Une seule molécule d'imagerie du règlement Gene In vivo Utilisation de l'activation par clivage cotraductionnelle (COTRAC)

Le but de cette procédure est d’acquérir des images de fluorescence en accéléré de colonies d’e coli en croissance, en exprimant des constructions de co-piste pour identifier le nombre de molécules de protéines nouvellement produites. Pour ce faire, il faut d’abord préparer un échantillon de cellules, en coex, exprimant une protéine d’intérêt fusionnée à un rapporteur Cora fluorescent, et une protéase qui se clive spécifiquement entre le rapporteur Cora et la protéine d’intérêt. La deuxième étape consiste à préparer un gel d’Aris à basse température de fusion réalisé avec M neuf milieux minimaux.

Ensuite, un tampon de gel AROS est préparé pour être utilisé avec une chambre d’échantillonnage à température contrôlée. Les cellules E coli sont placées sur le gel et la chambre est assemblée. La dernière étape consiste à placer la chambre sur un microscope à fluorescence et à imager plusieurs colonies cellulaires en croissance à intervalles réguliers sur plusieurs générations.

Le photoblanchiment des molécules de rapport TRE nouvellement produites à chaque intervalle de tous les re est finalement utilisé pour acquérir des traces temporelles de la production de protéines dans les cellules vivantes avec une seule molécule et une résolution unicellulaire. L’avantage de cette technique par rapport aux mesures ex unicellulaire utilisant la fusion de protéines par fluorescence est que la production de tout cancer de molécules protéiques peut être suivie avec la procédure de molécule unique et le résultat affectant les fonctions de ces molécules. Pour concevoir les séquences d’insertion de la souche, codant une séquence de localisation membranaire, une protéine fluorescente à maturation rapide et une séquence de reconnaissance de protéase et terminale vers et dans le cadre avec une protéine d’intérêt dans ce cas spécifique, un facteur de transcription ou tf.

Dans cette procédure, le rapporteur veineux TSR ciblé sur membrane a été utilisé. Le rapporteur a été fusionné à la séquence de reconnaissance de la protéase ubiquitine pour compter le nombre de molécules de protéine de phage de phage de phage Lambda Repressor, C one. Après avoir incorporé la construction dans le chromosome e coli, l’encodage plasmidique de la protéase spécifique à la séquence de reconnaissance est transformé en une souche exprimant le rapporteur fluorescent et la protéine d’intérêt en fusion translationnelle.

Dans ce protocole, la protéase ubiquitine carboxy Hydro, qui se clive immédiatement après l’utilisation du résidu d’ubiquitine C-terminal. Pour commencer ce protocole, choisissez une colonie d’e coli à partir d’une plaque de gélose fraîchement striée dans un millilitre M neuf, milieu minimal complété par un x minimum d’acides aminés essentiels et des antibiotiques appropriés. Incubation d’un agitateur à la température souhaitée suffisamment longtemps pour atteindre une densité optique de 600 nanomètres ou de diamètre extérieur 600 supérieure à 1,0.

Diluez ensuite la culture dans un millilitre de milieu frais M nine avec des antibiotiques appropriés jusqu’à une DO 600 de 0,02. En incubant un agitateur à la température appropriée, la densité cellulaire initiale peut être augmentée si nécessaire pour une croissance à basse température. Lorsque l’OD 600 est égal à 0,2 à 0,3, commencez à préparer le tampon de gel ARO en pesant 10 à 20 milligrammes d’aros à basse température de fusion dans un microtube de 1,5 millilitre.

Ajouter le volume approprié M neuf, milieu minimal sans antibiotiques pour obtenir une solution à 3 %. Ensuite, chauffez la solution levée pendant 30 minutes à 70 degrés Celsius pour la faire fondre. Retournez le tube pour vous assurer que la solution est complètement fondue et homogène.

Pour l’assemblage des coussinets de gel, rincez une vitre de protection pré-nettoyée et une diapositive de micro-aqueduc avec de l’eau stérile. Séchez la vitre de protection et faites-la glisser en soufflant avec de l’air comprimé. Placez le joint en caoutchouc sur la glissière du micro-aqueduc de manière à ce qu’il recouvre les entrées et les sorties.

Sur le côté verre de la lame, appliquez 50 microlitres de solution ARO au centre du micro aqueduc. Faites glisser la solution ARO avec le verre de protection sec nettoyé. Laissez la solution agricole reposer à température ambiante pendant 30 minutes.

Lorsque les cellules atteignent une OD 600 de 0,3 à 0,4, elles sont prêtes pour l’imagerie. Transférez un millilitre de culture incubée dans une microcentrifugeuse à tube de 1,5 millilitre à 10 000 fois G pendant une minute dans une microcentrifugeuse de paillasse. Après avoir jeté l’agent SUP, ajoutez un millilitre de M nine medium frais et réusez.

Suspendez la pastille, centrifugez doucement à nouveau la suspension à 10 000 fois G pendant une minute. Répétez ensuite l’étape de centrifugation réanime, remettez doucement la pastille en suspension dans un millilitre de milieu M neuf. À ce stade, les cellules peuvent être utilisées pour l’imagerie au microscope ou diluées de 10 à 100 fois pour garantir de faibles densités de cellules pour l’imagerie en accéléré.

Pour préparer un échantillon pour l’imagerie, décollez soigneusement le verre de protection du haut du tampon de gel. Ajoutez un microlitre de culture cellulaire lavée sur le dessus du tampon de gel. Attendez environ deux minutes pour que la culture soit absorbée par le tampon de gel.

Il est important de ne pas attendre si longtemps que le coussinet de gel sèche trop. Le moment idéal variera en fonction de la température et de l’humidité en attendant sec. Une autre vitre de protection pré-nettoyée.

Une fois l’échantillon séché, couvrez-le avec le nouveau verre de protection en vous assurant que le verre de couverture et la lame du micro-aqueduc sont bien alignés. Assemblez la chambre de croissance à température contrôlée en suivant les instructions du fabricant. Il peut maintenant être utilisé pour l’imagerie au microscope.

Pour commencer l’imagerie, allumez le laser et le microscope en suivant les instructions du fabricant. Verrouillez la chambre assemblée sur l’insert de platine du microscope. Réglez la température de la chambre de croissance et de l’objectif chauffant à 37 degrés Celsius ou à toute autre température de croissance souhaitée.

Si l’imagerie dépasse la température ambiante, la mise au point ou le coussin de gel dérivera généralement de manière significative pendant environ 15 minutes après le changement de température initial. Pratiquement. Profitez de ce temps pour trouver les régions d’intérêt et modifier les scripts d’imagerie si nécessaire.

Pour une expérience. Ajustez l’intensité de l’excitation laser de sorte que presque toutes les molécules fluorescentes blanchissent en six expositions. Trouvez des cellules sur le microscope et centrez-les dans une région d’imagerie prédéfinie et alignée.

Ensuite, enregistrez la position de chaque cellule : plus d’une cellule peut être imagée dans chaque image. La fenêtre temporelle d’acquisition pour l’imagerie time-lapse sur plusieurs générations garantit que les cellules d’image sont initialement séparées des autres cellules, mais au moins quelques centaines de microns afin que d’autres colonies n’entrent pas dans la région d’imagerie pendant la croissance. À l’aide d’un script d’imagerie automatisé, acquérez des données time-lapse à l’aide de l’algorithme décrit dans ce flux de travail expérimental, qui se trouve dans le protocole textuel accompagnant cette vidéo.

Ces images montrent des données en accéléré typiques d’une expérience de suivi de code. Les images d’une seule colonie sont affichées à des intervalles de 25 minutes. Dans cette expérience, des données ont été acquises toutes les cinq minutes auprès de 12 colonies différentes.

Ces images représentent des images en fond clair et des images de fluorescence YFP de Vénus, l’arrière-plan moyen étant soustrait pour tenir compte du changement d’arrière-plan de l’ensemble du champ d’imagerie. Au fil du temps, lorsque les images sont superposées, elles révèlent la localisation polaire des molécules rapporteures veineuses UB TSR et l’hétérogénéité du nombre de molécules produites dans des fenêtres temporelles de cinq minutes dans différentes cellules. Présentées ici présentent des données typiques d’un seul point temporel dans une expérience de suivi de code : des images de fluorescence veineuse de six expositions de 100 millisecondes acquises au début de chaque intervalle de temps de cinq minutes sont présentées.

Chacune des six expositions a été séparée de 900 millisecondes pour laisser le temps aux molécules veineuses sombres transitoires qui ont clignoté de devenir fluorescentes pour l’analyse. L’image six est soustraite de l’image un pour corriger les molécules non blanchies et l’autofluorescence. Les taches d’arrière-plan de cette image sont localisées à des lignées cellulaires spécifiques et quantifiées par leur intensité de fluorescence intégrée.

La fluorescence intégrée moyenne de la colonie est ensuite tracée sur six images, ce qui correspond à une décroissance exponentielle. De plus, un décalage constant donne une mi-temps de décroissance d’environ une seconde. Dans cette expérience, les molécules veineuses photoblanchissent beaucoup plus rapidement que l’autofluorescence cellulaire.

Par conséquent, environ la moitié du nombre total de molécules veineuses sont photoblanchies dans chaque image. Pour cette procédure, une analyse d’imagerie de conductivité peut être effectuée dans d’autres pour créer des trics du nombre de molécules de protéines produites dans des cellules individuelles.