Name: Le dosage de dommages de lADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de lessai de comète (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: Découvrez le dosage des dommages de l'ADN dans les neurones hippocampiques par l'essai de comète. Cette méthode sensible permet de quantifier les cassures simples et doubles brins pour étudier l'intégrité génomique neuronale.

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Ce travail a été soutenu par le prix IMPACT du Département de radio-oncologie de l&#39;Université d&#39;Alabama-Birmingham Comprehensive Cancer Center, la Fondation du cancer de l&#39;enfance de combat, et l&#39;Ange Gabrielle Fondation (à ESY.).

1. Culture cellulaire <ol><li> Cellules neuronales Culture et les traitent selon les besoins. </li><li> Récolte des cellules dans des tubes de 15 ml: médias aspirés, rincer avec du tampon phosphate salin (PBS, de calcium et de magnésium libre), ajouter la trypsine, la collecte en tubes de 15 ml et neutraliser la trypsine avec appropriées milieux contenant du sérum. </li><li> Centrifuger à 1000 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer les médias. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans du PBS. </li><li> Centrifuger à 1000 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer les médias et remettre les cellules en PBS frais. </li><li> Compter les cellules à l&#39;aide d&#39;un hématimètre ou votre compteur de cellules préféré. </li><li> Des échantillons de cellules doit être préparée immédiatement avant de commencer le dosage. </li><li> Tous les échantillons doivent être manipulés à la lumière noire ou jaune pour éviter d&#39;endommager l&#39;ADN de la lumière ultraviolette. </li></ol> 2. Comet Assay 1. Préparation de la lame <ol><li> Faire fondre 1% (1 g / 100 ml 1X Tris Base, acide borique, de l&#39;EDTA, la tuberculose agaroseE) dans un four micro-ondes pendant 3 min jusqu&#39;à ce que tous les granules disparaissent. </li><li> Tremper les lames dans l&#39;agarose fondu et essuyez un côté nettoyer avec un Kimwipe. Laisser l&#39;agarose sécher à l&#39;air d&#39;un film transparent. Cela peut être fait à l&#39;avance et les glissières peuvent être stockés. </li></ol> 2. Comet Assay neutre <ol><li> Une solution de lyse froid (2,5 M NaCl, 100 mM d&#39;EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% de sodium lauryl sarcosinate, et 1% de Triton X-100, pH 10), à 4 ° C pendant au moins 1 heure avant utilisation. </li><li> 2.2.2. Faire fondre 1% d&#39;agarose à bas point de fusion (1 g / 100 ml dans 1X Tris Base, de l&#39;acide borique, de l&#39;EDTA) dans un micro-ondes pendant 3 minutes jusqu&#39;à ce que tous les granules disparaissent. L&#39;agarose a besoin d&#39;être refroidi à 37 ° C dans un bain d&#39;eau pour éviter l&#39;induction artificielle de la queue de la comète. Idéalement, l&#39;agarose doit être refroidie pendant une demi-heure avant utilisation. </li><li> 2.2.3. Diluer la suspension de cellules de sorte qu&#39;il ya 100.000 cellules par ml. Mélanger la suspension cellulaire avec le faible point de fusion d&#39;agarose (à 37 ° C)un ratio de 1:10 (v / v), homogénéiser brièvement au vortex, et immédiatement pipette 50 ul sur la diapositive Comet. Utiliser le côté de la pointe de pipette pour répandre la suspension de cellules uniformément sur toute la surface de l&#39;échantillon. Chaque groupe de traitement doit être au moins en triple exemplaire. </li><li> Lieu glisse à plat au réfrigérateur pendant 30 min jusqu&#39;à ce que le cercle apparaît dans la périphérie de la lame. </li><li> Prérefroidissement la solution de lyse et les diapositives plonger dans cette solution pendant 30 min à l&#39;obscurité à 4 ° C (ou au réfrigérateur). </li><li> Décanter ou aspirer la solution de lyse et ajouter 1X tampon d&#39;électrophorèse neutre (Tris base, l&#39;acide borique, de l&#39;EDTA, 1X TBE). Laisser les lames dans cette mémoire tampon pendant une demi-heure au réfrigérateur. </li><li> Ajouter prérefroidi tampon 1X électrophorèse neutre (TBE) dans la chambre d&#39;électrophorèse, placer les lames dans plateau coulissant électrophorèse. Aligner lames afin qu&#39;elles soient équidistantes à partir d&#39;électrodes. </li><li> Verser 1X tampon d&#39;électrophorèse neutre jusqu&#39;à 0,2 cm au-dessus des diapositives. Excès de tampon sera interFère par électrophorèse. </li><li> Régler la tension d&#39;alimentation de 1 V par cm (mesurée électrode à l&#39;autre) et tourner pendant 30 min à 4 ° C (ou la chambre froide) dans l&#39;obscurité. </li></ol> 3. Comet Assay alcalin <ol><li> Une solution de lyse froid (2,5 M NaCl, 100 mM d&#39;EDTA pH 10, 10 mM Tris Base, 1% de sodium lauryl sarcosinate, et 1% de Triton X-100, pH 10), à 4 ° C pendant au moins 1 heure avant utilisation. </li><li> Faire fondre 1% d&#39;agarose à faible point de fusion (1 g / 100 ml 1X Tris Base, de l&#39;acide borique, de l&#39;EDTA) dans un micro-ondes pendant 3 minutes jusqu&#39;à ce que tous les granules disparaissent. Puis refroidir dans un bain à 37 ° C pendant au moins 30 min. </li><li> Combiner des cellules à 1 x 105 / ml avec fondu à faible point de fusion d&#39;agarose (à 37 ° C) dans un rapport de 1:10 (v / v), homogénéiser brièvement au vortex, et immédiatement pipette 50 ul sur la diapositive Comet. Utiliser le côté de la pointe de pipette pour répandre la suspension de cellules uniformément sur toute la surface de l&#39;échantillon. Chaque groupe de traitement doit être au moins en triple exemplaire. </li><li> Lieu glissées plat au réfrigérateur pendant 30 min jusqu&#39;à ce que le cercle apparaît dans la périphérie de la lame. </li><li> Immerger les lames dans une solution de lyse refroidies et laisser à 4 ° C pendant 1 heure ou toute la nuit dans l&#39;obscurité. </li><li> Sortir les lames de la solution de lyse, les lames de vidange et de rinçage une fois avec du tampon de neutralisation froid pendant 5 minutes pour éliminer le détergent résiduel et les sels avant l&#39;étape de déroulement en milieu alcalin. </li><li> Placer les lames dans une chambre remplie d&#39;électrophorèse sur gel d&#39;électrophorèse tampon prérefroidi fraîchement préparé (300 mM NaOH, 1 mM EDTA,&gt; 13 pH) ne doit pas dépasser 0,5 cm au-dessus des diapositives. Aligner lames afin qu&#39;elles soient équidistantes à partir d&#39;électrodes. </li><li> Laissez diapositives s&#39;asseoir dans le tampon alcalin pendant 30 min dans l&#39;obscurité pour permettre déroulement de l&#39;ADN et l&#39;expression de l&#39;alcali-responsable des dégâts. </li><li> Régler la tension d&#39;alimentation de 1 V par cm (mesurée électrode à l&#39;autre) et tourner pendant 30 min à 4 ° C (ou la chambre froide). </li></ol> 4. Fixation et StaLes cellules sable de l&#39;examen <ol><li> Égoutter l&#39;excès de tampon d&#39;électrophorèse </li><li> Plonger les lames dans prérefroidi de l&#39;eau distillée pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Immerger les lames dans prérefroidi l&#39;éthanol à 70% pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Des échantillons secs pendant la nuit. Ne pas exposer à la lumière des diapositives. Échantillons peuvent être conservés pendant des mois à la température ambiante avant de marquer à ce stade. </li><li> Colorer les lames en les immergeant dans SYBR Green (dilué dans du PBS 1X) pendant 20 min au réfrigérateur. </li><li> Retirer les lames et laissez-les sécher complètement dans le noir. L&#39;agarose devient transparent lorsqu&#39;il est complètement sec. </li></ol> 4. Acquisition et analyse d&#39;images <ol><li> Acquérir des images à l&#39;aide microscope à fluorescence réglé sur le filtre vert (Zeiss AxioVision) et d&#39;analyser l&#39;aide du logiciel Comet Assay (Perceptive Instruments). </li><li> Cliquez sur &quot;tête de comète&quot; (le noyau) et le logiciel calcule les paramètres, y compris le moment et le montant moyen de la queue de l&#39;ADN dans lenoyau. </li><li> Analyser au moins 200 cellules par traitement. </li><li> Exporter des données vers Microsoft Excel. </li><li> Calculer la moyenne instant queue pour chaque groupe de traitement et les données des placettes, le cas échéant. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Un exemple d&#39;analyse test des comètes sur des cellules neuronales est illustré à la figure 2 et la figure 3. Dans ce cas, l&#39;irradiation des cellules neuronales induit dommages à l&#39;ADN. Que les cellules sont soumises au champ électrique, l&#39;ADN migre à des vitesses différentes en raison des différences de taille, qui est ensuite analysées en utilisant le logiciel essai de comète. Plus le dommage à l&#39;ADN, l&#39;ADN migre plus loin la hors du noyau. Cela diminue l&#39;intensité de fluorescence dans le noyau qui est ensuite capté par le logiciel et les résultats dans le moment plus de queue. Tableau 1 présente un tableau représentant de l&#39;analyse et de test des comètes figure 4 montre une représentationgraphe comparant sentant dommages à l&#39;ADN dans les cellules neuronales après une radiothérapie, telle que mesurée par le test des comètes. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Schéma du test des comètes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Images représentatifs de cellules neuronales (A) et sans (B) avec queue de comète. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Analyse test des comètes en utilisant le logiciel Comet Assay. (A) des captures d&#39;écran représentatifs de l&#39;image acquise avec Carl Zeiss microscope à fluorescence et analysées à l&#39;aide CometLogiciel de test. (B) En cliquant sur ​​le noyau ou la «tête de comète&quot; (entouré en vert) génère une carte graphique fluorescent et (entouré en jaune) et une table (C) de données (entouré en rouge). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049fig3large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/50049/50049fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Graphe représentant obtenue en reportant le moment queue moyenne obtenue par l&#39;analyse de dommages à l&#39;ADN dans irradiés et non irradiés en utilisant des cellules neuronales test des comètes neutre. Comme prévu, le rayonnement 3Gy (rayons X) induit dommages à l&#39;ADN tel que représenté par le moment queue moyenne plus élevée dans les cellules irradiées neuronales. Montré est le moment queue moyenne (+ / - erreur standard), ** P &lt;0,01. <img src="/files/ftp_upload/50049/50049table1.jpg" alt="Tableau 1"/> Tableau 1. </strong&gt; tableau représentant obtenue par analyse test des comètes sur irradiés et non irradiés cellules neuronales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50049/50049table1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> .

<ol><li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+a+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: a method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat. Protoc. 1, 23-29 (2006).</li>
<li>Hovhannisyan, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+combination+with+the+comet+assay+and+micronucleus+test+in+genetic+toxicology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in combination with the comet assay and micronucleus test in genetic toxicology.</a> Mol. Cytogenet. 3, (2010).</li>
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<li>Smith, C. C., O'Donovan, M. R., Martin, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hOGG1+recognizes+oxidative+damage+using+the+comet+assay+with+greater+specificity+than+FPG+or+ENDOIII%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">hOGG1 recognizes oxidative damage using the comet assay with greater specificity than FPG or ENDOIII.</a> Mutagenesis. 21, 185-190 (2006).</li>
<li>Rosenquist, T. A., Zharkov, D. O., Grollman, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+a+mammalian+8-oxoguanine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of a mammalian 8-oxoguanine DNA glycosylase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 7429-7434 (1997).</li>
<li>Radicella, J. P., Dherin, C., Desmaze, C., Fox, M. S., Boiteux, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+hOGG1%2C+a+human+homolog+of+the+OGG1+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of hOGG1, a human homolog of the OGG1 gene of Saccharomyces cerevisiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94, 8010-8015 (1997).</li>
<li>Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+gammaH2AX+foci+as+an+indication+of+lethal+DNA+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions.</a> BMC Cancer. 10, 4(2010).</li>
<li>Banath, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+sensitivity%2C+H2AX+phosphorylation%2C+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Res. 64, 7144-7149 (2004).</li>
<li>Bonner, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5Bgamma%5DH2AX+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">[gamma]H2AX and cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 957-967 (2008).</li>
<li>Finney, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+Field+Gel+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Pulsed Field Gel Electrophoresis.</a> Current protocols in molecular biology. , (2000).</li>
<li>Electrophoresis, F. I., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aElectrophoresis%2C+FI+%22Pulsed-field+gel+electrophoresis%22">Pulsed-field gel electrophoresis</a>. , (2000).</li>
<li>Nowsheen, S., Bonner, J. A., Yang, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibitor+ABT-888+reduces+radiation-induced+nuclear+EGFR+and+augments+head+and+neck+tumor+response+to+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The poly (ADP-Ribose) polymerase inhibitor ABT-888 reduces radiation-induced nuclear EGFR and augments head and neck tumor response to radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2011).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le test des comètes a la capacité unique d&#39;analyse de cellules individuelles. Ceci est avantageux pour l&#39;identification des sous-populations de cellules qui démontrent une réponse différentielle aux agents cytotoxiques. A quelques limitations pratiques doivent être prises en compte. Le nombre de cellules qui peuvent être évalués individuellement peuvent varier selon les individus. La taille de l&#39;échantillon doit être augmenté s&#39;il ya variation des dommages à l&#39;ADN dans une population. Viable suspensi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Tubes de 1,5 ml </td><td> Santa Cruz Biotechnology, Inc </td><td> Sc-200271 </td><td></td></tr><tr><td> 10X TBE (Tris base, l&#39;acide borique, de l&#39;EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP13331 </td><td></td></tr><tr><td> Tube de 15 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0553851 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Sigma </td><td> A5093 </td><td></td></tr><tr><td> Le papier d&#39;aluminium </td><td> Fisher Scientific </td><td> 01213101 </td><td></td></tr><tr><td> Gobelet </td><td> Fisher Scientific </td><td> FB102300 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuger </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004261PR </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel Comet Assay </td><td> Comet Assay IV Système d&#39;analyse d&#39;images </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cylindre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08555F </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> GIBCO </td><td> 15575 </td><td></td></tr><tr><td> Chambre d&#39;électrophorèse </td><td> Thermo Scientific </td><td> 09528101 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;éthanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A407P4 </td><td></td></tr><tr><td> Microscope à fluorescence </td><td> Zeiss Axio Vision </td><td></td><td> Toute microscope à fluorescence avec un filtre vert suffira </td></tr><tr><td> Hémacytomètre </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0267152 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;agarose à faible point de fusion </td><td> Promega </td><td> V2111 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-onde </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Saline tamponnée au phosphate, calcium libre, magnésium libre </td><td> HyClone </td><td> SH3025601 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentation </td><td> BioRad </td><td> 1645050 </td><td></td></tr><tr><td> Réfrigérateur </td><td> Sears </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Règle </td><td> Staples </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Glissement </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12550143 </td><td></td></tr><tr><td> De chlorure de sodium </td><td> Sigma </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;hydroxyde de sodium </td><td> Sigma </td><td> S5881 </td><td></td></tr><tr><td> Sodium lauryl sarcosinate </td><td> Fisher Scientific </td><td> S529 </td><td></td></tr><tr><td> SYBR Green </td><td> Invitrogen </td><td> S7585 </td><td></td></tr><tr><td> Plateau </td><td> Fissa science </td><td> 15242B </td><td></td></tr><tr><td> Base de tris </td><td> Sigma </td><td> T6066 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X 100 </td><td> Sigma </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> HyClone </td><td> SH3023601 </td><td></td></tr><tr><td> Vortex </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02216108 </td><td></td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau </td><td> Fisher Scientific </td><td> 154622Q </td><td></td></tr></tbody></table>

le dosage de dommages de l&#39;adn dans les neurones hippocampiques utilisation de l&#39;essai de comète

Assaying DNA Damage in Hippocampal Neurons Using the Comet Assay

Un certain nombre de médicaments ciblent les voies de réparation de l&#39;ADN et induire des cellules tuer en créant des lésions de l&#39;ADN. Ainsi, des procédés pour mesurer directement lésions de l&#39;ADN ont été largement évalués. Les méthodes traditionnelles sont longs, coûteux, et nécessitent beaucoup de ressources de réplication des cellules. En revanche, le test des comètes, un essai de cellule unique électrophorèse sur gel, est plus rapide, non invasif, peu coûteux, mesure directe et sensible de dommages à l&#39;ADN et la réparation. Toutes les formes de dommages à l&#39;ADN ainsi que réparation de l&#39;ADN peut être visualisé au niveau de la cellule unique à l&#39;aide de cette technique puissante. Le principe qui sous-tend le test des comètes est que l&#39;ADN intact est très ordonnée alors dommages à l&#39;ADN perturbe cette organisation. Les suintements d&#39;ADN endommagés dans la matrice d&#39;agarose et lorsqu&#39;il est soumis à un champ électrique, l&#39;ADN chargé négativement migre vers la cathode qui est chargée positivement. Les brins d&#39;ADN endommagés grands ne sont pas en mesure de migrer loin du noyau. Dommages à l&#39;ADNcrée des fragments d&#39;ADN plus petits qui voyagent plus loin que l&#39;ADN intact. Comet Assay, un logiciel d&#39;analyse d&#39;images, mesures et compare l&#39;intensité globale fluorescent de l&#39;ADN dans le noyau avec l&#39;ADN qui a migré hors du noyau. Signal fluorescent de l&#39;ADN migré est proportionnelle à endommager l&#39;ADN. ADN queue plus claire signifie lésions de l&#39;ADN accrue. Certains des paramètres qui sont mesurés sont actuellement queue qui est à la fois une mesure de la quantité d&#39;ADN et de la distribution de l&#39;ADN dans la queue de longueur de queue, et le pourcentage d&#39;ADN dans la queue. Ce test permet de mesurer réparation de l&#39;ADN ainsi car la résolution des lésions de l&#39;ADN signifie la réparation a eu lieu. La limite de sensibilité est d&#39;environ 50 cassures par 1,2 cellule diploïde mammalien. Les cellules traitées avec des agents endommageant l&#39;ADN, tels que l&#39;étoposide, peut être utilisé en tant que contrôle positif. Ainsi, le test des comètes est une procédure rapide et efficace pour mesurer dommages à l&#39;ADN.

Le test des comètes est un moyen efficace de détection de ruptures simple et double brin, y compris alcali-labiles sites et DNA-DNA/DNA-protein liens croisés sur l&#39;ADN dans toutes les cellules, y compris les neurones hippocampiques. La méthode tire parti de la migration différentielle de l&#39;ADN dans un champ électrique dû à des différences de quantité de dommages de l&#39;ADN.

Le dosage de dommages de l&#39;ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l&#39;essai de comète

A number of drugs target the DNA repair pathways and induce cell kill by creating DNA damage. Thus, processes to directly measure DNA damage have been ...

L’objectif global de cette procédure est de mesurer et de quantifier la quantité de dommages à l’ADN dans les neurones à l’aide du test COMET. Ceci est accompli en exposant d’abord les neurones à diverses conditions endommageant l’ADN, en collectant les neurones et en les mélangeant avec des aros à bas point de fusion. La deuxième étape consiste à immobiliser les neurones sur des lames.Ensuite, les neurones sont lysés puis soumis à une électrophorèse dans la dernière étape. L’ADN est taché de cybervert. En fin de compte, la microscopie à fluorescence et le logiciel de test COMET sont utilisés pour visualiser et quantifier les niveaux de dommages à l’ADN dans les neurones individuels.Bonjour, je m’appelle Eddie Yang et je suis professeur adjoint au Département de radio-oncologie de l’Université de l’Alabama à Birmingham. Aujourd’hui, nous allons faire la démonstration du test COMET, qui est une méthode simple pour détecter les dommages à l’ADN dans les cellules. Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes existantes telles que la coloration Gamma H deux foyers A X, ainsi que l’électrophorèse sur gel de champ pulsé, est que cette technique est une méthode directe et sensible pour mesurer les dommages à l’ADN.De plus, avec des modifications mineures de cette technique, le type de dommages à l’ADN peut être déterminé car de nombreuses thérapies anticancéreuses agissent en induisant des dommages à l’ADN dans les tumeurs et agissent souvent en modifiant la capacité de réparation de l’ADN. Les implications de cette technique peuvent être étendues à l’efficacité du traitement du cancer. Mme Samara Noshin, une assistante de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure aujourd’hui et commencera par récolter des cellules neuronales traitées dans les circonstances expérimentales souhaitées dans des tubes de 15 millilitres.Faites tourner les tubes pendant cinq minutes à 1000 fois G et quatre degrés Celsius après avoir aspiré le surnageant. Suspendez la pastille dans du PBS, puis faites tourner à nouveau les cellules après le deuxième lavage. Resus suspend les cellules dans plus de PBS, comptez-les et gardez-les dans l’obscurité jusqu’à ce qu’elles soient utilisées dans le test de comète.Pour éviter d’endommager l’ADN avant de commencer le test en cours, faites fondre 1 % aros au micro-ondes pendant trois minutes jusqu’à ce que tous les granules disparaissent. Trempez ensuite les lames dans l’agros fondu et essuyez un côté avec une lingette Kim. Laissez l’agros sécher à l’air libre jusqu’à obtenir un film transparent pendant que l’agros sèche la solution de lyse froide à quatre degrés Celsius pendant au moins une heure et fondez davantage.1 % agros à faible point de fusion. Refroidir. Ce lot d’agros à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant une demi-heure. Pour éviter l’induction artificielle d’une queue de comète, diluez maintenant la suspension de cellules neuronales récoltée de manière à ce qu’il y ait 100 000 cellules par millilitre.Combinez brièvement la suspension cellulaire avec le point de fusion bas de 37 degrés Celsius à un vortex de rapport de un à 10 et utilisez immédiatement le côté de la pointe d’une pipette pour répartir uniformément 50 microlitres de suspension cellulaire sur la zone d’échantillon de la lame de comète séchée à l’air. Placez les lames traitées à plat au réfrigérateur pendant 30 minutes jusqu’à ce qu’un cercle apparaisse à la périphérie de la lame. Ensuite, immergez les lames dans la solution de lyse pré-refroidie dans l’obscurité à quatre degrés Celsius.Après 30 minutes, aspirez la solution de lyse. Ensuite, incubez les lames dans un tampon d’électrophorèse neutre pendant une demi-heure au réfrigérateur. Ensuite, ajoutez un tampon d’électrophorèse pré-refroidi x neutre dans une chambre d’électrophorèse, puis placez les lames dans le plateau de lames d’électrophorèse, en alignant les lames de manière à ce qu’elles soient également éloignées des électrodes.Après avoir rempli la chambre suffisamment pour couvrir les lames avec 0,2 pouce d’un tampon d’électrophorèse x neutre, réglez la tension d’alimentation à un volt par centimètre et exécutez le test dans l’obscurité pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Commencez par immerger de nouvelles lames traitées à des cellules agros et neuronales dans une solution de lyse fraîche pré-réfrigérée, puis incubez-les dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant une heure à toute la nuit. Ensuite, retirez les lames de la solution de lyse, égouttez-les, puis rincez-les une fois avec un tampon de neutralisation à froid pendant cinq minutes pour éliminer tout résidu avant l’étape d’enroulement alcalin.Placez ensuite les lames dans une chambre d’électrophorèse en gel remplie d’un tampon d’électrophorèse pré-refroidi et fraîchement préparé, ne dépassant pas 0,5 centimètre au-dessus des lames. Incuber les lames dans le tampon alcalin pendant 30 minutes dans l’obscurité pour permettre le déroulement de l’ADN et l’expression des dommages susceptibles d’être alcalins. Ensuite, exécutez le test à un volt par centimètre pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.Après avoir effectué le test de comète, égouttez l’excès de tampon d’électrophorèse, puis plongez les lames dans de l’eau distillée pré-refroidie à température ambiante. Après cinq minutes, plongez les lames dans de l’éthanol pré-refroidi à 70 %, également à température ambiante. Après cinq minutes supplémentaires, laissez sécher les échantillons pendant la nuit, en les gardant à l’abri de la lumière vive.Ensuite, colorez les lames en vert cyber au réfrigérateur pendant 30 minutes. Retirez maintenant les lames et laissez-les sécher complètement dans l’obscurité. Les aros deviendront transparents lorsqu’ils seront complètement secs.Pour acquérir des images du test, utilisez un microscope fluorescent réglé sur le filtre vert. Ouvrez ensuite le programme de test COMET pour analyser les images acquises. En cliquant sur le bouton de la tête de comète, le logiciel calculera les paramètres, y compris le moment moyen de la queue et la quantité d’ADN dans le noyau.Après avoir analysé au moins 200 cellules par traitement, exportez les données vers Microsoft Excel pour le calcul du moment de queue moyen et le traçage des données. Cette première figure montre un exemple d’analyse d’un test COMET de cellules neuronales avec et sans queue de comète. Dans ce deuxième test de comète analysé à l’aide du logiciel de test COMET, il a été déterminé que l’irradiation des cellules neuronales induisait des dommages à l’ADN lorsque les cellules étaient soumises au champ électrique.L’ADN a migré à des rythmes différents en raison des différences de taille analysées par la suite avec le logiciel de test courant. Cette première capture d’écran montre des images représentatives acquises à l’aide du microscope fluorescent à l’aide du programme de test COMET. En cliquant sur le noyau ou la tête de la comète d’une image, on a généré une carte, un graphique et un tableau de données fluorescents.Plus l’ADN était endommagé, plus l’ADN migrait loin hors du noyau. Cela a entraîné une diminution de l’intensité de fluorescence dans le noyau, comme l’indique la couleur verte, et est ensuite détecté par le logiciel, produisant un moment de queue plus élevé. Dans cette dernière figure, un graphique représentatif du moment de queue moyen obtenu en analysant les dommages à l’ADN dans les cellules neuronales irradiées et non irradiées à l’aide d’un test COMET neutre est montré comme prévu trois dommages à l’ADN induits par le rayonnement gris, comme indiqué par le moment de queue moyen plus élevé dans les cellules neuronales irradiées.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler les cellules avec précaution pour éviter l’exposition à la lumière directe et de contrôler la température du pH. C’est ainsi que les cellules ne sont pas soumises à un stress supplémentaire, ce qui pourrait altérer vos résultats Suite à cette procédure. D’autres méthodes, telles que l’analyse de l’ADN, les foyers de réparation via la coloration par immunofluorescence, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur les voies de réparation de l’ADN qui sont modifiées.Par exemple, la coloration immunofluorescente pour les foyers RAD 51 ou phospho, les foyers PK d’ADN peuvent être effectués pour mesurer respectivement la réparation par recombinaison homologue ou non homologue et la réparation d’assemblage.

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La vidéo montre le test de comète pour détecter les dommages à l’ADN après une exposition à des agents nocifs. Dans des conditions alcalines, l’ADN se déroule et se dénature, et lors de l’électrophorèse, l’ADN intact et endommagé migre différemment dans le gel d’agarose, formant une structure en forme de comète. L’ADN non endommagé qui migre lentement forme la tête de comète circulaire, tandis que les fragments d’ADN endommagés qui migrent rapidement forment la queue de comète allongée.

Dosage des comètes pour la détection des dommages à l’ADN dans les cellules

Nous décrivons ici une plate-forme qui permet la détection de test des comètes de dommages à l'ADN avec un débit sans précédent. Les motifs de dispositif de cellules de mammifères dans une puce et permet le traitement parallèle de 96 échantillons. L'approche facilite l'analyse des lésions de l'ADN au niveau de base, les dommages à l'ADN induits exposition et réparation de l'ADN cinétique.

CometChip: Une plate-forme à haut débit de 96 puits pour la mesure de dommages de l&#39;ADN dans les cellules humaines Microarrayed

Test des comètes mesure cassures de l'ADN induites par différents facteurs. Si tous les facteurs (sauf stress oxydatif) causant des dommages de l'ADN sont maintenus constants, le montant des dommages à l'ADN est un bon paramètre indirect de stress oxydatif. L'objectif de ce protocole est d'utiliser test des comètes pour la mesure indirecte du stress oxydatif.

Comet Assay comme une mesure indirecte de stress oxydatif systémique

Le test des comètes alcalines mesure les cassures de brins d’ADN dans les cellules eucaryotes. En ajoutant une étape de digestion de l’endonucléase III ou de la 8-oxoguanine-DNA-N-glycosylase humaine, le test peut détecter efficacement les dommages oxydatifs à l’ADN. Nous décrivons les méthodes d’utilisation de ces tests pour détecter les dommages à l’ADN dans le foie du rat.

In Vivo Alkaline Comet Assay et Enzyme modifiée Alkaline Comet Assay pour mesurer Breaks brin d&#39; ADN et l&#39; ADN oxydative dommages de foie de rat

Le test des comètes est une méthode efficace pour détecter les lésions de l’ADN dont l’ADN simple et double-brin se brise. Nous décrivons la comète neutres et alcalins des essais pour mesurer les lésions de l’ADN dans les cellules cancéreuses pour évaluer les effets thérapeutiques de la chimiothérapie.

Évaluation In Vitro dommages à l’ADN à l’aide du test des comètes

Ce protocole décrit plusieurs procédures pour la préparation d’échantillons de tissus congelés de haute qualité au moment de l’autopsie pour une utilisation dans l’essai de la comète pour évaluer les dommages à l’ADN : 1) tissu haché, 2) cellules épithéliales grattées du tractus gastro-intestinal, et 3) tissu en cubes d’échantillons, nécessitant l’homogénéisation à l’aide d’un dispositif de mincing tissulaire.

Utilisation de tissus congelés dans l’analyse de la comète pour l’évaluation des dommages à l’ADN

Le test de comète est un moyen populaire de détecter les dommages à l’ADN. Cette étude décrit une approche pour exécuter des glissements dans des variantes représentatives du test de la comète. Cette approche a considérablement augmenté le nombre d’échantillons tout en réduisant la durée d’exécution des essais, le nombre de manipulations de lames et le risque d’endommagement des gels.

Une approche de dosage de comète à haut débit pour évaluer les dommages à l’ADN cellulaire

Ce protocole décrit une méthode efficace pour quantifier la différence dans les dommages à l’ADN induits par les inhibiteurs de type I et de type II dans les cellules mutantes FLT3 grâce à l’application du test de comète.

Test de comète pour quantifier les dommages à l’ADN dans les cellules 32D exprimant le mutant FLT3 après une exposition à des inhibiteurs de FLT3 de type I et de type II

Dosage β-amyloïde toxicité utilisant un transgéniques C. elegans</emModèle>

Nous décrivons un protocole qui permet l'imagerie de la mitochondrie dans la vie des neurones par l'intermédiaire de microscopie par fluorescence sur des durées longues. Imagerie sur de longues périodes est accompli par des lentivirus médiée par l'expression d'une protéine fluorescente mitochondrially ciblées et l'utilisation d'un moyen peu coûteux étape-top incubateur qui a été conçu et construit dans notre laboratoire.

Neuromodulation et mitochondriale de transport: Live in Imaging neurones de l&#39;hippocampe sur des durées longues

Découvrez le dosage des dommages de l'ADN dans les neurones hippocampiques par l'essai de comète. Cette méthode sensible permet de quantifier les cassures simples et doubles brins pour étudier l'intégrité génomique neuronale.

Le dosage de dommages de l'ADN dans les neurones hippocampiques Utilisation de l'essai de comète

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