Name: Vivez limagerie des protéines GFP-étiquetés Drosophila Les ovocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Apprenez l'imagerie en direct des protéines GFP dans les ovocytes de Drosophila. Cette méthode par microscopie confocale permet d'étudier la dynamique cellulaire et le trafic protéique en biologie du développement.

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1. Préparation des mouches pour la dissection <ol><li> Anesthésier les mouches saines du génotype désiré (par exemple, l&#39;expression d&#39;une protéine GFP-étiqueté) qui sont inférieures à une semaine. Sélectionnez 10-15 femelles de grande taille avec des arrondis de couleur crème abdomen. </li><li> Transférez les mouches sélectionnées et quelques (3-5) mâles dans un flacon contenant de nouveaux aliments légèrement yeasted et permettre aux mouches pour engraisser pendant deux jours à 25 ° C. Reportez-vous à Weil et al. 6 pour les détails de préparation drosophile. Engraissement les mouches veille à ce que des stades différents, en particulier les étapes 8-12, sera disponible pour l&#39;imagerie. Mal engraissés ou unfattened vole habituellement ne contiennent que des stades très précoces (1-6) et matures (stade 14) ovocytes. </li></ol> 2. Préparation des ovocytes d&#39;imagerie utilisant un microscope composé vertical <ol><li> Préparer une lame de verre standard par l&#39;apposition de deux lamelles de la lame, à environ 1 cm de distance, à l&#39;aide de silicone GREASe. Utiliser uniquement une graisse suffisante pour assurer une bonne étanchéité entre la lamelle et un toboggan. En appuyant fermement sur chaque lamelle la volonté répartir la graisse couche mince et régulière. Ajouter un peu d&#39;huile halocarbone 27 (Sigma) à la jonction entre les lamelles et le faire glisser. Ils serviront de cales pour empêcher blessant ovocytes isolés dans les étapes ultérieures. N ° 1.5 lamelles fonctionnent bien, avec une épaisseur moyenne (0.16-0.18 mm) qui correspond à celui des ovocytes à un stade avancé. </li><li> Lieu 2-3 gouttes d&#39;huile 27 halocarbure sur la surface d&#39;une lamelle 22 mm 2. Pour obtenir les ovocytes sains possibles, une femelle est retirée du flacon à l&#39;aide alimentaire pipetage à la bouche et lentement déposée dans l&#39;huile sans anesthésiant premier halocarbure. </li><li> En utilisant une pince à dissection (tels que Dumont # 5), la broche à la volée contre la lamelle et retirer le bout de l&#39;abdomen. Enlever les ovaires en les faisant glisser le long de la surface de la lamelle couvre-objet, en vertu de l&#39;huile. Cela permettra de promouvoir adhesion des ovocytes à la lamelle. </li><li> Doucement démêler les ovaires, à la recherche d&#39;ovocytes qui sont 10B étape au moins de l&#39;ovogenèse. A ce stade, les ovocytes peuvent être identifiés par recherche de chambres d&#39;oeuf dans lequel l&#39;ovocyte occupe au moins 50-60% du volume total de la chambre d&#39;oeuf. À ce stade de l&#39;ovogenèse, les cellules folliculaires qui recouvrent l&#39;ovocyte sont devenus colonne, et entourent l&#39;ovocyte de tous les côtés, sauf pour une petite région où les connexions à des cellules nourricières restent. Utilisez la pince pour enlever ovocytes individuels de la gaine ovarioles. </li><li> Procéder, en utilisant des femelles 1-3, 5-8 ovocytes intacts jusqu&#39;à ce que ont été isolées sur la lamelle. Retirez tous les tissus inutilisables. </li><li> Retourner avec précaution la lamelle contenant les ovocytes sur la lame de pré-préparée de telle sorte que les ovocytes sont placés entre les deux entretoises. Ne pas appuyer sur la lamelle inversée car cela endommager les ovocytes. Si nécessaire, ajouter une petite quantité d&#39;huile halocarbone à til bords du &quot;sandwich&quot; pour assurer l&#39;espace est rempli. (Facultatif:. Laisser reposer diapositive pendant plusieurs minutes pour permettre le tassement de la lamelle) La diapositive est maintenant prêt pour l&#39;imagerie. </li></ol> 3. Préparation des ovocytes d&#39;imagerie utilisant un microscope composé inversé <ol><li> Les ovocytes sont disséqués essentiellement comme décrit dans la section 2, sauf que les petites boîtes de Pétri avec un insert à fond de verre (MatTek, 35 mm) sont utilisés au lieu des lamelles. Il n&#39;est pas nécessaire de recouvrir l &#39;échantillon, et après la dissection des tissus peuvent être visualisés directement dans les plats, mais des précautions doivent être prises pour s&#39;assurer que les ovocytes restent couverts d&#39;huile et ne sont pas autorisés à se dessécher. </li></ol> 4. Vivez l&#39;imagerie <ol><li> Apportez un ovocyte dans le foyer en utilisant DIC ou optique à contraste de phase et d&#39;examiner l&#39;ovocyte pour tout signe de dommage, comme une fuite du cytoplasme, ou gonflement des cellules folliculaires. Ovocytes seulement les images qui semblent en bonne santé et en bon état. </li><li> Streaming peut être contrôlée directement sans qu&#39;il soit nécessaire pour l&#39;étiquetage GFP, depuis vésicules vitellines dans le cytoplasme sont autofluorescente 7. Ce signal peut être capté dans la gamme FITC de la portée, mais il faudra probablement des réglages de gain plus élevés que ceux qui sont utilisés pour des protéines GFP-marqués. </li><li> Les meilleures images de diffusion en continu sont obtenues à partir de coupes optiques qui sont juste au-dessous de la surface de l&#39;ovocyte qui est en appui contre la vitre couvre-objet / de Petri en verre. Ici, l&#39;ovocyte est légèrement aplati, de permettre une meilleure plan de mise au point. Les images peuvent être capturées à 200X - 1.000 X. En utilisant le dispositif décrit ici, les objectifs de l&#39;air doit être utilisé, puisque la lamelle forme une barrière entre l&#39;ovocyte et objective. Ceci est optimale car elle minimise grandement la dérive et le mouvement de l&#39;échantillon. </li><li> Une fois une région d&#39;intérêt est mis au point, éteignez l&#39;optique brighfield et passer à l&#39;imagerie confocale. Utilisation du balayage rapide / preview fonction du logiciel, ajuster et d&#39;acquérirle cas échéant. </li><li> Les paramètres de capture varie d&#39;un microscope à microscope, mais les paramètres généraux sont les suivants: Utilisation d&#39;une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 488 nm et ~ une longueur d&#39;onde d&#39;émission de ~ 515 nm. Mise en place de l&#39;axe Z de telle sorte que la capture de l&#39;axe Z reste constante, avec un délai de 10 secondes entre les images. Capturer une séquence test de trames de 5-10 pour assurer l&#39;ovocyte est fixe et le plan de focalisation est approprié. </li><li> Une séquence typique de temps écoulé entre la capture sera de 20 à 50 cadres, et peut être examinée immédiatement après l&#39;achèvement d&#39;évaluer la qualité vidéo. Le processus peut être répété pour d&#39;autres cellules dans la diapositive, ou de femelles supplémentaires peuvent être disséqués selon les besoins. </li></ol> 5. Dépannage et commune <ol><li> Drift - Lors de l&#39;utilisation d&#39;un microscope droit, les cellules peuvent parfois dérives dues à la diffusion de l&#39;huile. Cela peut être minimisé en utilisant juste assez d&#39;huile pour couvrir la zone sous la lamelle. Si le problème persiste, utilisez g de moins en siliconeRease au intercalaires apposer à la diapositive. </li></ol> Remarque: Certains logiciels permettent le suivi confocale de cellules, mais en général, il est préférable de renoncer à l&#39;imagerie d&#39;ovocytes à la dérive et au lieu d&#39;utiliser un autre spécimen. <ol start="2"><li> Aucun signe de streaming - Si le streaming n&#39;est pas évident, il est probablement dû à l&#39;une des deux causes: soit le plan focal pour la capture d&#39;image n&#39;est pas correcte (généralement trop profondément à l&#39;intérieur de l&#39;ovocyte) ou l&#39;ovocyte est endommagé. Temps et la pratique peut réduire à la fois les erreurs. </li></ol>

<ol><li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li>
<li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shining+light+on+Drosophila+oogenesis%3A+Live+imaging+of+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Gen.+Dev%22%5BJournal%5D)">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li>
<li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+RC+%22Ovarian+development+Drosophila+melanogaster%22">Ovarian development Drosophila melanogaster</a>. , Academic Press. New York. (1970).</li>
<li>Spradling, A. C. Developmental genetics of oogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor. 1-70 (1993).</li>
<li>Serbus, L. R., Cha, B. -J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev%22%5BJournal%5D)">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679(2012).</li>
<li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li>
<li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li>
<li>Röper, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li>
<li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+the+ER+and+Exu%3A+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li>
<li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Arch.%2C+Devl.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li>
<li>ImageJ [Internet]. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/index.html</a> (2013).</li>
</ol>

Je n&#39;ai rien à déclarer.

Ovocytes chez la drosophile constituent un système modèle polyvalent pour traiter une variété de questions liées à la fonction et l&#39;organisation des cellules et des composants subcellulaires. Une compréhension complète de la fonction des protéines nécessite le suivi de ces deux aspects spatiaux et temporels du comportement des protéines. Les progrès dans les deux systèmes d&#39;imagerie et les outils génétiques disponibles pour Drosophilists rendre possible, même pour les petits laboratoires pour effectuer des expériences d&#39;imagerie de haute qualité dans des ovocytes de vie. Ici, je ébaucher un protocole d&#39;analyser le comportement des protéines GFP-étiqueté ou autofluorescente et les structures du milieu à la fin de l&#39;ovogenèse qui peut être utilisé en conjonction avec une variété de contextes génétiques pour sonder la fonction des protéines. Dans ce protocole I décrire le processus par lequel les ovocytes sont préparés pour l&#39;imagerie et les réglages de base confocaux qui permettront d&#39;acquisition vidéo laps de temps de protéines fluorescentes et des structures. Supplémentaires details sur la préparation des ovocytes sont décrits par Weil et al. 6 Une grande variété de souches de mouches exprimant des protéines qui ont été marqués de façon endogène par l&#39;intermédiaire de l&#39;exon de piégeage sont disponibles 8 et variants de la protéine infiniment plus peuvent être conçus et réintroduite pour les mouches. En travaillant avec les tissus vivants, la santé des spécimens est d&#39;une importance primordiale. Chambres d&#39;œufs de stade 10B pouvez compléter ovogenèse d&#39;une manière essentiellement autonome 11, ce qui les rend idéales pour des études à court terme d&#39;imagerie. Des précautions doivent être prises lors de plusieurs étapes clés pour obtenir des données de haute qualité. Lors de la dissection, il est important de manipuler les ovaires et d&#39;ovocytes aussi peu que possible, et de minimiser la quantité de temps entre la dissection et l&#39;achèvement de l&#39;imagerie. Idéalement, une station de dissection petite doit être situé dans la même pièce où se trouve le champ confocal, et seulement quelques chambres d&#39;œufs en plusieurs fois devrait être imagé. Le nombre recommandé ici (5-8) Garantit que le temps de dissection est réduit au minimum tout en maximisant la probabilité d&#39;obtenir des images de bonne qualité. Je recommande la capture d&#39;une courte série d&#39;images pour évaluer la qualité d&#39;image et de confirmer que les paramètres de capture sont optimisés, avant de capturer une séquence plus longue laps de temps. La plupart des logiciels permettant d&#39;images individuelles pour être sauvé, et ces images peuvent ensuite être analysées dans une variété de façons en utilisant ImageJ 12 ou d&#39;autres logiciels.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Huile halocarbone 27 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8773-100ML </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF forceps </td><td> Outils Fine Science </td><td> 11252-00 </td><td></td></tr><tr><td> Graisse au silicone </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z273554-1EA </td><td></td></tr><tr><td> À fond de verre des boîtes de Pétri </td><td> MatTek </td><td> P35G 0-20-C- </td><td></td></tr></tbody></table>

vivez l&#39;imagerie des protéines gfp-étiquetés<em&gt; drosophila</em&gt; les ovocytes

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

L&#39;ovocyte chez la drosophile a été établi comme un système polyvalent d&#39;enquêter sur des questions fondamentales telles que la fonction du cytosquelette, l&#39;organisation des cellules, et la structure et la fonction des organites. La disponibilité de diverses protéines GFP-taggés signifie que de nombreux processus cellulaires peuvent être surveillés dans les cellules vivantes au cours des minutes ou des heures, et l&#39;utilisation de cette technique, des procédés tels que la RNP transport, la morphogenèse épithéliale, et le remodelage tissulaire ont été décrits en détail ovocytes chez la drosophile 1,2. La possibilité d&#39;effectuer une imagerie vidéo combiné avec un riche répertoire de mutants permet une grande variété de gènes et des processus à examiner en détail incroyable. Un exemple en est le processus de diffusion ovoplasmique, qui initie à la mi-ovogenèse 3,4. Ce mouvement vigoureux de vésicules cytoplasmiques est microtubules et la kinésine-dépendante 5 et fournit un sys utilestème d&#39;enquêter sur la fonction du cytosquelette lors de ces étapes. Ici, je présente un protocole pour l&#39;imagerie laps de temps de vie des ovocytes aide de pratiquement n&#39;importe quelle configuration microscopie confocale.

Imagerie de protéines GFP-marqués varie en fonction de la force avec la protéine marquée est exprimée. Un ovocyte à mi-étape exprimer reticulon-like 1 (Rtnl-1), l&#39;exon étiquetés avec la GFP 8,9 produit un signal fort. Rtnl-1 semble co-localisés avec les microtubules présents pendant de longues continu ovoplasmique 10 (figure 1A). Rtnl-1 est un bon marqueur pour observer en continu, et est également un indicateur de l&#39;organisation des microtubules dans les ovocytes à un stade avancé. Le streaming ovoplasmique dans une chambre d&#39;œufs de type sauvage est évident que le mouvement notable de vésicules vitellines autofluorescentes lorsque vous utilisez un taux de capture d&#39;une image à chaque (figure 1B) 10 sec. Une projection maximale de cinq images peuvent être générés pour marquer le chemin de vésicules mobiles. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> Figure 1. Vivez l&#39;imagerie à la fois autoflstructures uorescentes et GFP-étiqueté. A) Un seul time-lapse image d&#39;une étape 11 ovocytes exprimant Rtnl1-GFP à 400X. Rtnl1-GFP fibres se déplacent avec un mouvement ondulatoire dans les ovocytes en streaming. B) Une projection maximale de cinq châssis d&#39;une chambre oeufs de stade 10B dans laquelle les vésicules vitellines autofluorescentes ont été imagées toutes les 10 secondes pendant 50 sec au total, à un grossissement de 400X. Barre d&#39;échelle = 30 um

Un protocole d&#39;imagerie en temps réel des protéines GFP-marqués ou des structures autofluorescentes en individuel<em&gt; Drosophila</em&gt; Ovocytes est décrite.

Vivez l&#39;imagerie des protéines GFP-étiquetés<em&gt; Drosophila</em&gt; Les ovocytes

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Dans ce protocole, des cellules exprimant des protéines marquées par la GFP sont disséquées à partir de drosophiles femelles et observées afin d'étudier le déplacement de la protéine dans des cellules vivantes. Préparez d'abord une chambre d'observation en fixant deux lamelles sur une lame à l'aide de graisse de silicone afin de former un canal. Les parois du canal sont recouvertes d'huile de halo carbone.Ensuite, disséquez les ovaires d'une femelle dans une goutte d'huile au halo de carbone déposée sur une lame couvre-objet. Puis, isolez les cytes individuels et retournez la lame couvre-objet au-dessus du canal de la préparation montée afin de créer une chambre d'observation. Après avoir localisé les cytes à l'aide d'une optique en champ clair ou en contraste interférentiel différentiel (DIC), capturez des images numériques à des intervalles de temps définis à l'aide d'une microscopie confocale et du logiciel associé.En fin de compte, une séquence en accéléré des images générées peut être utilisée pour surveiller le déplacement de protéines ou de particules dans des cellules vivantes au fil du temps. Cette méthode peut aider à étudier des domaines clés de la biologie cellulaire et du développement, tels que le trafic des protéines et des ARNm, ainsi que l'établissement de la polarité cellulaire. Anesthésiez d'abord les mouches saines âgées de moins d'une semaine et sélectionnez 10 à 15 femelles de grande taille possédant un abdomen arrondi de couleur crème.Transférez les mouches sélectionnées ainsi que quelques mâles dans un flacon contenant un nouveau milieu légèrement enrichi en levure. Incubez ensuite les mouches pendant deux jours à 25 degrés Celsius pour les engraisser. L’engraissement des mouches garantit la disponibilité d’une variété de stades, en particulier les stades huit à douze, pour l’imagerie ; les mouches non engraisées ou mal engraisées contiennent généralement uniquement des stades très précoces et des cytes matures. Utilisez de la graisse de silicone.Fixez deux lamelles à environ un centimètre d'intervalle sur une lame en verre standard. Utilisez uniquement suffisamment de graisse pour assurer un bon joint entre la lamelle et la lame. Appuyez fermement sur chaque lamelle afin d'étaler la graisse finement et uniformément.Ensuite, ajoutez un peu d'huile de carbone creuse 27 au niveau de la jonction entre les lamelles et la lame afin d'éviter d'endommager les cytes isolés lors des étapes suivantes. Placez maintenant deux à trois gouttes d'huile de carbone 27 sur la surface d'une lamelle de 22 millimètres carrés. Puis, à l’aide d’une pipette buccale, prélève un individu femelle sur le flacon de nourriture et dépose-le délicatement dans l’huile de carbone halo.À l’aide de pinces chirurgicales pointues, fixez la drosophile contre la lamelle et retirez l’extrémité de l’abdomen. Retirez les ovaires en les faisant glisser sur la surface de la lamelle sous l’huile afin de favoriser l’adhésion des cytes à la lamelle. Séparez délicatement les ovaires et recherchez les cytes qui se trouvent au stade 10 B au moins de l’oogenèse.Identifier les ovocytes à ce stade en recherchant les follicules dans lesquels l'ovocyte occupe au moins 50 à 60 % du volume total du follicule. À l'aide de pinces, prélever les ovocytes individuels de la gaine ovarienne en utilisant une à trois femelles.Continuer à isoler cinq à huit ovocytes non endommagés sur la lamelle. Ensuite, retirer tout tissu inutilisable. Retourner délicatement la lamelle contenant les ovocytes sur la préparation préalablement préparée afin que les cytes soient positionnés entre les deux espacements.Et n'oubliez pas : n'appuyez pas sur la lame couvre-objet, car cela pourrait endommager les cellules. Si nécessaire, ajoutez une petite quantité d'huile de carbure d'halogène sur les bords du montage afin de s'assurer que l'espace est bien rempli. Remarquez qu'à ce stade de l'ovogenèse, les cellules folliculaires situées au-dessus de l'ovocyte sont devenues cohésives et entourent l'ovocyte de tous côtés, à l'exception d'une petite région où persistent les connexions avec les cellules nourricières. Mettez un ovocyte au point à l'aide d'une optique en contraste de phase ou en contraste interférentiel différentiel (DIC).Examinez l'ovocyte à la recherche de tout signe de dommage, tel qu'une fuite de cytoplasme ou un renflement des cellules folliculaires. N'effectuez d'images que sur les ovocytes qui apparaissent sains et non endommagés. Pour surveiller directement le courant cytoplasmique sans marquage GFP.Régler la capture d'images dans la plage ZI du microscope avec des paramètres de gain plus élevés que ceux utilisés pour les protéines marquées avec GFP. Utiliser des objectifs à air pour minimiser considérablement la dérive et les mouvements de l'échantillon. Obtenir des sections optiques juste sous la surface de l'ovocyte.Une fois qu'une région d'intérêt est en netteté, désactivez l'optique en champ clair et passez à l'imagerie confocale en utilisant la fonction d'aperçu rapide du logiciel, puis ajustez la mise au point et le gain selon les besoins. Réglez également les paramètres d'excitation, de longueur d'onde et de longueur d'onde d'émission. Pour l'acquisition selon l'axe Z, sélectionnez un axe Z constant avec un intervalle de 10 secondes entre chaque image.Après avoir capturé une séquence typique en laps de temps composée de 20 à 50 images, examinez et évaluez immédiatement la qualité de la vidéo. Cette image unique en laps de temps montre un ovocyte au stade 11. Cet ovocyte exprimant la protéine RTNL marquée avec GFP peut produire un signal intense.La protéine R TNL semble co-localiser avec les longs microtubules présents pendant le courant cytoplasmique. Typiquement, le courant cytoplasmique dans une chambre œuf de type sauvage est visible sous forme de déplacement notable des vésicules autofluorescentes de yolk, comme illustré dans une projection maximale de cinq images d'une chambre œuf au stade 10 B. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des oocytes femelles sains exprimant des protéines marquées par la GFP, comment préparer des échantillons pour l'imagerie en temps réel, et comment réaliser des vidéos en laps de temps de protéines et de particules fluorescentes.

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Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.

Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour effectuer une imagerie en direct de la division asymétrique des cellules souches germinales (GSC) dans la niche ovarienne de la drosophile. Nous utilisons une lignée transgénique qui exprime de manière ubiquitaire une fusion de la protéine fluorescente verte (GFP) de la protéine du spectrosome Par-1.

Imagerie en direct étendue des niches de cellules souches germinales de Drosophila melanogaster femelle

Apprenez l'imagerie en direct des protéines GFP dans les ovocytes de Drosophila. Cette méthode par microscopie confocale permet d'étudier la dynamique cellulaire et le trafic protéique en biologie du développement.

Vivez l'imagerie des protéines GFP-étiquetés

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