Name: Une seule molécule dimagerie du règlement Gene In vivo Utilisation de lactivation par clivage cotraductionnelle (COTRAC) (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Découvrez la méthode CoTrAC pour imager la production protéique dans les cellules vivantes d'E. coli avec une précision moléculaire unique. Cette technique permet d'observer les dynamiques des facteurs de transcription sans perturber leur fonctionnalité.

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Le plasmide exprimant pCG001 Ubp1 a été aimablement fourni par Rohan Baker à l&#39;École de gestion John Curtin de la recherche médicale. Ce travail a été financé par Mars des dix sous de subvention de recherche de 1 exercice 2011, Mars of Dimes Basil O&#39;Connor Starter Award de bourses de recherche n ° 5-FY20 et d&#39;attribution de la NSF CAREER 0746796.

1. Souche Ingénierie flux de travail <ol><li> Insérer séquences codant pour (a) une séquence de localisation membranaire, (b) une protéine de maturation rapide fluorescent et (c) une séquence de reconnaissance de protéase N-terminale à et en phase avec une protéine d&#39;intérêt (par exemple un facteur de transcription). Nous avons utilisé la membrane cible Tsr-Vénus reporter 2 et fusionnée à la séquence de reconnaissance de protéase ubiquitine (Ub) pour compter le nombre de bactériophage λ exprimées répresseur CI molécules de protéines. Détails sur la façon dont nous avons construit la protéine de fusion Tsr-Vénus-Ub-CI, en remplaçant le type sauvage CI région codante et en intégrant la construction dans la E. chromosome coli en utilisant λ Rouge recombinaison 3, sont décrits en détail dans la référence. 1. </li><li> Vérifiez toutes les modifications par séquençage. </li><li> Transformer un plasmide codant pour une protéase spécifique de la séquence de reconnaissance utilisé ci-dessus dans une souche exprimant la protéine rapporteur fluorescent et d&#39;intérêten fusion traductionnelle. Nous avons utilisé la protéase Ubp1, qui clive immédiatement après le résidu C-terminal de l&#39;ubiquitine 4. </li></ol> 2. Les cellules de la Culture et préparer l&#39;échantillon <ol><li> Choisissez un E. coli colonie d&#39;intérêt à partir d&#39;une plaque de gélose fraîchement striée en 1 ml médias M9 minimum 5 complété avec des acides aminés et MEM 1X antibiotiques appropriés. Incuber dans un shaker à la température désirée assez long pour atteindre OD 600&gt; 1,0 (densité optique à 600 nm). </li><li> Diluer la culture dans 1 ml de milieu M9 frais avec des antibiotiques appropriés à DO600 = 0,02. Incuber dans un shaker à la température appropriée. Densité cellulaire initiale peut être augmentée si nécessaire à la croissance à basse température. </li><li> Lorsque la DO 600 = 0,2 à 0,3 (à 37 ° C avec une culture cellulaire initiale à DO600 = 0,02, cela prendra 3-4 heures), commencer à préparer le gel d&#39;agarose tampon (étape 3). </li><li> Les cellules sont prêtes pour l&#39;imagerie lorsque OD <sub&gt; 600 = de 0.3 à 0.4. </li><li> Transférer 1 ml de culture incubé dans un tube de 1,5 ml, centrifuger à 10.000 xg pendant 1 min dans une centrifugeuse de paillasse. </li><li> Jeter le surnageant et ajouter 1 ml de milieu frais M9 et remettre en suspension le culot doucement. </li><li> Centrifuger à 10000 g pendant 1 min. </li><li> Répétez l&#39;étape 1,6 et 1,7. Jeter le surnageant. </li><li> Resuspendre doucement dans 1 ml de milieu M9. Les cellules peuvent être directement utilisés pour l&#39;imagerie microscope ou 10 diluée - à 100 fois pour garantir de faibles densités cellulaires pour l&#39;imagerie timelapse. Notez que de faibles densités cellulaires sont importantes pour l&#39;imagerie timelapse prolongée. La chambre de formation d&#39;image (étape 4) est rendue étanche lors de l&#39;expérience. En raison de la croissance exponentielle des cellules, les concentrations cellulaires initiales élevées peuvent sensiblement épuiser l&#39;oxygène à l&#39;intérieur de la chambre de croissance après prolongée dans le tampon de gel, ce qui réduit la maturation des protéines fluorescentes et affecter la croissance des cellules. </li></ol> 3. Préparer la solution d&#39;agarose <ol><li> Peser 10-20 mgà faible température de fusion d&#39;agarose dans un tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter le volume de milieu minimal M9 sans antibiotiques pour faire une solution à 3% d&#39;agarose. </li><li> Chauffer la solution d&#39;agarose pendant 30 min à 70 ° C pour faire fondre, retournant le tube pour que la solution soit complètement fondu et homogène. Le tampon de gel peut être versé à ce moment (étape 4) ou de la température peut être réduite à 50 ° C et maintenu pendant plusieurs heures pour une utilisation ultérieure. </li></ol> 4. Préparer Pad Gel sur la chambre <ol><li> Environ 50 min avant l&#39;imagerie, rincer une diapositive Microaqueduct avec de l&#39;eau. </li><li> Rincé une nettoyés couvercle en verre (en utilisant une méthode de nettoyage strictes telles que celle décrite dans 6) et Microaqueduct diaporama avec de l&#39;eau stérile et sécher par soufflage à l&#39;air comprimé. </li><li> Placer le joint d&#39;étanchéité en caoutchouc sur la lame Microaqueduct de manière à recouvrir les orifices d&#39;entrée et de sortie sur le côté de la lame de verre Microaqueduct (ceci peut être modifié pour des applications dansles supports qui sont perfusés à travers l&#39;échantillon). Appliquer 50 ul de solution d&#39;agarose (étape 3) au centre de la diapositive Microaqueduct. </li><li> Haut de la solution d&#39;agarose avec le nettoyage, couvercle en verre sec. </li><li> Laissez la solution d&#39;agarose reposer à température ambiante pendant 30 min. </li><li> Pendant ce temps, préparer un échantillon de cellules (étape 2). </li><li> Soigneusement détacher la vitre de protection de la partie supérieure du tampon de gel. Ajouter 1,0 ul de culture cellulaire lavée vers le haut de la poche de gel. Attendre ~ 2 min pour la culture d&#39;être absorbée par le tampon de gel. Il est important de ne pas attendre aussi longtemps que les overdries coussin de gel, mais suffisamment longue pour que les cellules sont correctement respectées le coussin de gel. Le temps d&#39;attente Idéal varie selon la température et de l&#39;humidité. </li><li> En attendant, une autre sécher couvercle en verre préalablement nettoyé. </li><li> Couverture de l&#39;échantillon avec la nouvelle vitre de protection en sorte que le verre de protection et Microaqueduct coulisseau sont bien alignés. </li><li> Assemblez la chambre de croissance à température contrôlée suivant les instructions du fabricant.Il peut maintenant être utilisé pour l&#39;imagerie de microscope (étape 5). </li></ol> 5. Imagerie et acquisition de films Timelapse <ol><li> Allumez le laser et du microscope en suivant les instructions du fabricant (par exemple, le laser peut être nécessaire de réchauffer pour ~ 0,5 h avant l&#39;expérience). </li><li> Verrouiller la chambre assemblé à l&#39;insert de phase sur le microscope. Régler la température de la chambre de croissance et le chauffe-objectif à 37 ° C ou autre température de croissance souhaitée. </li><li> Si l&#39;imagerie dessus de la température ambiante, la mise au point ou coussin de gel est généralement dériver de façon significative pour ~ 15 min après le changement de température initiale. Dans la pratique, utiliser ce temps pour trouver des régions d&#39;intérêt et modifier des scripts d&#39;imagerie que nécessaire pour une expérience. </li><li> Trouver des cellules sur le microscope et stocker la position de chaque cellule après son centrage à l&#39;intérieur d&#39;une région d&#39;imagerie prédéfinie et alignés. Plus d&#39;une cellule peut être imagé dans chaque fenêtre de temps d&#39;acquisition d&#39;image. Pour plus timelapse imagerie mdes générations, en sorte que les cellules de représentation sont initialement séparés à partir d&#39;autres cellules par au moins quelques centaines de micromètres de telle sorte que les autres colonies n&#39;entrera pas dans la région de formation d&#39;image en cours de croissance. </li><li> Réglez l&#39;intensité d&#39;excitation laser de sorte que la quasi-totalité des molécules fluorescentes photoblanchiment dans les 6 expositions (figure 5). </li><li> Utilisation d&#39;un script automatisé d&#39;imagerie / journal, l&#39;acquisition de données timelapse en utilisant l&#39;algorithme décrit dans le flux de travail expérimental sur la figure 3. </li></ol>

<ol><li>Hensel, Z., Feng, H. D., Han, B., Hatem, C., Wang, J., Xiao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+expression+dynamics+of+transcription+factor+revealed+by+single-molecule+noise+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic expression dynamics of transcription factor revealed by single-molecule noise analysis.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19, 797-802 (2012).</li>
<li>Yu, J., Xiao, J., Ren, X., Lao, K., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Gene+Expression+in+Live+Cells%2C+One+Protein+Molecule+at+a+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing Gene Expression in Live Cells, One Protein Molecule at a Time.</a> Science. 311, 1600-1603 (2006).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Tobias, J. W., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+Functional+Analysis+of+the+Ubiquitin-specific+Protease+Gene+UBP1+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and Functional Analysis of the Ubiquitin-specific Protease Gene UBP1 of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Biol. Chem. 266, 12021-12028 (1991).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+Cloning%3A+A+Laboratory+Manual%22">Molecular Cloning: A Laboratory Manual</a>. , ed. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. A2.2(2001).</li>
<li>Xiao, J., Elf, J., Li, G., Yu, J., Xie, X. S. Imaging gene expression in living cells at the single-molecule level. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aXiao%2C+J+%22Single+Molecules%3A+a+laboratory+manual%22">Single Molecules: a laboratory manual</a>. , 149-169 (2007).</li>
<li>Nagai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat. Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Stagaman, G., Forsyth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bright-field+microscopy+of+semitransparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Bright-field microscopy of semitransparent objects.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 5, 648-659 (1988).</li>
<li>Tobias, J. W., Shrader, T. E., Rocap, G., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-end+rule+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The N-end rule in bacteria.</a> Science. 254, 1374-137 (1991).</li>
</ol>

Nous n&#39;avons pas d&#39;autres informations.

La méthode COTRAC peuvent être généralisés à mesurer la production d&#39;autres protéines où N-ou C-terminaux conventionnels fusions de protéines fluorescentes peuvent perturber l&#39;activité des protéines. La stratégie COTRAC a trois avantages uniques par rapport aux méthodes actuelles. Tout d&#39;abord, co-traductionnelle de fusion assure une molécule de rapporteur fluorescent est le produit pour chaque molécule de la protéine d&#39;intérêt, ce qui permet un comptage précis de la production de protéines en temps réel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Agarose (température de fusion basse) </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Milli-Q H 2 O </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 5 × sels M9 </td><td></td><td></td><td> Recette suivante décrit en 9 </td></tr><tr><td> Glucose à 20% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 x solution d&#39;acides aminés MEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11130-051 </td><td></td></tr><tr><td> À température contrôlée croissanceChambre Adaptateur étape </td><td> Bioptechs </td><td> FCS-2 </td><td></td></tr><tr><td> Chauffage objectif </td><td> Bioptechs </td><td> Modèle dépend de l&#39;objectif de microscope </td><td></td></tr><tr><td> Microaqueduct Diaporama </td><td> Bioptechs </td><td> 130119-5 </td><td></td></tr><tr><td> Verrres micro </td><td> VWR </td><td> 40CIR-1 </td><td> Peuvent être difficiles à trouver; également disponible à partir Bioptechs </td></tr><tr><td> Couverture en verre / coulissant joint </td><td> Bioptechs </td><td> FCS2 0,75 mm </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Divers </td><td> Exemple de configuration: Coherent Innova 308C laser argon-ion, Olympus IX-81 microscope, Olympus Planapo 100X NA 1,45 objective, Metamorph logiciel </td><td> Doit avoir une excitation laser, automatisé xyz stade, le logiciel d&#39;automatisation capable de l&#39;imagerie scénarisé et autofocus, optique capables de résolvineg protéines fluorescentes simples </td></tr><tr><td> EM-CCD de la caméra </td><td> Divers </td><td> Exemple de configuration: Andor Ixon DU-898 </td><td> Doit avoir un bruit suffisamment faible pour détecter simples protéines fluorescentes dessus du fond </td></tr></tbody></table>

une seule molécule d&#39;imagerie du règlement gene<em&gt; in vivo</em&gt; utilisation de l&#39;activation par clivage cotraductionnelle (cotrac)

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC) à l&#39;image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode permet de compter le nombre de molécules de protéines produites dans une cellule pendant séquentielles, des fenêtres de temps de cinq minutes. Il nécessite un microscope à fluorescence avec la densité de puissance laser d&#39;excitation d&#39;environ 0,5 à 1 kW / cm 2, ce qui est suffisamment sensible pour détecter des molécules simples protéine fluorescente dans les cellules vivantes. Le rapporteur fluorescent utilisé dans cette méthode se compose de trois parties: une séquence ciblage membranaire, une maturation rapide, protéine fluorescente jaune et une séquence de reconnaissance de protéase. Le rapporteur est fusionnée de manière traductionnelle à l&#39;extrémité N-terminale d&#39;une protéine d&#39;intérêt. Les cellules sont cultivées sur une platine de microscope à température contrôlée. Toutes les cinq minutes, des molécules fluorescentes dans les cellules sont imagés (et plus tard coopérationUnted en analysant les images de fluorescence), puis photobleached de sorte que seules protéines nouvellement traduits sont comptés dans la mesure suivante. Images de fluorescence résultant de cette méthode peut être analysée par la détection des taches fluorescentes dans chaque image, en les affectant à des cellules individuelles, puis affecter les cellules de lignées cellulaires. Le nombre de protéines produites à l&#39;intérieur d&#39;une fenêtre temporelle dans une cellule donnée est calculé en divisant l&#39;intensité intégrée de taches de fluorescence par l&#39;intensité moyenne des molécules fluorescentes simples. Nous avons utilisé cette méthode pour mesurer les niveaux d&#39;expression de l&#39;ordre de 0-45 molécules simples 5 fenêtres de temps min. Cette méthode nous a permis de mesurer le bruit dans l&#39;expression de l&#39;IC λ répresseur, et a de nombreuses autres applications potentielles en biologie des systèmes.

Des résultats typiques d&#39;une expérience COTRAC le suivi de la production de l&#39;IC λ répresseur sont présentés dans les figures 4 et 5. Dans cette expérience, 12 colonies ont été imagées à intervalles de 5 min. A chaque point dans le temps, la colonie a d&#39;abord été autofocused et centralisé au sein de la zone d&#39;exposition. Ensuite, la position centrée / ciblée a été enregistré et une image de fond clair a été acquise. L&#39;étape est ensuite transporté par ~ 0,5 um long de...

Nous décrivons une méthode microscopie à fluorescence, co-translationnelle activation par clivage (COTRAC), à l&#39;image de la production de molécules de protéines dans des cellules vivantes avec une seule molécule de précision sans perturber la fonctionnalité de la protéine. Cette méthode a été utilisée pour suivre la dynamique d&#39;expression stochastique d&#39;un facteur de transcription, le λ répresseur CI<sup&gt; 1</sup&gt;.

Une seule molécule d&#39;imagerie du règlement Gene<em&gt; In vivo</em&gt; Utilisation de l&#39;activation par clivage cotraductionnelle (COTRAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Le but de cette procédure est d’acquérir des images de fluorescence en accéléré de colonies d’e coli en croissance, en exprimant des constructions de co-piste pour identifier le nombre de molécules de protéines nouvellement produites. Pour ce faire, il faut d’abord préparer un échantillon de cellules, en coex, exprimant une protéine d’intérêt fusionnée à un rapporteur Cora fluorescent, et une protéase qui se clive spécifiquement entre le rapporteur Cora et la protéine d’intérêt. La deuxième étape consiste à préparer un gel d’Aris à basse température de fusion réalisé avec M neuf milieux minimaux.Ensuite, un tampon de gel AROS est préparé pour être utilisé avec une chambre d’échantillonnage à température contrôlée. Les cellules E coli sont placées sur le gel et la chambre est assemblée. La dernière étape consiste à placer la chambre sur un microscope à fluorescence et à imager plusieurs colonies cellulaires en croissance à intervalles réguliers sur plusieurs générations.Le photoblanchiment des molécules de rapport TRE nouvellement produites à chaque intervalle de tous les re est finalement utilisé pour acquérir des traces temporelles de la production de protéines dans les cellules vivantes avec une seule molécule et une résolution unicellulaire. L’avantage de cette technique par rapport aux mesures ex unicellulaire utilisant la fusion de protéines par fluorescence est que la production de tout cancer de molécules protéiques peut être suivie avec la procédure de molécule unique et le résultat affectant les fonctions de ces molécules. Pour concevoir les séquences d’insertion de la souche, codant une séquence de localisation membranaire, une protéine fluorescente à maturation rapide et une séquence de reconnaissance de protéase et terminale vers et dans le cadre avec une protéine d’intérêt dans ce cas spécifique, un facteur de transcription ou tf.Dans cette procédure, le rapporteur veineux TSR ciblé sur membrane a été utilisé. Le rapporteur a été fusionné à la séquence de reconnaissance de la protéase ubiquitine pour compter le nombre de molécules de protéine de phage de phage de phage Lambda Repressor, C one. Après avoir incorporé la construction dans le chromosome e coli, l’encodage plasmidique de la protéase spécifique à la séquence de reconnaissance est transformé en une souche exprimant le rapporteur fluorescent et la protéine d’intérêt en fusion translationnelle.Dans ce protocole, la protéase ubiquitine carboxy Hydro, qui se clive immédiatement après l’utilisation du résidu d’ubiquitine C-terminal. Pour commencer ce protocole, choisissez une colonie d’e coli à partir d’une plaque de gélose fraîchement striée dans un millilitre M neuf, milieu minimal complété par un x minimum d’acides aminés essentiels et des antibiotiques appropriés. Incubation d’un agitateur à la température souhaitée suffisamment longtemps pour atteindre une densité optique de 600 nanomètres ou de diamètre extérieur 600 supérieure à 1,0.Diluez ensuite la culture dans un millilitre de milieu frais M nine avec des antibiotiques appropriés jusqu’à une DO 600 de 0,02. En incubant un agitateur à la température appropriée, la densité cellulaire initiale peut être augmentée si nécessaire pour une croissance à basse température. Lorsque l’OD 600 est égal à 0,2 à 0,3, commencez à préparer le tampon de gel ARO en pesant 10 à 20 milligrammes d’aros à basse température de fusion dans un microtube de 1,5 millilitre.Ajouter le volume approprié M neuf, milieu minimal sans antibiotiques pour obtenir une solution à 3 %. Ensuite, chauffez la solution levée pendant 30 minutes à 70 degrés Celsius pour la faire fondre. Retournez le tube pour vous assurer que la solution est complètement fondue et homogène.Pour l’assemblage des coussinets de gel, rincez une vitre de protection pré-nettoyée et une diapositive de micro-aqueduc avec de l’eau stérile. Séchez la vitre de protection et faites-la glisser en soufflant avec de l’air comprimé. Placez le joint en caoutchouc sur la glissière du micro-aqueduc de manière à ce qu’il recouvre les entrées et les sorties.Sur le côté verre de la lame, appliquez 50 microlitres de solution ARO au centre du micro aqueduc. Faites glisser la solution ARO avec le verre de protection sec nettoyé. Laissez la solution agricole reposer à température ambiante pendant 30 minutes.Lorsque les cellules atteignent une OD 600 de 0,3 à 0,4, elles sont prêtes pour l’imagerie. Transférez un millilitre de culture incubée dans une microcentrifugeuse à tube de 1,5 millilitre à 10 000 fois G pendant une minute dans une microcentrifugeuse de paillasse. Après avoir jeté l’agent SUP, ajoutez un millilitre de M nine medium frais et réusez.Suspendez la pastille, centrifugez doucement à nouveau la suspension à 10 000 fois G pendant une minute. Répétez ensuite l’étape de centrifugation réanime, remettez doucement la pastille en suspension dans un millilitre de milieu M neuf. À ce stade, les cellules peuvent être utilisées pour l’imagerie au microscope ou diluées de 10 à 100 fois pour garantir de faibles densités de cellules pour l’imagerie en accéléré.Pour préparer un échantillon pour l’imagerie, décollez soigneusement le verre de protection du haut du tampon de gel. Ajoutez un microlitre de culture cellulaire lavée sur le dessus du tampon de gel. Attendez environ deux minutes pour que la culture soit absorbée par le tampon de gel.Il est important de ne pas attendre si longtemps que le coussinet de gel sèche trop. Le moment idéal variera en fonction de la température et de l’humidité en attendant sec. Une autre vitre de protection pré-nettoyée.Une fois l’échantillon séché, couvrez-le avec le nouveau verre de protection en vous assurant que le verre de couverture et la lame du micro-aqueduc sont bien alignés. Assemblez la chambre de croissance à température contrôlée en suivant les instructions du fabricant. Il peut maintenant être utilisé pour l’imagerie au microscope.Pour commencer l’imagerie, allumez le laser et le microscope en suivant les instructions du fabricant. Verrouillez la chambre assemblée sur l’insert de platine du microscope. Réglez la température de la chambre de croissance et de l’objectif chauffant à 37 degrés Celsius ou à toute autre température de croissance souhaitée.Si l’imagerie dépasse la température ambiante, la mise au point ou le coussin de gel dérivera généralement de manière significative pendant environ 15 minutes après le changement de température initial. Pratiquement. Profitez de ce temps pour trouver les régions d’intérêt et modifier les scripts d’imagerie si nécessaire.Pour une expérience. Ajustez l’intensité de l’excitation laser de sorte que presque toutes les molécules fluorescentes blanchissent en six expositions. Trouvez des cellules sur le microscope et centrez-les dans une région d’imagerie prédéfinie et alignée.Ensuite, enregistrez la position de chaque cellule : plus d’une cellule peut être imagée dans chaque image. La fenêtre temporelle d’acquisition pour l’imagerie time-lapse sur plusieurs générations garantit que les cellules d’image sont initialement séparées des autres cellules, mais au moins quelques centaines de microns afin que d’autres colonies n’entrent pas dans la région d’imagerie pendant la croissance. À l’aide d’un script d’imagerie automatisé, acquérez des données time-lapse à l’aide de l’algorithme décrit dans ce flux de travail expérimental, qui se trouve dans le protocole textuel accompagnant cette vidéo.Ces images montrent des données en accéléré typiques d’une expérience de suivi de code. Les images d’une seule colonie sont affichées à des intervalles de 25 minutes. Dans cette expérience, des données ont été acquises toutes les cinq minutes auprès de 12 colonies différentes.Ces images représentent des images en fond clair et des images de fluorescence YFP de Vénus, l’arrière-plan moyen étant soustrait pour tenir compte du changement d’arrière-plan de l’ensemble du champ d’imagerie. Au fil du temps, lorsque les images sont superposées, elles révèlent la localisation polaire des molécules rapporteures veineuses UB TSR et l’hétérogénéité du nombre de molécules produites dans des fenêtres temporelles de cinq minutes dans différentes cellules. Présentées ici présentent des données typiques d’un seul point temporel dans une expérience de suivi de code : des images de fluorescence veineuse de six expositions de 100 millisecondes acquises au début de chaque intervalle de temps de cinq minutes sont présentées.Chacune des six expositions a été séparée de 900 millisecondes pour laisser le temps aux molécules veineuses sombres transitoires qui ont clignoté de devenir fluorescentes pour l’analyse. L’image six est soustraite de l’image un pour corriger les molécules non blanchies et l’autofluorescence. Les taches d’arrière-plan de cette image sont localisées à des lignées cellulaires spécifiques et quantifiées par leur intensité de fluorescence intégrée.La fluorescence intégrée moyenne de la colonie est ensuite tracée sur six images, ce qui correspond à une décroissance exponentielle. De plus, un décalage constant donne une mi-temps de décroissance d’environ une seconde. Dans cette expérience, les molécules veineuses photoblanchissent beaucoup plus rapidement que l’autofluorescence cellulaire.Par conséquent, environ la moitié du nombre total de molécules veineuses sont photoblanchies dans chaque image. Pour cette procédure, une analyse d’imagerie de conductivité peut être effectuée dans d’autres pour créer des trics du nombre de molécules de protéines produites dans des cellules individuelles.

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Suivi de l’Expression génique par la détection d’activité β-galactosidase dans des embryons de souris entière

Réglementation de l’environnement de la chromatine est un processus essentiel nécessaire pour l’expression des gènes appropriés. Nous décrivons ici une méthode pour contrôler l’expression des gènes par le recrutement de modificateurs de la chromatine machines de façon gène-spécifique et réversible.

Réprimer la Transcription du gène en redirigeant la machinerie cellulaire avec des modificateurs chimiques épigénétiques

Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour générer un modèle de système dans lequel la transcription d’un gène endogène d’intérêt peut être conditionnellement contrôlée dans les animaux vivants ou de cellules à l’aide d’activator, renforcée lac répresseur et tet .

Application in vivo de la système de télécommande pour la Manipulation d’Expression des gènes endogènes

L'immunoprécipitation de chromatine (ChIP) est un outil puissant pour comprendre les mécanismes moléculaires de la régulation génique. Cependant, la méthode implique des difficultés dans l'obtention de la fragmentation de chromatine reproductible par tonte mécanique. Ici, nous fournissons un protocole amélioré pour un jeu d'enfant en utilisant la digestion enzymatique.

Chromatin Immunoprecipitation Assay Utilisation de nucléases micrococciques dans les cellules de mammifères

Les cellules neurales de tige/progéniteur montrent la dynamique diverse d'expression des composants de signalisation de notch qui mènent aux résultats différents des événements cellulaires. Une telle expression dynamique peut être révélée par une surveillance en temps réel, et non par une analyse statique, à l'aide d'un système d'imagerie de bioluminescence très sensible qui permet de visualiser des changements rapides dans les expressions génétiques.

Imagerie en temps réel de bioluminescence de la dynamique de signalisation d'encoche pendant la neurogenèse de Murine

Le suivi des événements de traduction individuels permet des études cinétiques à haute résolution des mécanismes de traduction dépendant du plafond. Ici nous démontrons un essai in vitro d’une seule molécule basé sur des interactions de formation image entre les anticorps fluorescents étiquetés et les peptides naissants épitope-marqués. Cette méthode permet la caractérisation à molécule unique de la cinétique d’initiation et d’élongation peptidique lors de la traduction active in vitro...

Un essai in vitro d’imagerie à molécule unique pour l’analyse de la cinétique de traduction cap-dépendante

Cette étude décrit une méthode pour des expériences à haut débit utilisant un réseau de LED imprimées en 3D pour optimiser l’expression génique inductible par la lumière dans HEK293T cellules.

Optimisation rapide d’un système inductible par la lumière pour contrôler l’expression génique de mammifères

Découvrez la méthode CoTrAC pour imager la production protéique dans les cellules vivantes d'E. coli avec une précision moléculaire unique. Cette technique permet d'observer les dynamiques des facteurs de transcription sans perturber leur fonctionnalité.

Une seule molécule d'imagerie du règlement Gene

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