Name: Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Découvrez la microscopie PALM pour visualiser l'anneau FtsZ d'E. coli avec une précision nanométrique. Cette technique d'imagerie super-résolution permet d'analyser quantitativement la division cellulaire bactérienne.

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1. Préparation des échantillons <ol><li> Inoculer milieu LB avec une seule colonie de la souche JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Cultivez la nuit dans un shaker à 37 ° C. </li><li> Diluer la culture 1:1000 dans M9 + minimes médias [sels M9, glucose 0,4%, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, acides aminés et vitamines MEM] et passer à la phase mi-log (DO600 = 0.2 à 0.3) en présence de chloramphénicol (150 ug / ml) à température ambiante (RT). </li><li> Provoquer la culture avec 20 uM d&#39;IPTG pendant 2 heures (voir note n ° 1). </li><li> Culture culot dans microcentrifugeuse (8.000 rpm, 1 min) et remettre en suspension dans un volume égal d&#39;M9 +; répétition. Après la remise en suspension seconde, poursuite de la croissance à la température ambiante pendant 2 heures. </li><li> Fixer culture induite avec du paraformaldéhyde 4% dans du PBS (pH = 7,4) à température ambiante pendant 40 min. Culture Pellet et remettre en suspension dans un volume égal de PBS; répétition. Si l&#39;imagerie de cellules vivantes, sautez la fixation, la culture culot et remettre en suspension dans un volume égalde M9 - [sels M9, glucose 0,4%, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, Acides aminés MEM]; récidivistes. </li><li> Diluer perles d&#39;or 1:10 avec la culture remis en suspension. Appliquer l&#39;échantillon dans la chambre d&#39;imagerie préparé (voir étape 2.4). </li></ol> [1] Remarque: Le protocole d&#39;induction ci-dessus (étapes 1.1 à 1.3) a été optimisé pour le système d&#39;expression de la souche JB281. Conditions d&#39;induction détaillées peuvent varier pour d&#39;autres systèmes d&#39;expression ou protéines d&#39;intérêt. 2. Assemblée de la Chambre d&#39;imagerie <ol><li> Préparer une solution à 3% (p / v) d&#39;agarose à M9 -. Faire fondre l&#39;agarose à 70 ° C dans un bloc chauffant paillasse pendant 40 mn. Magasin d&#39;agarose fondu à 50 ° C pendant 5 heures. </li><li> Placer une lame de nettoyage microaqueduct dans la moitié supérieure de la chambre d&#39;imagerie avec les électrodes se faisant face vers le bas. Aligner le joint d&#39;étanchéité inférieur sur le coulisseau microaqueduct de manière à recouvrir les canaux de perfusion. </li><li> Appliquer ~ 50 pl de la fondue agarose vers le centre de la vitrediapositive. Immédiatement haut de la gouttelette gel d&#39;agarose avec un chiffon propre, sec lamelle. Laisser le gel se solidifier à la température ambiante pendant 30 min. <ol><li> Pour nettoyer des lamelles: organiser des lamelles dans un support en céramique et une sonication pendant 20 min à rotation bains d&#39;acétone, d&#39;éthanol et 1 M de KOH dans des bocaux en verre. Répétez cycle de trois fois, pour un total de 9 sonications, suivie d&#39;une sonication unique dH 2 O. Rangez les lamelles nettoyées en eau douce dH 2 O. Avant l&#39;utilisation, souffler lamelles sèches avec de l&#39;air filtré. </li></ol></li><li> Retirez délicatement la lamelle, laissant coussin de gel sur la diapositive microaqueduct. Ajouter immédiatement 1 ul d&#39;échantillon de culture cellulaire (voir l&#39;étape 1.6) vers le haut de la poche de gel. Attendre ~ 2 min, ce qui permet à la solution soit absorbée par le tampon de gel. Haut coussin de gel avec une vierge, lamelle sec. Assemblez la chambre d&#39;imagerie tout en suivant les instructions du fabricant. </li></ol> 3. Image Acquisition <ol><li> Allumez le microscope, la caméra et le laser. Ouvrez MetaMorph douceware (Molecular Devices). </li><li> Placer appropriées d&#39;excitation / émission de filtres dans le trajet de formation d&#39;image (figure 1). </li><li> Définir des puissances laser et les paramètres d&#39;acquisition en conséquence. <ol><li> 488-nm laser = 15 mW (voir note n ° 2) </li><li> 561-nm laser = 75 mW </li><li> 405-nm laser = 2 mW ± filtre à densité neutre (Voir note n ° 3) </li></ol></li><li> Verrouiller chambre d&#39;imagerie dans l&#39;étage via l&#39;adaptateur étage complémentaire. </li><li> Désigner une région d&#39;imagerie appropriée (100x100 pixel) qui est homogène éclairé par les trois lasers. </li><li> Identifier une zone d&#39;échantillonnage qui contient des cellules et des marqueurs de confiance (billes d&#39;or) à proximité mais ne se chevauchent pas. </li><li> Focus sur la surface des cellules les plus proches de la lamelle. Acquérir une image à fond clair avec 50 ms de temps d&#39;intégration et de déplacer le focus 0,5 um dans l&#39;échantillon (Figure 3AI). </li><li> Acquérir ensemble l&#39;image de fluorescence verte avec l&#39;excitation de la 488-n<html> m laser en utilisant un temps de 50 ms intégration (Figure 3Aii). </li><li> Acquérir le streaming vidéo dans le canal rouge avec un éclairage continu à partir de 405-nm et 561 nm lasers. Pour les cellules fixes, un taux de 50 ms cadre est utilisé pour un total de 20.000 cadres (total ~ min 17) avec la puissance du laser 405-nm rampe d&#39;environ 10% tous les 1000 images (voir note n ° 4). Pour les cellules vivantes, un taux de trame de 10 ms est utilisée pour un total de 3.000 cadres (~ 30 s au total) avec une puissance laser 405 nm constante. </li><li> Déplacer le foyer arrière de la surface inférieure des cellules et d&#39;acquérir une autre image de champ clair que dans l&#39;étape 3,7. </li></ol> [2] Remarque: l&#39;intensité intégrée de la fluorescence verte d&#39;une cellule est directement proportionnelle au nombre total de FtsZ-mEos2 molécules exprimées dans la cellule. La puissance d&#39;excitation 488-nm et les paramètres d&#39;ensemble d&#39;acquisition de fluorescence doit être maintenue constante pour toutes les cellules de telle sorte que le rapport FtsZ-mEos2 niveaux d&#39;expression dans des cellules différentes peuvent être comparés. ontenu &quot;&gt; [3]. Remarque: Les cellules fixées sont imagés avec la densité neutre (ND) (figure 1, de composants optiques n ° 5) en place dans le but d&#39;atteindre un taux d&#39;activation lente, de sorte que chaque molécule individuelle peut être identifié avec précision le filtre ND est retiré lorsque l&#39;imagerie des cellules vivantes pour augmenter la vitesse d&#39;activation, tout en maintenant une faible probabilité de deux molécules étant activés simultanément dans une zone limitée par la diffraction. La vitesse plus rapide appliquée à imagerie des cellules vivantes est nécessaire de diminuer le temps d&#39;acquisition total, ainsi «geler» l&#39;O-ring en temps et en limitant l&#39;effet de photovieillissement de la cellule. [4] Remarque: Les numéros de trames acquises ont été optimisés pour notre système et dépendent de la structure cellulaire particulier, l&#39;étiquetage densité, taux d&#39;activation et si l&#39;évacuation de l&#39;ensemble du pool de fluorophores est important pour l&#39;analyse. Dans les cellules vivantes, il est important d&#39;obtenir un nombre suffisant de localisations dans une période aussi courte de time que possible pour éviter le flou de l&#39;image dû au bougé de la structure cellulaire. 4. Construction image PALM <ol><li> Déterminer la position de centre de gravité de chaque spot détecté. <ol><li> Chargez la pile d&#39;images dans Matlab (The MathWorks, Inc.) </li><li> Découper l&#39;empilement d&#39;image à une région autour d&#39;une cellule qui ne comprend pas tous les cordons repères. </li><li> Sélectionnez un seuil d&#39;intensité pour la détection endroit qui est au-dessus du niveau de fond, mais en dessous de la moyenne intensité de la tache. Nous tenons compte de la variation du niveau de fond tout au long d&#39;une expérience en calculant la moyenne de fonctionnement de l&#39;intensité maximale en utilisant un cadre de fenêtre 150. Le seuil d&#39;intensité pour chaque trame est ensuite interpolée à partir des valeurs moyennes de fonctionnement. </li><li> Soustraire le seuil respectif de chaque trame. Endroits potentiels sont identifiés comme trois pixels adjacents avec des intensités dessus du seuil. </li><li> Adapter l&#39;intensité de fluorescence de chaque point potentiel à un Gaussia bidimensionneln fonction [Equation 1] en utilisant un algorithme des moindres carrés non linéaire (figure 2). La précision de localisation de chaque point est calculée en utilisant le nombre total de photons détectés [équation 2]. N&#39;importe quel endroit mal-ajustement avec une précision de localisation supérieure à 20 nm (cellules fixes) ou 45 nm (cellules vivantes) est éliminée (voir note n ° 5). N&#39;importe quel endroit avec une intensité supérieure à deux volets de l&#39;intensité moyenne, probablement à cause de chevauchement des émetteurs, est également rejeté. </li><li> Pour les cellules fixes, retirer des observations répétées de la même molécule en faisant abstraction de toute tache dont le centre de gravité se trouve dans la position 45 nm de toute autre tache qui l&#39;a précédé de 6 trames ou moins. Pour les cellules vivantes, tous les points sont conservés. </li></ol></li><li> Calibrer la dérive échantillon en utilisant le mouvement de repère de calage. <ol><li> Cultures sur une zone de pixels 10x10 autour d&#39;un marqueur de repère. </li><li> Soustraire le seuil respectif déterminé en 4.1.3 de chaque trame. </li><li> Monter le profil d&#39;intensité dans chaquebâti par l&#39;intermédiaire des moindres carrés algorithme d&#39;ajustement en supposant une forme gaussienne bidimensionnelle. </li><li> Calculer le déplacement entre les positions des centroïdes par rapport à l&#39;image 1. </li></ol></li><li> Corriger la position du centre de gravité de chaque molécule unique identifié en 4.1 avec la dérive appropriée de l&#39;échantillon calculée en 4.2. Comparer les images en fond clair acquises en 3,7 et 3,10. Si les cellules sont observées à se déplacer par rapport aux balises de repère, les données sont jetés. </li><li> Superposer toutes les positions corrigées centroïde sur une seule image composée de pixels 15x15 nm. Tracer chaque molécule unique comme une unité de surface, à deux dimensions profil gaussien centré à la position de centre de gravité, avec un écart-type égal à la précision de localisation [Equation 2]. Il en résulte une carte de densité de probabilité, où l&#39;intensité d&#39;un pixel est proportionnelle à la probabilité de trouver une molécule dans ce pixel (Figure 3Aiv). </li><li> En comparant les images PALM aux images ensemble. <ol><li> Replot le centropositions id comme en 4.4, mais sur un plan de 150x150 pixels nm et un écart type égal à 250 nm. Cela génère une image qui imite PALM une image de diffraction limitée, qui peut être utilisé pour comparer l&#39;image de diffraction limitée ensemble, acquis en 3,8 (Figure 3Aiii). </li><li> Pour confirmer que les molécules détectées sont représentatifs de l&#39;ensemble de la population, comparer l&#39;image d&#39;ensemble reconstruite (Figure 3Aiii, étape 4.5.1) avec l&#39;image de fluorescence ensemble expérimental (Figure 3Aii, étape 3.8) pour confirmer que les deux images montrent des structures de forme similaire , l&#39;orientation et l&#39;intensité relative. </li></ol></li></ol> [5] Remarque: La précision de localisation minimum requis a été déterminé de manière empirique pour chaque méthode d&#39;imagerie en traçant les précisions de toutes les molécules d&#39;un échantillon donné et en choisissant un seuil approprié. 5. Analyse d&#39;images PALM <ol><li> Mesure de Z-Ring Width et diamètre. <ol><li> Faire pivoter l&#39;image de manière à PALM verticalement orienter l&#39;axe longitudinal de la cellule (figure 4A). </li><li> Cultures sur la région cellulaire contenant le O-ring. </li><li> Calculer l&#39;intensité cumulée par projection d&#39;une courbe d&#39;intensité le long de l&#39;axe de temps de la cellule. </li><li> Adapter le profil d&#39;intensité à une distribution gaussienne. La largeur de l&#39;anneau est défini comme le maximum moitié pleine largeur (FWHM) de la distribution gaussienne ajustée (Figure 4B). </li><li> Projeter le profil de l&#39;intensité cumulée 5.1.2 long de l&#39;axe court de la cellule. Le diamètre de l&#39;anneau est définie comme la longueur du profil d&#39;intensité (figure 4C). </li></ol></li><li> Tracé Densité FtsZ (voir note 6). <ol><li> Replot les positions centroïdes que dans (4,4), mais sans que le profil gaussien de telle sorte que chaque molécule unique est attribué une valeur de 1 et affecté à un seul pixel correspondant à sa position de centre de gravité. De cette façon, l&#39;intensité de chaquepixel représente le nombre total de molécules détectées dans ce pixel. L&#39;image PALM densité peut également être visualisée comme un tracé de contour (figure 5E). </li></ol></li><li> Détermination de la résolution spatiale. <ol><li> Théoriquement, réalisables résolution spatiale: créer un PSF représentant pour la totalité de l&#39;échantillon en utilisant la précision de localisation moyenne déterminée de toutes les molécules détectées et calculer la FWHM (équation 3). </li><li> Expérimentalement atteint une résolution spatiale: calculer le déplacement moyen entre les observations répétées de la même molécule. </li></ol></li></ol> [6] Note: Nous avons utilisé une réflexion interne totale PALM (TIR-PALM, figure 1 et 5) pour restreindre l&#39;activation et d&#39;excitation à une couche mince (~ 200 nm) au-dessus de l&#39;interface cellule / verre. de sorte que seules les molécules FtsZ associés à la membrane le plus proche de la lamelle sera détecté.

<ol><li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li>
<li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li>
<li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+%28ftsZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li>
<li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li>
<li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings%2C+structural+homologs+of+tubulin+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li>
<li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li>
<li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+%28PALM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li>
<li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers%3A+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li>
<li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li>
<li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Images PALM contiennent des informations sur compte molécules et fonctions au sein d&#39;une cellule, ce qui permet une analyse détaillée de la répartition et l&#39;agencement des molécules de protéines cibles qui est difficile à obtenir par d&#39;autres moyens. Ci-dessous, nous présentons les précautions qui doivent être prises pour en extraire des informations quantitatives précises tout en maintenant la pertinence biologique des images PALM. Nous explorons également les informations qui peuvent être obtenues en utili...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> 50 x MEM acides aminés </td><td> Sigma </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 x MEM Vitamines </td><td> Sigma </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46 à 102-RF </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldéhyde 16% </td><td> Electron Sciences Micrsocopy </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> GTG Agarose SeaPlaque </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 perles d&#39;or nm </td><td> Microsphères-Nanosphères </td><td> 790113-010 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 imagerie Chambre </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Adaptateur étape </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope inversé </td><td> Olympe </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> NA 1,45, 60x Objectif </td><td> Olympe </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD caméra </td><td> Andor Technology </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488-nm laser saphir </td><td> Cohérent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 561-nm laser saphir </td><td> Cohérent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laser CUBE 405-nm </td><td> Cohérent </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging division de la machinerie bactérienne

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

La division cellulaire bactérienne nécessite l&#39;assemblage coordonné de plus de dix protéines essentielles à midcell 1,2. Au cœur de ce processus est la formation d&#39;une superstructure en forme d&#39;anneau (O-ring) par la protéine FtsZ au plan de 3,4 division. Le Z-ring se compose de plusieurs protofilaments FtsZ simple brin, et de comprendre l&#39;agencement des protofilaments à l&#39;intérieur de l&#39;O-ring donnera un aperçu du mécanisme de Z-anneau de montage et de sa fonction en tant que générateur de 5,6 vigueur. Cette information est resté inaccessible en raison des limites actuelles de la microscopie par fluorescence et par microscopie électronique conventionnelle. Microscopie à fluorescence conventionnelle est incapable de fournir une image à haute résolution de l&#39;O-ring en raison de la limite de diffraction de la lumière (~ 200 nm). Electron cryotomographic imagerie a détecté dispersés dans les petites protofilaments FtsZ C. cellules crescentus 7, mais est difficile à appliquer à des cellules plus grandes telles queE. coli ou B. subtilis. Nous décrivons ici l&#39;application d&#39;une méthode de super-résolution microscopie à fluorescence, microscopie Localisation photoactivé (PALM), pour caractériser quantitativement l&#39;organisation structurelle de l&#39;E. coli O-ring 8. PALM offre à la fois l&#39;imagerie à haute résolution spatiale (~ 35 nm) et un étiquetage spécifique pour permettre une identification sans ambiguïté des protéines cibles. Nous avons étiqueté FtsZ avec la protéine fluorescente mEos2 photoactivable, qui passe du vert fluorescence (excitation = 488 nm) au rouge fluorescence (excitation = 561 nm) lors de l&#39;activation à 405 nm 9. Au cours d&#39;une expérience PALM, simples FtsZ-mEos2 molécules sont activées stochastiquement et les positions correspondantes barycentre des molécules individuelles sont déterminées avec une précision &lt;20 nm. Une image de super-résolution de l&#39;O-ring est ensuite reconstruite par superposition des positions des centroïdes de tous détectés FtsZ-mEos2 molécules. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En utilisant cette méthode, nous avons constaté que l&#39;O-ring a une largeur fixe de ~ 100 nm et est constitué d&#39;un faisceau lâche de protofilaments FtsZ qui se chevauchent les uns avec les autres en trois dimensions. Ces données fournissent un tremplin pour d&#39;autres études sur les changements du cycle cellulaire dépendant de la 10 Z-ring et peut être appliquée à d&#39;autres protéines d&#39;intérêt.

Illustré à la figure 3Aiv est un bidimensionnelle, de super-résolution de rendu de l&#39;anneau Z-générée à partir de la méthode d&#39;imagerie PALM décrit ci-dessus. Ci-dessous, nous résumons les informations qualitatives et quantitatives qui peut être obtenu de leur part. Qualitativement, nous avons observé que l&#39;O-ring est une structure irrégulière qui adopte plusieurs configurations (bande unique ou d&#39;un arc hélicoïdal) qui ne sont pas distinguées dans convention...

Nous décrivons une méthode de super-résolution d&#39;imagerie pour sonder l&#39;organisation structurelle de la FtsZ torique bactérienne, un appareil essentiel pour la division cellulaire. Cette méthode est basée sur des analyses quantitatives de photoactivées localisation de microscopie (PALM) images et peut être appliquée à d&#39;autres protéines du cytosquelette bactérien.

Super-resolution Imaging Division de la machinerie bactérienne

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

L’objectif global de l’expérience suivante est d’obtenir des informations structurelles quantitatives sur les protéines de division cellulaire d’E coli dans leur environnement natif. Ceci est réalisé en exprimant une protéine de fusion photo-active fluorescente dans des cellules vivantes et en immobilisant ces cellules sur un coussinet de gel acro. Les cellules sont ensuite imagées par le biais d’une vidéo en continu.Alors que des lasers d’excitation et d’activation sont appliqués pour visualiser l’emplacement d’une molécule unique, les films résultants sont analysés par calcul pour extraire les positions des molécules avec une précision nanométrique et les superposer pour générer une image de super résolution. Cette image peut ensuite être analysée par une variété de mesures quantitatives qui décrivent la structure d’intérêt, y compris ses dimensions et la densité des molécules. La localisation photoactivée, la microscopie ou la paume est une technique de microscopie à fluorescence à super résolution facilement mise en œuvre.L’instrumentation est simple, mais minutieuse L’optimisation de l’acquisition et de l’analyse des données est nécessaire pour générer des résultats fiables. Une autre étape cruciale est l’étendue de la caractérisation de votre protéine de fusion et de votre niveau d’expression pour s’assurer que vos résultats sont biologiquement pertinents. Le protocole suivant a été optimisé pour la protéine FTSZ fusionnée Muse two et doit être adapté à la protéine qui vous intéresse.Pour commencer, inoculer le milieu LB avec une seule colonie de la souche d’intérêt contenant une protéine par fluorescence préparée comme décrit dans le protocole écrit. Accompagnant cette vidéo, cultivez pendant la nuit dans un shaker à 37 degrés Celsius le lendemain. Diluez la culture un à 1000 dans M neuf plus un minimum de milieu.Croître jusqu’à la phase mi-log en présence d’un antibiotique approprié à température ambiante, puis induire la culture à produire des protéines avec 20 micromolaires IPTG pendant deux heures. Pendant ce temps, assemblez la chambre d’imagerie en préparant une solution agro à 3 % dans M neuf moins le milieu. Faites fondre les agros à 70 degrés Celsius dans un bloc chauffant de paillasse pendant 40 minutes.Conservez les agros fondus à 50 degrés Celsius jusqu’à cinq heures. Placez une lame de micro-aqueduc propre dans la moitié supérieure de la chambre d’imagerie, les électrodes vers le bas. Alignez le joint inférieur sur la glissière du micro-aqueduc de manière à couvrir les canaux de perfusion.Appliquez environ 50 microlitres d’aros fondus au centre du verre. Faites glisser immédiatement la gouttelette de gel Agros avec une lamelle propre et sèche. Laissez le gel se solidifier à température ambiante pendant au moins 30 minutes après l’induction des protéines.Granulez la culture dans une micro-centrifugeuse. Resus. Mettre en suspension la pastille dans un volume égal de M neuf, plus une centrifugation répétée et une suspension de réanimation après la deuxième suspension de résus. Poursuivez la croissance à température ambiante pendant deux heures.Ensuite, fixez la culture induite en ajoutant de l’aldéhyde paraforme dans le PBS pour obtenir une concentration finale de 4 % d’aldéhyde paraforme. Si vous devez procéder à l’imagerie de cellules vivantes, consultez le protocole écrit accompagnant cette vidéo pour connaître les variations de la procédure, laissez la culture incuber à température ambiante pendant 40 minutes. Granulez la culture et remettez-la en suspension dans un volume égal de PBS.Ensuite, diluez des billes d’or de 50 nanomètres, une à 10 avec une culture en suspension. Pour appliquer l’échantillon dans la chambre d’imagerie préparée, retirez soigneusement la lamelle, en laissant le tampon de gel sur la lame du micro-aqueduc. Ajoutez immédiatement un microlitre d’échantillon de culture cellulaire sur le dessus du tampon de gel.Attendez environ deux minutes pour que la solution soit absorbée par le tampon de gel et complétez le tampon de gel avec une nouvelle lamelle propre et sèche. Continuez à assembler l’ensemble de la chambre d’imagerie conformément aux instructions du fabricant pour l’acquisition d’images. Allumez la caméra du microscope et les lasers.Ouvrir le logiciel metamorph par des dispositifs moléculaires. Placez les filtres d’excitation et d’émission appropriés dans le chemin d’imagerie, comme illustré dans ce schéma de microscope, qui peut être trouvé dans la procédure écrite accompagnant cette vidéo. Réglez ensuite les paramètres de puissance et d’acquisition du laser.Verrouillez correctement la chambre d’imagerie dans la platine à l’aide de l’adaptateur de platine complémentaire. Concentrez-vous sur la surface des cellules les plus proches de la lèvre de la glissière de couverture. Désignez une région d’imagerie appropriée qui est éclairée de manière homogène par les trois lasers.Identifiez une zone d’échantillon qui contient à la fois des cellules et des marqueurs repères, qui sont les perles d’or proches les unes des autres, mais qui ne se chevauchent pas. Acquérez une image en fond clair avec un temps d’intégration de 50 millisecondes et déplacez la mise au point de 0,5 micromètre dans l’échantillon. Ensuite, acquérez une image de fluorescence verte d’ensemble avec excitation à partir du laser de 488 nanomètres en utilisant un temps d’intégration de 50 millisecondes.Ensuite, acquérez des vidéos en streaming avec un éclairage continu à partir de lasers de 405 nanomètres et 561 nanomètres. Pour les cellules fixes, une fréquence d’images de 50 millisecondes est utilisée pour un total de 20 000 images. Avec une puissance laser de 405 nanomètres augmentée d’environ 10 % toutes les 1000 images, les 500 premières images sont présentées.Notez que le nombre de trames acquises a été optimisé pour ce système et dépend de la structure cellulaire particulière. L’étiquetage de la densité, du taux d’activation et de l’épuisement ou non de l’ensemble du bassin de sols est important pour l’analyse : pour effectuer la construction d’images. Tout d’abord, identifiez les points potentiels dans le flux d’images lorsque trois pixels adjacents dont l’intensité est supérieure à un seuil déterminé empiriquement ajustent l’intensité de chaque point prospectif à une fonction gaussienne bidimensionnelle.Pour identifier la position de la molécule et le nombre total de photons émis, calculez la position de localisation de chaque point à l’aide du nombre total de photons détectés. Ensuite, éliminez les points mal ajustés en appliquant un seuil de précision de localisation et supprimez les observations répétées de la même molécule en ne tenant pas compte de tout point situé à moins de 45 nanomètres et à six images de tout point suivant correct pour la dérive de l’échantillon. En soustrayant le déplacement dépendant de l’image des perles d’or de chaque position de molécule, on superpose toutes les positions de molécules corrigées sur une seule image composée de 15 pixels sur 15 nanomètres, en traçant chaque molécule unique comme une unité de surface, un profil gaussien bidimensionnel avec un écart-type égal à la précision de localisation.L’image résultante est une carte de densité de probabilité où l’intensité d’un pixel est proportionnelle à la probabilité de trouver une molécule. Dans ce Pixel illustré. Voici un rendu en super résolution bidimensionnelle du ZR généré à partir de la méthode d’imagerie Palm.Qualitativement, il a été observé que l’anneau Z est une structure irrégulière qui adopte de multiples configurations, telles que des bandes simples ou des arcs hélicoïdaux qui ne sont pas distinguables dans les images de fluorescence conventionnelles. De telles observations peuvent être utilisées pour déterminer le pourcentage de la population cellulaire qui présente une configuration structurelle particulière. Les dimensions du ZR peuvent également être mesurées à partir de ce graphique.La largeur de l’anneau a été déterminée à 113 nanomètres. Cette valeur est plus large que la largeur attendue d’un seul protofilament FDSC, qui est de cinq à 10 nanomètres selon la microscopie électronique in vitro. Ici, le diamètre de l’anneau est mesuré à 1050 nanomètres.Ce diamètre peut être utilisé pour décrire quantitativement le degré de constriction lors de la division cellulaire. Une autre approche quantitative consiste à calculer la densité moléculaire en comptant le nombre de molécules localisées dans une région définie. Étant donné que les images de la paume sont des projections 2D d’objets 3D, la réflexion interne totale ou la paume TIR doit être utilisée pour restreindre le plan de détection à un seul côté de l’anneau Z.Étant donné que les molécules tracées représentent un sous-ensemble de la population totale de FDSC, la densité déterminée est une limite inférieure de la densité réelle. La densité maximale observée sur les images TIR de l’anneau Z suggère que certaines sections contiennent des protofilaments qui se chevauchent. Lors de cette procédure, il est important de surveiller la morphologie cellulaire et le taux de croissance afin de s’assurer que l’expression de votre protéine de fusion n’affecte pas la viabilité cellulaire.Une fois que cette procédure est établie pour la protéine qui vous intéresse, elle peut être utilisée pour tester les changements structurels associés à la progression du cycle cellulaire ou étendue à l’imagerie à deux couleurs pour comparer les distributions faciales de plusieurs protéines.

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