Vivez l'imagerie des protéines GFP-étiquetés Drosophila Les ovocytes

Dans ce protocole, les cytes exprimant des protéines marquées à la GFP sont disséqués chez la drosophile femelle et imagés pour étudier le mouvement de la protéine dans les cellules vivantes. Tout d’abord, préparez une chambre d’observation en fixant deux lamelles sur une lame à l’aide de graisse silicone pour former un canal. Les côtés du canal sont doublés d’huile de carbone halo.

Ensuite, disséquez les ovaires d’une femelle en une goutte d’huile de carbone halo sur une lamelle. Ensuite, isolez les cytes individuels et inversez la lamelle sur le canal de la lame préparée pour créer une chambre de visualisation. Après avoir localisé les cytes à l’aide d’une optique à fond clair ou DIC, capturez des images numériques à des intervalles de temps définis à l’aide de la microscopie confocale et des logiciels associés.

En fin de compte, une séquence time-lapse des images générées peut être utilisée pour surveiller le mouvement des protéines ou des particules dans les cellules vivantes au fil du temps. Cette méthode peut aider à étudier des domaines clés de la biologie cellulaire et du développement, tels que le trafic de protéines et d’ARNm, et l’établissement de la polarité cellulaire. Anesthésie d’abord les mouches saines de moins d’une semaine et sélectionne 10 à 15 grandes femelles à l’abdomen arrondi de couleur crème.

Transférez les mouches sélectionnées et quelques mâles dans un flacon contenant de nouveaux aliments légèrement levés. Ensuite, incubez les mouches pendant deux jours à 25 degrés Celsius pour les engraisser. L’engraissement des mouches garantit qu’une variété de stades, en particulier les stades huit à 12, sont disponibles pour l’imagerie des mouches non engraissées ou les mouches mal engraissées ne contiennent généralement que des stades très précoces et des cytes matures En utilisant de la graisse silicone.

Fixez deux lamelles de recouvrement à environ un centimètre de distance sur une lame de verre standard. N’utilisez que suffisamment de graisse pour assurer une bonne étanchéité entre la lamelle et la glissière. Appuyez fermement sur chaque lamelle pour étaler la graisse finement et uniformément.

Ajoutez ensuite un peu d’huile de carbone sacrée 27 à la jonction entre les lamelles et les glissières pour éviter de blesser les cytes isolés dans les étapes suivantes. Placez maintenant deux à trois gouttes d’huile de carbone 27 sur la surface d’une lamelle de 22 millimètres carrés. Ensuite, pipetez une femelle individuelle à partir du flacon alimentaire et déposez-la doucement dans l’huile de halo Caron.

À l’aide d’une pince à dissection tranchante, épinglez la mouche contre la cale de couverture et retirez l’extrémité de l’abdomen. Retirez les ovaires en les faisant glisser le long de la surface de la lamelle sous l’huile pour favoriser l’adhérence des cytes à la lamelle. Maintenant, séparez doucement les ovaires à la recherche de cytes qui sont au moins au stade 10 B de l’ovogenèse.

Identifiez les ovocytes à ce stade en recherchant des chambres d’ovules dans lesquelles l’ovocyte occupe au moins 50 à 60 % du volume total de la chambre d’ovule. À l’aide de forceps. Prélever des ovocytes individuels de la gaine oviale à l’aide d’une à trois femelles.

Continuez à isoler cinq à huit ovocytes non endommagés sur la lamelle. Retirez ensuite tout mouchoir inutilisable. Retournez soigneusement la lamelle contenant les ovocytes sur la lame préparée à l’avance de manière à ce que les cytes soient positionnés entre les deux entretoises.

Et n’oubliez pas, n’appuyez pas sur la lamelle car cela peut endommager les cytes si nécessaire, ajoutez une petite quantité d’huile de carbone halo sur les bords du sandwich pour vous assurer que l’espace est rempli. Notez qu’à ce stade de l’ovogenèse, les cellules folliculaires recouvrant l’ovocyte sont devenues plus larges et entourent l’ovocyte de tous les côtés, à l’exception d’une petite région où les connexions avec les cellules nourricières restent. Faites la mise au point d’un ovocyte à l’aide d’une CID ou d’une optique à contraste de phase.

Examinez l’ovocyte à la recherche de tout signe de dommage, tel qu’une fuite de cytoplasme ou un renflement des cellules folliculaires. N’imaginez que les ovocytes qui semblent sains et intacts. Pour surveiller le streaming directement sans étiquetage GFP.

Réglez les images de capture dans la plage ZI de l’oscilloscope avec des paramètres de gain plus élevés que ceux utilisés pour les protéines marquées GFP. Utiliser des objectifs pneumatiques pour minimiser considérablement la dérive et le mouvement de l’échantillon. Obtenez des coupes optiques juste sous la surface de l’ovocyte.

Une fois qu’une zone d’intérêt est nette, désactivez l’optique en fond clair et passez à l’imagerie confocale à l’aide de la fonction de prévisualisation à balayage rapide du logiciel, ajustez la mise au point et le gain si nécessaire. Définissez également les paramètres d’excitation, de longueur d’onde et de longueur d’onde d’émission. Pour la capture de l’axe Z, sélectionnez un axe Z constant avec un décalage de 10 secondes entre les images.

Après avoir capturé une séquence typique de 20 à 50 images, examinez et évaluez immédiatement la qualité vidéo. Cette image en accéléré unique montre un ovocyte de stade 11. Cet ovocyte exprimant la protéine R TNL marquée à la GFP peut produire un signal fort.

R TNL one semble co-localiser avec les longs microtubules présents lors de l’écoulement plasmique opopératoire. Typiquement, l’écoulement plasmique op dans une chambre d’œuf de type sauvage est évident comme un mouvement notable des vésicules ylk autofluorescentes comme le montre une projection maximale de cinq images d’une chambre d’œuf de stade 10 B. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler des cytes femelles sains exprimant des protéines marquées GFP, de préparer des échantillons pour l’imagerie en direct et de prendre des vidéos en accéléré de protéines et de particules fluorescentes.