Capillaire de travail lithographie pour l'ingénierie tissulaire cardiaque

L’objectif global de cette procédure est de produire des substrats de culture cellulaire biomimétiques pour modifier la structure et la fonction des tissus cardiaques macroscopiques. Ceci est accompli en fabriquant d’abord un master en silicone avec l’architecture topographique souhaitée par gravure ionique réactive profonde. La deuxième étape consiste à transférer le motif topographique souhaité du maître en silicium vers un moule PUA à l’aide de la lithographie par force capillaire assistée par UV.

Ensuite, le moule PUA est utilisé comme modèle pour fabriquer des substrats de culture cellulaire à partir de divers matériaux polymères en fonction de l’application souhaitée via une lithographie par capillarité assistée par UV ou par solvant. La dernière étape consiste à déposer des cardiomyocytes primaires ou dérivés de cellules souches sur les substrats de culture cellulaire à motif nanométrique pour une analyse ultérieure. En fin de compte, la microscopie à champ clair et à immunofluorescence est utilisée pour montrer les changements dans la morphologie cellulaire et l’arrangement contractuel des protéines dans les cardiomyocytes.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que l’impression par micro-contact, est que la lithographie par capillarité produit des sous-strats de culture cellulaire à motifs nanométriques qui peuvent induire l’alignement structurel des monocouches de tissu cardiaque sans dépendre de la prolifération ou de la migration cellulaire. Bien que cette méthode puisse être utilisée pour donner un aperçu de la relation structure-fonction des tissus cardiaques, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes tels que la mécanobiologie du cancer. Pour étudier l’impact de la topographie matricielle sur la migration cellulaire, commencez cette procédure en nettoyant la surface maîtresse en silicium avec de l’éthanol ou du xylène à 100 % et en la faisant sécher sous oxygène azote gazeux.

Ensuite, placez le motif maître en silicium côté vers le haut dans une boîte de Pétri pour un maître en silicium avec une pipette à motif de surface de deux centimètres sur deux centimètres de 40 microlitres de PUA. Placez ensuite une feuille de film polyester transparent de quatre centimètres sur quatre centimètres sur le PUA distribué, appuyez sur la feuille de PET et étalez le PUA sous la feuille sur la face du motif à l’aide d’un rouleau ou d’une surface à bord plat afin que l’ensemble du motif soit recouvert par le prépolymère PUA. Placez ensuite le prépolymère et le PET à environ 10 centimètres sous une lumière UV de 20 watts pendant 50 secondes.

Après le durcissement, retirez lentement le film PET à l’aide d’une pince. Le PUA doit se fixer au film PET avec un négatif du motif nano Silicon Master. Ensuite, polymérisez les nanomotifs P-U-A-P-E-T sous UV pendant au moins 12 heures avant de les utiliser.

Pour nettoyer les Silicon Masters, placez un autre film de PET sur le master sans ajout de PUA. Exposez-le à la lumière UV pendant 50 secondes et retirez le film PET. Rincez ensuite le master en silicone avec de l’éthanol à 100 % ou du xylène et séchez-le sous oxygène, azote gazeux.

Dans cette procédure, traitez des lames de verre circulaires de 18 millimètres de diamètre en les plaçant dans une chambre à ozone pendant 10 minutes. Ensuite, placez les lames sur des blocs de PDMS pour les fixer temporairement afin de faciliter leur manipulation. Ensuite, appliquez une couche d’apprêt pour verre sur la surface de la lame de verre.

Laissez l’apprêt sécher à l’air libre pendant 30 minutes. Placez maintenant les lames de verre sur une feuille de papier d’imprimante. Déposez 10 microlitres de prépolymère de polyuréthane au centre de chaque lame de verre et assurez-vous qu’aucune bulle n’est générée.

Placez ensuite le motif du moule PUA face vers le bas sur la lame de verre, dispersez uniformément le prépolymère PU sur la surface de la lame de verre en faisant rouler un rouleau cylindrique en caoutchouc le long du moule PUA. Le papier de l’imprimante absorbera le trop-plein de polymères, puis les durcira aux UV pendant 60 secondes sous une lampe UV de 20 watts. Par la suite, retirez l’échantillon de la source de lumière UV et décollez soigneusement le moule PUA de la lame de verre revêtue de PU La polymérisation du PU est considérée comme terminée.

Lorsque le moule PUA se décolle proprement de l’échantillon et que la lame de verre PU a un aspect irisé, placez les échantillons dans un dessécheur pour les stocker pendant un mois. Fixez maintenant les lamelles de recouvrement A NFS à une pipette en polystyrène de culture tissulaire de 35 millimètres et 20 microlitres de NOA au fond de la boîte. Placez délicatement la lamelle NPPU sur le NOA et laissez la colle s’étaler et couvrir tout le fond de la lamelle après avoir durci NOA en exposant le plat aux UV pendant 10 minutes.

Ensuite, stérilisez le NP SUBSTRATA en le rinçant deux fois avec deux millilitres de solution aqueuse d’éthanol à 70 % chacun pendant cinq minutes. Retirer l’éthanol par aspiration. Laissez l’A NFS sécher complètement à l’air libre pendant environ une heure sous la lampe de stérilisation UV dans l’enceinte de sécurité biologique.

Pour améliorer l’adhésion cellulaire, enrobez l’A NFS de fibronectine pendant la nuit en diluant d’abord la fibronectine dans de l’eau à cinq microgrammes par millilitre. Ensuite, pipetez deux millilitres de solution de fibronectine dans un plat. Placez ensuite l’A NFS dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant la nuit.

Procurez-vous des NR VM, des CMS HESC ou d’autres cellules cardiaques d’intérêt, centrifugez l’échantillon de cellules à 1000 tr/min pendant trois minutes pour granuler les cellules. Retirez soigneusement le surnageant par aspiration et assurez-vous de ne pas déranger la pastille. Après cela, remettez les cellules en suspension dans le milieu de culture à une concentration de 4,6 fois 10 à six cellules par millilitre.

Pipetez soigneusement 200 microlitres de suspension cellulaire sur l’A NFS stérilisé et assurez-vous que la suspension cellulaire reste sur la lamelle. Ensuite, placez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de CO2 pendant quatre heures pour permettre aux cellules de se fixer à l’A NFS. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu de culture chaud supplémentaire dans la boîte et placez à nouveau les cellules dans l’incubateur dans les mêmes conditions.

Après 24 heures, retirez le média et lavez-le deux fois avec deux millilitres de DPBS pour éliminer les cellules en excès. Après cela, ajoutez deux millilitres de milieu de culture chaud dans le plat. Placez les cellules dans un incubateur dans les mêmes conditions et culture.

Les cellules de confluence remplacent les milieux tous les deux jours. Cette figure montre les images représentatives en fond clair des VM NR après sept jours de culture et de CMS HESC. Après 48 heures de culture, les NR VM et les CMS HESC sur les surfaces NP montrent une anisotropie structurelle et un alignement évidents, tandis que les cardiomyocytes sur les surfaces du motif UN sont orientés de manière aléatoire.

L’analyse immunohistochimique met en évidence l’impact de la nanotopographie sur l’alignement du cytosquelette cellulaire, les microfilaments d’actine et l’actine alpha-sarcomérique dans les cellules cultivées sur le NFS A s’alignent le long des nano crêtes, mais restent distribués de manière aléatoire dans les cellules sur les substrats non structurés. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier de stériliser vos substrats avant l’installation des cellules, car la contamination peut être un gros problème après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en biologie cardiovasculaire pour explorer la maturation cardiaque et les cardiomyocytes dérivés de cellules souches.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire un substrat de culture cellulaire biomimétique par lithographie par force capillaire pour les applications d’ingénierie tissulaire cardiaque.