt;<td&gt; Produits pharmaceutiques Vortech</td&gt;<td&gt; 76351315</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gluconate de potassium</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G4500</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EGTA</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; E3889</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mg-ATP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; A9187</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; GTP</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; G8877</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DSK-Zero 1 vibrant trancheur</td&gt;<td&gt; Ted Pella, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-97 Flaming / Brown micropipette extracteur</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Chambre RC-27 Enregistrement</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TC-344B régulateur de chauffage perfusion</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640101</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<tdChauffe-eau Solution&gt; SH-27B</td&gt;<td&gt; Warner</td&gt;<td&gt; 640102</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nikon PN-1</td&gt;<td&gt; Nikon</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; C-7500 Caméra vidéo CCD</td&gt;<td&gt; Hamamatsu</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Picospritzer III</td&gt;<td&gt; Général Valve Co.</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MP-285 Micromanipulateur</td&gt;<td&gt; Sutter</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PA-100 Traducteur piézoélectrique</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 12V40 piézo amplificateur</td&gt;<td&gt; Piezosystem jena, Inc</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axopatch 200B</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Digidata 1440A</td&gt;<td&gt; Molecular Devices Corp</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

application locale de médicaments pour l&#39;étude des fonctions récepteur de l&#39;acétylcholine nicotinique dans des tranches de cerveau de souris

Local Application of Drugs to Study Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices

L&#39;usage du tabac entraîne de nombreux problèmes de santé, dont le cancer, les maladies cardiaques, l&#39;emphysème, et d&#39;AVC. La dépendance à la cigarette est un trouble neuropsychiatrique répandue qui découle des actions biophysiques et cellulaires de la nicotine sur les récepteurs nicotiniques de l&#39;acétylcholine (nAChR) dans le système nerveux central. Comprendre les sous-types de nAChR différentes qui existent dans les zones cérébrales concernées dépendance à la nicotine est une priorité majeure. Les expériences qui recourent à des techniques d&#39;électrophysiologie comme patch clamp de cellules entières ou de deux électrodes de potentiel imposé enregistrements sont utiles pour la caractérisation pharmacologique de nAChR d&#39;intérêt. NAChR cellules exprimant mammifères, tels que les cellules de culture tissulaire ou ovocytes de Xenopus laevis, sont physiquement isolés et sont donc faciles à étudier en utilisant les outils de la pharmacologie moderne. Beaucoup de progrès ont été réalisés en utilisant ces techniques, en particulier lorsque le récepteur cible était déjà connu unee ectopique expression a été facilement atteint. Souvent, cependant, il est nécessaire d&#39;étudier nAChR dans leur environnement naturel: dans les neurones dans des tranches de cerveau aiguë récoltés à partir des souris de laboratoire ou des rats. Par exemple, des souris exprimant &quot;hypersensible&quot; sous-unités nAChR tels que les souris L9&#39;A α4 α6 1 et les souris L9 2&#39;S, permettre une identification sans ambiguïté de neurones sur la base de leur expression fonctionnelle de la sous-unité de nAChR spécifique. Bien que la cellule entière enregistrements de patch-clamp de neurones dans des tranches de cerveau est fait de façon routinière par l&#39;électrophysiologiste qualifiée, il est difficile d&#39;appliquer localement des médicaments tels que l&#39;acétylcholine ou la nicotine à la cellule enregistrée dans une tranche de cerveau. La dilution de la drogue dans l&#39;superfusat (demande de bain) n&#39;est pas rapidement réversible et tube en U systèmes ne sont pas facilement adapté pour fonctionner avec des tranches de cerveau. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour appliquer rapidement nAChR activant les médicaments pour les neurones enregistrés chez les adultes mOuse tranches de cerveau. Standard de cellules entières enregistrements sont faits à partir de neurones en tranches, et une seconde micropipette remplie d&#39;un médicament d&#39;intérêt est manoeuvré en position près de la cellule enregistrée. Une injection d&#39;air sous pression ou de l&#39;azote inerte à l&#39;intérieur de la pipette remplie de médicament entraîne une petite quantité de solution de médicament devant être éjectée à partir de la pipette sur la cellule enregistrée. En utilisant cette méthode, nAChR médiées par les courants peuvent être résolus avec une précision milliseconde. Temps d&#39;application de drogue peut facilement être modifiée, et la pipette remplie de médicament peut être retiré et remplacé par une nouvelle pipette, permettant courbes concentration-réponse doit être créé pour un seul neurone. Bien que décrite dans le contexte de nAChR neurobiologie, cette technique devrait être utile pour étudier de nombreux types de canaux ioniques ligand-dépendants ou des récepteurs de neurones à partir de tranches de cerveau.

Dans nos expériences, nous avons l&#39;habitude d&#39;enregistrer à partir de la dopamine (DA) de production de neurones de l&#39;aire tegmentale ventrale (ATV) et la substantia nigra pars compacta (SNC). Dans voltage-clamp mode, application de pression de l&#39;acétylcholine ou la nicotine à ces cellules entraîne habituellement de façon rapide, courant vers l&#39;intérieur cation qui atteint pic entre 100-200 ms (figure 1A-B). Décroissance du courant est largement dictée par la diffusion du médicament ...

Dans cet article, nous décrivons une méthode utile pour étudier ligand-gated fonction des canaux ioniques dans les neurones du cerveau tranches isolés de manière aiguë. Ce procédé implique l&#39;utilisation d&#39;une micropipette remplie de médicament pour application locale de médicaments à des neurones enregistrés à l&#39;aide des techniques classiques de patch-clamp.

Application locale de médicaments pour l&#39;étude des fonctions récepteur de l&#39;acétylcholine nicotinique dans des tranches de cerveau de souris

Tobacco use leads to numerous health problems, including cancer, heart disease, emphysema, and stroke. Addiction to cigarette smoking is a prevalent ...

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la fonction des canaux ioniques ligands dépendants dans les neurones à partir de coupes de cerveau préparées avec soin dérivées de souris adultes. Ceci est accompli en extrayant d’abord un cerveau intact d’une souris adulte qui a été trans Cardi perfusé avec du liquide céphalo-rachidien artificiel spécialisé. La deuxième étape consiste à préparer des coupes de cerveau de la région cérébrale d’intérêt dans l’orientation souhaitée.Ensuite, des tranches de cerveau individuelles sont placées dans une chambre d’enregistrement sous le microscope et des neurones individuels à l’intérieur de la tranche sont identifiés pour l’enregistrement. La dernière étape consiste en l’enregistrement d’un neurone par patch de cellule entière, suivi de l’application locale de médicaments pour activer les canaux ioniques ligand-dépendants à l’aide d’une deuxième micropipette en verre. En fin de compte, cette méthode d’étude des canaux ioniques ligand-dépendants est utilisée pour montrer les propriétés biophysiques des récepteurs natifs sur les neurones vivants.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’application de bain ou l’administration de médicaments sur YouTube, est que l’administration du médicament au neurone enregistré est très rapide et localisée. De petites quantités de médicament peuvent être administrées et plusieurs neurones peuvent être étudiés à partir d’une seule tranche. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine, telles que la détermination des récepteurs nicotiniques natifs impliqués dans les réponses biophysiques, biologiques et comportementales des cellules à la nicotine.Dans cette procédure, après avoir sacrifié une souris adulte et obtenu le cerveau, coupez le cerveau dans l’orientation souhaitée pour inclure la zone d’intérêt sur une plaque de métal glacée. Ensuite, fixez le bloc cérébral avec de la super colle sur la surface sèche de la scène d’une trancheuse vibrante. Ensuite, immergez le bloc cérébral dans une solution de récupération NMDG de quatre degrés Celsius et faites bouillir continuellement la solution avec du carbogène.Coupez ensuite les tranches de 250 microns d’épaisseur chacune dans la zone cérébrale d’intérêt. Ensuite, tirez une micro-pipette patch standard avec une résistance de quatre à six méga ohms à l’aide de l’extracteur brun flamboyant programmable. Remplissez la micropipette avec une solution d’enregistrement intracellulaire appropriée.Ensuite, transférez une tranche dans la chambre d’enregistrement sur la platine d’un microscope vertical, fusionnez continuellement la tranche avec un écran standard d’enregistrement gazéifié de 32 degrés Celsius à une dose de 1,5 à 2,0 millilitres par minute. Au microscope, localisez et centrez la zone cérébrale d’intérêt à l’aide d’un objectif aérien 10x. Après cela, visualisez les neurones individuels à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau proche infrarouge 40x connecté à l’optique de contraste interférentiel différentiel IR, et d’un dispositif à couplage chargé proche infrarouge à grande vitesse ou d’une caméra vidéo CCD Sous observation IR DIC, les neurones sains présentent une membrane plasmique gris clair lisse après la visualisation cellulaire.Effectuer l’enregistrement de cellules entières à l’aide de techniques conventionnelles. Tirez maintenant une autre micropipette standard comme précédemment pour produire deux pointes sœurs identiques à partir du même morceau de verre avec une résistance optimale d’environ cinq méga ohms. Remplissez l’une des micropipettes avec la solution de médicament diluée dans un étalon gazeux en enregistrant Un LCR pointe la pointe vers le bas et actionne la micropipette remplie de médicament pour éliminer les bulles d’air emprisonnées dans la micropipette.Ensuite, montez la micropipette remplie de médicament dans un porte-pipette fixé au manipulateur microm. Le porte-pipette doit être relié à la tubulure à un système d’éjection sous pression approprié. Éjectez manuellement la pression trois à quatre fois vers la micro-pipette afin d’accumuler une pression adéquate derrière la colonne de fluide.Abaissez ensuite la pipette de médicament dans la tranche à l’aide du manipulateur microm à l’aide de I-R-D-I-C. Observation. Positionnez la micropipette à la surface de la tranche de tissu. Exécutez une éjection par pression et surveillez le voisinage de la pointe pour détecter tout mouvement de débris lié à l’éjection et à la pointe de la micro-pipette.Pour tout signe que l’embout est bouché ou bloqué, si l’embout est bouché, rétractez la pipette et remplacez-la par une neuve. Approchez-vous de la cellule enregistrée en diagonale à partir du haut de la tranche. Lorsqu’elle est en position finale, l’extrémité de la pipette remplie de médicament se trouve dans le même plan focal que la cellule enregistrée et l’extrémité de l’électrode d’enregistrement, et elle se trouve à environ 10 à 40 microns de la cellule enregistrée.Si l’extrémité de la pipette remplie de médicament se trouve au-dessus de la cellule enregistrée, la force de l’éjection de pression pourrait perturber l’étanchéité giga de la cellule, puis enregistrer l’acétylcholine et/ou la nicotine induit les courants cellulaires tout en maintenant les neurones en mode pince de tension. Bien que la réjection de la pression puisse être déclenchée manuellement lors de l’utilisation d’un pico spritzer trois pour des résultats plus reproductibles, il est conseillé de déclencher la réjection de la pression à l’aide du système d’acquisition et d’une impulsion TTL numérique. Pour améliorer l’expérience, le porte-pipette rempli de médicament peut être monté sur un traducteur électrique pizo unidimensionnel capable d’accepter une entrée de tension analogique, qui est ensuite monté sur le micromanipulateur de haute précision.Un traducteur pizo électrique est utile car le mouvement de la pipette remplie de médicament à l’intérieur et à l’extérieur de la tranche, y compris le moment et la vitesse d’entrée, peut être plus facilement contrôlé et reproduit d’une expérience à l’autre. Ensuite, ajustez la tension à sa valeur maximale à l’aide du potentiomètre à commande manuelle de l’amplificateur à tension électrique pizo. À l’aide du micromanipulateur, positionnez la pipette remplie de médicament dans la tranche.Rétractez la pipette en réduisant manuellement la tension à zéro sur l’amplificateur contrôlé par tension pazo électrique à l’aide d’un signal de sortie analogique du système d’acquisition d’enregistrement. Déplacez la pipette remplie de médicament dans la tranche avant que l’impulsion TTL d’éjection de pression ne se produise. Une fois l’impulsion produite, rétractez la pipette.Cette figure montre la réponse représentative d’un neurone dopaminergique à 100 micromolaires d’acétylcholine appliquée localement, et cette figure montre la réponse représentative d’un autre neurone dopaminergique à 100 micromolaires de nicotine appliquée localement. Voici les potentiels d’action spontanée d’un neurone dopaminergique dans une tranche de cerveau de souris Alpha six L neuf prime S maintenue en mode de pince actuelle. L’application d’une micromolaire de nicotine à l’aide d’un rejet de pression de 250 millisecondes a induit des changements dans l’action, la vitesse de déclenchement potentielle et le potentiel de membrane au repos.À l’aide de la recherche de seuil dans le logiciel P clamp, le taux de décharge instantané a été dérivé pour classer les neurones selon les types de réponse à l’acétylcholine : les neurones supérieurs individuels du colus. Dans une tranche de cerveau de souris Alpha six L neuf primes, on a été serré en tension, suivi de l’application locale d’une nicotine micromolaire par éjection de pression, les neurones de type un ont montré une augmentation des IPC. Après l’application de nicotine, les neurones de type deux ont présenté d’importants courants entrants et une augmentation des EPC en réponse à l’application de nicotine.Le traducteur électrique Pizo offre une cohérence et protège contre les fuites de médicaments. Un neurone dopaminergique VTA dans une tranche de cerveau d’une souris Alpha six L neuf prime S a été enregistré en mode clap de tension. Lors de l’application d’une nicotine micromolaire, la pipette remplie de nicotine a été manœuvrée jusqu’à la position finale avant l’éjection par pression et rétractée après l’éjection à l’aide d’un traducteur pazo électrique.Une deuxième réponse a été enregistrée deux minutes après la première pour démontrer qu’il n’y avait pas eu de désensibilisation N-A-C-H-R. Les expériences ont été répétées avec l’application de 10 micromolaires de nicotine. Encore une fois, aucune désensibilisation n’a été observée dans la deuxième réponse par rapport à la première.Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en aussi peu que trois heures si elle est correctement faite. Dans certains cas, 10 à 15 neurones peuvent être étudiés à partir d’une seule tranche de cerveau en une journée. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de positionner avec précision la pipette remplie de médicament pour maintenir un équilibre entre l’activation complète des récepteurs nicotiniques de surface et l’intégrité du joint giga.

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Spectral imagerie confocale de fluorescence tels taggés récepteurs nicotiniques dans souris knock-in avec l&#39;administration chronique de nicotine

Trafic membranaire neuronal contrôle dynamiquement la membrane plasmique disponibilité des protéines et un impact significatif sur la neurotransmission. À ce jour, il a été difficile de mesurer le trafic endocytose neuronale dans les neurones adultes. Ici, nous décrivons une méthode très efficace, quantitative pour mesurer les changements rapides dans l'expression des protéines de surface ex vivo dans des tranches de cerveau de courte durée.

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Découvrez l'application locale de médicaments pour étudier les récepteurs nicotiniques de l'acétylcholine dans des tranches de cerveau de souris adultes. Cette méthode combine le patch clamp et la micropipette pour une activation rapide et localisée des canaux ioniques.

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