Name: Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Découvrez un test de cytotoxicité cellulaire à haut débit pour les cellules T au niveau unicellulaire. Cette méthode utilise des nano-puits et la microscopie à fluorescence pour étudier l'efficacité des cellules T contre les tumeurs.

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La recherche publiée dans la présente publication a été soutenue par le National Cancer Institute des National Institutes of Health sous R01CA174385 Nombre Award. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de la National Institutes of Health.

1. Préparation des réactifs <ol><li> Préparer un milieu RPMI-PLGH en mélangeant 500 ml du milieu RPMI-1640 et 5 ml de pénicilline-streptomycine, L-glutamine, l&#39;HEPES et de la solution. </li><li> Préparer R10 solution en mélangeant RPMI-PLGH avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS). La FBS est inactivé par la chaleur à 56 ° C pendant 30 min avant l&#39;addition. </li><li> Préchauffer à 37 ° C 50 ml de RPMI-PLGH, 15 ml ml de PBS, et 15 de la R10 dans des tubes coniques stériles. </li><li> Fabrication des tableaux de nanowells dans PDMS: Le maître de silicium est fabriqué en utilisant la photolithographie essentiellement comme décrit précédemment 10. Bien mélanger le Sylgard 184 kit de base élastomère et le durcisseur 10:1 poids dans un gobelet jetable en utilisant un couteau en plastique. Dégazer le mélange dans une chambre à vide pendant 1 heure. Verser le mélange sur le tableau nanowell, sceller avec une lame de verre et laissez-le reposer pendant 30 min. Transfert de l&#39;ensemble dans un four réglé à 80 ° C pendant 2 heures et laisser refroidir à température ambiante pendant 1 heure. L&#39;élastomère sera actue au cours de cette période et la volonté de se lier à la lame de verre. La lame de verre contenant le réseau PDMS nanowell est soigneusement décollé le maître silicium, recouvert avec du scotch et stocké jusqu&#39;à son utilisation future. </li></ol> 2. Cellule cible (T) Marquage <ol><li> Compter 5 millions de cellules de culture de cellules cibles à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et sédimenter les cellules dans un tube de 15 ml stérile conique par centrifugation à 340 g pendant 5 min. La culture de cellules est divisé le jour précédent dans 5 ml de volume total (densité = 1 millions / ml) et cultivées en flacon T-25 (VWR). Protocoles pour le comptage des cellules à l&#39;aide hémocytomètre ont été décrits en détail antérieurement 11 </li><li> Aspirer les supports en excès, laissant derrière d&#39;environ 50 pi de médias. </li><li> Préparer une solution de travail de la cellule Tracker Rouge (CTR) en mélangeant 0,5 ul de stock CTR (1 mM) à 150 ul de RPMI-PLGH (concentration finale 2,5 uM). Ajouter 150 ul de la solution de travail aux cellules cibles et bien mélanger à l&#39;aide d&#39;une pipette P200.Alternativement, PKH 26 (concentration finale de 2 uM) peut être utilisé cellules cibles étiquettes selon les instructions du fabricant. </li><li> Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 20 min. </li></ol> 3. Marquage cellulaire effectrice (E) <ol><li> Compter 5 millions de cellules effectrices de culture de cellules à l&#39;aide d&#39;un hématimètre et le culot des cellules dans un tube de 15 ml stérile conique par centrifugation à 340 g pendant 5 min. </li><li> Aspirer les supports en excès </li><li> Préparer une solution de travail de Vybrant solution Stain DyeCycleViolet en ajoutant 1 pl de 5 stock Violet mM Vybrant à 1 ml de R10 médias (concentration finale de 5 uM). Ajouter la solution de travail à l&#39;aide de cellules et remettre en suspension P200 pipette. Alternativement, PKH 67 (concentration finale de 2 uM) peut être utilisé cellules cibles étiquettes selon les instructions du fabricant. Si PKH 67 est utilisé, alors SYTOX vert ne doit pas être utilisés car ils sont dans le même canal de fluorescence. L&#39;énumération des objectifs de apoptotiques se fait exclusivement en utilisant uncoloration nnexinV dans ce cas. Remarque: Si vous effectuez time-lapse et les mesures de point final non, colorants UV comme Violet Vybrant doit être évitée. </li><li> Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 20 min. </li></ol> 4. Séparation des cellules vivantes et mortes par gradient de densité <ol><li> Ajouter 6,8 ml et 6,0 ml de RPMI-PLGH à la cible et les cellules effectrices, respectivement, et mélanger par pipetage de haut en bas doucement. </li><li> Couche de 3,5 ml de Ficoll-Paque Plus à fond de chaque tube conique contenant la cible et les cellules effectrices. La couche FICOLL lentement pour assurer une bonne formation de couches entre FICOLL et des médias. </li><li> Centrifuger les deux tubes à 340 xg pendant 30 min. sans frein et d&#39;accélération. </li><li> Lors de la centrifugation, transférer 7 ml de PBS préchauffé à une plaque 4-bien. Préparer ensemble nanowell (fabriqué en PDMS): pour nettoyer le fond de la lame de verre avec de l&#39;éthanol et de l&#39;oxydation du PDMS au réglage élevé RF à l&#39;aide d&#39;oxydation plasma pendant 1 min. Cette étape va sterilize la matrice, tout en rendant nanowell le PDMS hydrophile. Immédiatement déplacer la baie nanowell dans la plaque contenant du PBS. </li><li> Placer la plaque d&#39;une enceinte de biosécurité et aspirer excès de PBS. Faire 10 ml 1% de gélose noble par addition de 100 mg de poudre d&#39;agar 10 ml d&#39;eau déminéralisée, puis au micro-ondes pendant 30-45 sec. Appliquer réchauffer 1% d&#39;agar noble sur le bord supérieur et inférieur de lame de verre qui contient le tableau nanowell pour immobiliser le réseau et attendre 10 minutes pour solidifier la gélose à. Ajouter 3 ml de PBS et aspirée agar excès. </li><li> Ajouter 3 ml de R10 sur le haut de gamme nanowell et le laisser s&#39;équilibrer pendant environ 10 min. </li><li> Après la centrifugation sur Ficoll, aspirer 5 ml de milieu de la couche supérieure de chaque tube. Attention de ne pas aspirer la couche contenant les cellules. </li><li> Récolter les cellules (couche blanche) en récupérant 1-2 ml de la couche entre FICOLL et les médias avec P1, 000 pipette et passage à de nouveaux tubes coniques stériles. Répétez cette opération pour les deux ensembles de cellules tout en veillant à ce que vous maximeiser les cellules de récupération. </li><li> Ajouter 3 ml de pré-chauffé RPMI-PLGH dans chaque tube, mélanger par pipetage et par centrifugation à 340 g pendant 5 min à pleine accélération et de freinage. </li><li> Aspirer les supports en excès, ajouter 5 ml de pré-chauffé RPMI-PLGH à chaque tube et répétez centrifugation à 340 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer les supports en excès et remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pl de R10. </li><li> Compter les cellules vivantes en utilisant la méthode d&#39;exclusion du bleu trypan sur un hématimètre. </li></ol> 5. Chargement en cours cellule sur tableau Nanowell <ol><li> Aspirer les supports en excès gamme nanowell et ajouter 2 ml de R10 frais à travers le réseau. Aspirer à nouveau tout en s&#39;assurant que le haut de gamme nanowell n&#39;est pas trop humide / sec car il aura une incidence sur la distribution des cellules. </li><li> Des dépôts 1 x 10 5 cellules effectrices dans 200 pl de R10 sur une surface large nanowell (densité = 5 x 10 5 cellules / ml). </li><li> Laissez cellules se déposent pendant 5 min et en utilisant un chèque-type de tissus culture microscope pour ens&#39;assurer que la distribution des cellules est souhaitable. Ajouter plus de cellules si nécessaire. </li><li> Dépôt de garantie 1 x 10 5 cellules cibles dans 200 ul R10 sur nanowell surface de réseau (densité = 5 x 10 5 cellules / ml). </li><li> Laissez cellules se déposent pendant 5 min et en utilisant un chèque-type de tissus culture microscope pour s&#39;assurer que la distribution des cellules est souhaitable. Ajouter plus de cellules si nécessaire. </li><li> Rincer soigneusement à l&#39;ensemble nanowell 2 ml R10 et aspirer les supports en excès. </li><li> Préparer 3 ml préchauffé R10 dans un tube conique de 15 ml stérile. Ajouter 3 pi de 0,5 mM SYTOX vert Nucleic Acid Stain (concentration finale de 0,5 uM) et 60 pl de l&#39;annexine V-Alexa Fluor 647 pour préparer la solution de travail. Ajouter la solution de travail sur la plaque 4-bien attentivement tout en s&#39;assurant que les cellules ne sont pas déplacés dans les puits. </li><li> Incuber à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant 15 min. </li></ol> 6. Image 1 <ol><li> Acquérir des images de la matrice en utilisant une encre magnétique nanowell fluorescenceoscope: Dans cet exemple, nous utilisons un observateur ZEISS Z-1 microscope équipé d&#39;une platine motorisée et Lambda-DG4. </li><li> Initialiser le logiciel et le microscope et vérifier l&#39;intensité du signal de la lumière transmise et les autres canaux fluorescents. Dans l&#39;ensemble, il y aura cinq canaux correspondant à: la lumière transmise, l&#39;annexine V-647 (Cy5 filtre), CTR (DsRed filtre), SYTOX vert (filtre FITC), et Vybrant Violet (DAPI filtre). Assurez-vous que le microscope il configuré pour assurer un signal au bruit maximal tout en évitant la saturation. </li><li> Réglez la position X et Y de la matrice nanowell. Début du processus de réglage de la position zéro et initialiser l&#39;accent sur le centre de 7 x 7 Bloc de réseau nanowell sur le coin supérieur gauche de la matrice nanowell timbre. Réglez les positions X, Y pour les faire coïncider avec le centre de chaque bloc et la valeur z pour refléter fidèlement l&#39;accent sur chaque bloc. </li><li> Une fois la position et l&#39;orientation constituent tous ensemble, assurez-vous de régler l&#39;acquisition d&#39;images en mode linéaire et acquérir des images. <strong&gt; Remarque: Si nécessaire, à son tour sur l&#39;incubateur et du CO 2 sur le microscope au moins 30 min avant l&#39;expérience. </li></ol> 7. Post-imagerie Placer la plaque 4-puits contenant le tableau nanowell dans un incubateur (37 ° C / 5% CO 2) pendant 6 heures. 8. Imagerie 2 Acquérir les images à la seconde fois, le point comme il est indiqué à l&#39;étape 6. 9. Analyse d&#39;images <ol><li> L&#39;occupation des cellules dans la nanowells est déterminée par l&#39;utilisation de programmes appropriés de segmentation d&#39;image (par exemple ImageJ, <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ), essentiellement comme décrit précédemment 9,12. </li><li> Analyse de la première série d&#39;images de microscope (t = 0 h, t 0) est utilisée pour générer une base de données des nanowells individuels contenant exactement une cellule cible en temps réel (identifiéspar CellTracker rouge, rouge) et pas de cellules mortes (identifié par l&#39;annexine V coloration, vert) [T1T 0 nanowells]. </li><li> Analyse du second ensemble d&#39;images de microscope (t = 6 h, t 6) est utilisé pour déterminer de manière indépendante une seconde base de données contenant des nanowells 1 cellule cible (rouge) [6 T1T nanowells]. Un contrôle d&#39;intégrité (requête de base de données) est mis en œuvre pour s&#39;assurer que toutes les cibles vivantes à t 0 sont adaptés aux objectifs à t 6 pour produire un ensemble final de cibles appariées (mis en œuvre nanowells qui ont T1T 0 = T1T 6, désigné comme T1match) </li><li> Le nombre de cellules effectrices dans nanowells est déterminée en utilisant une coloration violette Vybrant à l&#39;instant t 0 [nanowells E1] </li><li> Une requête de base de données est mis en œuvre pour identifier nanowells contenant effecteurs simples co-incubées avec des objectifs simples (définie comme nanowells qui ont du match E1 et T1, désignés comme E1T1) </li><li> Effecteur l&#39;apoptose induite est marqué par i<html> DENTIFIER cibles qui sont annexine V négatif à l&#39;instant t 0 et l&#39;annexine V positif à l&#39;instant t 4 (E1T1 avec coloration annexine V cible à l&#39;instant t 6). </li></ol> 10. En option imagerie time-lapse de l&#39;abattage Utilisation de Nikon BioStation IM <ol><li> Prenez une boîte de Pétri à fond la lamelle et couper un petit morceau de la puce de réseau nanowell (préparé à l&#39;étape 5) qui s&#39;adaptent exactement sur la lamelle. Assurez-vous que la puce reste humide pendant la coupe. </li><li> Mélanger 1 x 10 6 cibles et 1 x 10 6 cellules T dans 100 ul de médias, et il pipette sur la lamelle. </li><li> Prévoyez environ 15-30 minutes pour laisser les cellules se déposent. </li><li> Rapidement inverser la puce petit tableau nanowell et le placer sur la lamelle. </li><li> Afin de s&#39;assurer que la puce ne sera pas capable de se déplacer pendant l&#39;imagerie, le lieu d&#39;une ou deux lamelles 20mm x 20mm sur la partie supérieure de la puce. Appliquer une pression pour pousser doucement la puce au fond de la cuvette. </li></ol>tente &quot;&gt; Remarque: Le fond de la puce de réseau nanowell est trop épais pour l&#39;imagerie haute résolution et doit donc être renversé Pendant ce temps, la plupart des cellules sont lavées Puisque cela peut ne pas être facilement contrôlées, le nombre de cellules à l&#39;étape 9.2.. et le temps d&#39;incubation de l&#39;étape 9.3 doivent être optimisés.

<ol><li>Louis, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumor+activity+and+long-term+fate+of+chimeric+antigen+receptor-positive+T+cells+in+patients+with+neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma.</a> Blood. 118, 6050-6056 (2011).</li>
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<li>Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparametric+analysis+of+apoptosis+by+flow+and+image+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons décrit le protocole pour un haut débit seule cellule d&#39;essai cytolytique activé via la co-incubation des effecteurs et des cibles dans les tableaux de nanowells (figure 1). En plus de débit d&#39;un avantage majeur de cette technique est la possibilité de surveiller effecteur cytotoxicité à médiation contre des cellules cibles désirées sans avoir besoin de l&#39;ingénierie cellulaire cible qui à son tour permet l&#39;utilisation de autologues ou appariés / primaire cellules tumorales que ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> RPMI-1640 w / o L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 15 à 040 CV- </td><td></td></tr><tr><td> Pénicilline-streptomycine </td><td> Cellgro </td><td> 30-002-CI </td><td> 10.000 UI de pénicilline 10000 ug / ml de streptomycine </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Cellgro </td><td> 25 à 005-CI </td><td> Solution 200 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3537 </td><td> 1M </td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin (FBS) </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> S11150 </td><td> Lot testé </td></tr><tr><td> Cellule Tracker tache rouge </td><td> Invitrogen </td><td> C34552 </td><td> 50 ug </td></tr><tr><td> Vybrant DyeCycle Violet Stain </td><td> Invitrogen </td><td> V35003 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Acide nucléique SYTOX tache verte </td><td> Invitrogen </td><td> S7020 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Annexine V-Alexa Fluor 647 </td><td> Invitrogen </td><td> A23204 </td><td> 500 pi </td></tr><tr><td> PBS Dulbecco </td><td> Cellgro </td><td> 21-031 CV- </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Agar Noble </td><td> DIFCO </td><td> 2M220 </td><td> 100 g </td></tr><tr><td> Bleu trypan </td><td> Sigma Aldrich </td><td> T8154 </td><td> 0,4% de liquide, on filtre stérile </td></tr><tr><td> Hémocytomètre </td><td> Hausser Scientifics </td><td> 1492 </td><td> Ligne claire </td></tr><tr><td> 4-plaque à puits </td><td> Thermo Fisher </td><td> 167603 </td><td></td></tr><tr><td> Harrick Plasma Cleaner </td><td> Harrick Plasma </td><td> PDC-32G </td><td> Basic nettoyeur à plasma </td></tr><tr><td> Observer.Z1 </td><td> ZEISS </td><td&gt; </td><td> Microscope à fluorescence (fonctionne avec les trois parties ci-dessous) </td></tr><tr><td> Lambda 10-3 </td><td> Instrument Sutter </td><td></td><td> Contrôleur de filtre </td></tr><tr><td> Lambda DG-4 </td><td> Instrument Sutter </td><td></td><td> Ultra-High-Speed ​​longueur d&#39;onde de commutation </td></tr><tr><td> Hamamatsu EM-CCD de la caméra </td><td> Hamamatsu </td><td> C9100-13 </td><td> Microscope caméra CCD </td></tr><tr><td> 15 ml tube conique </td><td> BD Falcon </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml tube conique </td><td> VWR </td><td> 3282-345-300 </td><td></td></tr><tr><td> Nikon Biostation </td><td> Nikon Instruments Europe BV </td><td> Biostation IM </td><td></td></tr><tr><td> Boîte de culture à fond de verre </td><td> MatTek Corporation </td><td> P35G-0 </td><td> 35 mm boîte de Petri de 10 mm micropuits </td></tr></tbody></table>

quantitative à haut débit test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules t

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

L&#39;immunothérapie du cancer permet d&#39;exploiter la spécificité de la réponse immunitaire à cibler et à éliminer les tumeurs. Thérapie cellulaire adoptive (ACT) basé sur le transfert adoptif de lymphocytes T génétiquement modifiées pour exprimer un récepteur d&#39;antigène chimérique (CAR) a montré très prometteur dans les essais cliniques 1-4. Il ya plusieurs avantages à utiliser CAR + lymphocytes T pour le traitement de cancers, y compris la capacité de cibler des antigènes du CMH non réglementées et pour fonctionnaliser les lymphocytes T pour la survie optimale, tête chercheuse et de la persistance dans l&#39;hôte, et enfin à induire l&#39;apoptose de CAR + Les cellules T dans le cas de 5 toxicité hôte. La délimitation des fonctions optimales de CAR + lymphocytes T associés à un bénéfice clinique est essentielle pour concevoir la prochaine génération des essais cliniques. Les progrès récents de l&#39;imagerie des animaux vivants comme la microscopie multiphotonique ont révolutionné l&#39;étude de la fonction des cellules immunitaires in vivo 6,7. Bien que ces études ont fait progresser notre compréhension des fonctions des cellules T in vivo, des cellules T ACT basée sur des essais cliniques nécessite la nécessité de relier les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles des cellules T préparations pré-infusion avec une efficacité clinique après la perfusion, en utilisant en tests in vitro des cellules T surveillance des fonctions telles que, la cytotoxicité et la sécrétion de cytokines. Standard de cytométrie en flux ont été basés sur des tests élaborés pour déterminer le fonctionnement global des populations de cellules T au niveau d&#39;une seule cellule, mais celles-ci ne sont pas appropriés pour le suivi et la formation de conjugués vie ou la capacité de la cellule même de tuer plusieurs cibles 8. Microfabriqués tableaux conçus dans des polymères biocompatibles tels que le polydiméthylsiloxane (PDMS) constituent une méthode particulièrement attrayante pour limiter l&#39;espace effecteurs et des cibles dans de petits volumes 9. En combinaison avec la microscopie à fluorescence automatisé time-lapse, quoiqueusands d&#39;effecteur-cible interactions peuvent être surveillés simultanément par des puits individuels d&#39;imagerie d&#39;un tableau nanowell. Nous présentons ici une méthode à haut débit pour la surveillance cytotoxicité à médiation cellulaire T-au niveau d&#39;une seule cellule qui peut être largement appliquée à l&#39;étude de la fonctionnalité des lymphocytes T cytolytiques.

Un exemple de l&#39;application de l&#39;analyse à haut débit cytolytique est démontré dans la figure 2. En bref, étiqueté CD19 spécifique CAR + cellules T ont été co-incubées avec des cellules de souris marqués cibles EL4 dans les puits individuels d&#39;un tableau nanowell (articles 1-5). Une image initiale a été enregistré sur le microscope fluorescent automatisé pour identifier l&#39;occupation (effecteurs et / ou cibles) de chaque nanowell unique sur le réseau (section 6). Traitement de ...

Nous décrivons une cellule unique à haut débit essai pour mesurer la cytotoxicité des lymphocytes T lorsqu&#39;ils sont incubés avec les cellules cibles tumorales. Ce procédé utilise une matrice élastomère dense, de puits sous-nanolitres (~ 100.000 puits / matrice) à l&#39;espace confiner les cellules T et les cellules cibles à des rapports définis et est couplée à la microscopie par fluorescence pour surveiller effecteur-cible conjugaison et l&#39;apoptose subséquente.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Ce système expérimental offre une méthodologie à haut débit pour surveiller la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T au niveau de la cellule unique. Tout d’abord, marquez les cellules T effectrices et les cellules cibles tumorales avec des matrices fluorescentes. Chargez les deux types de cellules sur les réseaux de nano-puits et immergez la puce entière dans un milieu contenant du vert cyt et de la nexine marquée par fluorescence. Cinq.Afin d’identifier à la fois les cellules nécrotiques et apoptotiques, enregistrez maintenant une pré-image initiale pour déterminer l’occupation du puits et la viabilité cellulaire au début du test. Après une incubation de six heures, enregistrez une deuxième image. Utilisez ensuite l’analyse d’image automatisée pour quantifier la lyse spécifique de l’antigène des cellules T EL quatre CD-19 positives par les cellules T positives à la voiture.Les résultats obtenus avec cette méthode à haut débit peuvent cribler la lyse spécifique de l’antigène des cibles par des cellules effectrices sur la base d’une coloration positive à la cytoxine. Cinq. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le test de libérati

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Immunology and Infection

Immunologie et infection

Le test de libération du chrome, un dosage commun pour détecter l'activité des cellules T cytotoxiques, présente plusieurs limitations. En utilisant des cellules T CD8 spécifiques de l'antigène et la ligne de tumeur du cancer du sein humain, SKBR3, dans le présent article, une approche à base d'impédance a été examiné pour la capacité de détecter la destruction des cellules.

Détermination de l&#39;activité cytotoxique CD8 spécifiques optimale des cellules T humaines Her2neu en comparant les Cr51 Essai de libération dans le système de xCELLigence

Cette vidéo présente une méthode de surveillance de l’activité des cellules CAR-T contre les cellules cancéreuses grâce à des mesures d’impédance électrique en temps réel. Le suivi des changements d’impédance évalue l’efficacité des cellules CAR-T à induire la cytolyse des cellules cancéreuses, ce qui donne un aperçu de leurs capacités cytotoxiques.

Un test de cytolyse in vitro en temps réel pour évaluer la puissance des cellules CAR-T

Ce protocole décrit un test de cytotoxicité sensible basé sur des cellules. En énumérant la diminution de la fréquence des lymphocytes T CD4+ cibles vivantes en présence d’un nombre croissant de lymphocytes T CD8+ effecteurs, ce test permet d’évaluer directement l’activité cytolytique des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène.

Test de cytométrie en flux cellulaire pour mesurer l’activité cytotoxique

L'ensemble du test de cytotoxicité de sang (WCA) est un test de cytotoxicité au point en incorporant la technologie de positionnement cellulaire à haut débit à la microscopie par fluorescence et un traitement d'image automatique. Ici, nous décrivons comment les cellules de lymphomes traitées avec un anticorps anti-CD20 peuvent être analysés en temps réel dans le sang total humain pour fournir une analyse quantitative de la cytotoxicité cellulaire.

En temps réel cytotoxicité dans le sang total humain

Un test en temps réel à haut débit a été mis au point pour identifier simultanément (1) les antimicrobiens à pénétration de cellules eucaryotes ciblant un pathogène bactérien intracellulaire, et (2) évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Une variante de la même technologie a ensuite été combinée à la technologie de distribution numérique pour permettre des études faciles, à haute résolution, dose-réponse et en synergie bidimensionnelle et tridimensionnelle.

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Nous présentons dans l'étude d'un nouveau test basé sur la fluorescence en utilisant des lymphocytes dérivés d'une souris transgénique. Ce dosage est adapté pour le criblage à haut débit (HTS) de petites molécules dotées de la capacité de l'une ou l'inhibition de la promotion de l'activation des lymphocytes.

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

Nous décrivons un système d'essai in vitro quantitatif de cytolyse en temps réel pour évaluer la puissance des cellules De T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules tumorales liquides et pleines. Ce protocole peut être étendu pour évaluer d'autres cellules effectrices immunitaires, ainsi que des traitements combinés.

Un analyse de puissance en temps réel pour les cellules T de récepteur d'antigène chimérique ciblant les cellules cancéreuses solides et hématologiques

Un protocole pour évaluer la destruction quantitative des cellules tumorales par les cellules de Jurkat exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) ciblant l’antigène tumoral unique. Ce protocole peut être utilisé comme plate-forme de criblage pour l’optimisation rapide des constructions de charnières CAR avant la confirmation dans les lymphocytes T dérivés du sang périphérique.

Évaluation rapide de la cytotoxicité in vitro du récepteur de l’antigène chimérique exprimant le jurkat à l’aide de l’imagerie fluorescente

Ce protocole décrit une procédure détaillée pour générer des cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR) transitoires à l’aide d’ARNm non intégrateurs pour l’immunothérapie du cancer et fournit des méthodes fiables pour évaluer les cellules CAR-T et leur fonction cytotoxique.

Une approche non virale pour générer des lymphocytes T récepteurs antigéniques chimériques transitoires à l’aide de l’ARNm pour l’immunothérapie du cancer

Ici, nous décrivons une méthode de création de gouttelettes à double émulsion encapsulant un lymphocyte T et une cellule cible cancéreuse afin d’examiner la destruction cellulaire au niveau de la cellule unique. Cette méthode permet une double quantification des molécules cytotoxiques et de l’apoptose des cellules cibles au sein d’une large population de lymphocytes T.

Essai de cytotoxicité basé sur des gouttelettes pour évaluer les lymphocytes T à récepteur de l’antigène chimérique au niveau de la cellule unique

Découvrez un test de cytotoxicité cellulaire à haut débit pour les cellules T au niveau unicellulaire. Cette méthode utilise des nano-puits et la microscopie à fluorescence pour étudier l'efficacité des cellules T contre les tumeurs.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

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