Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Ce système expérimental offre une méthodologie à haut débit pour surveiller la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T au niveau de la cellule unique. Tout d’abord, marquez les cellules T effectrices et les cellules cibles tumorales avec des matrices fluorescentes. Chargez les deux types de cellules sur les réseaux de nano-puits et immergez la puce entière dans un milieu contenant du vert cyt et de la nexine marquée par fluorescence. Cinq.

Afin d’identifier à la fois les cellules nécrotiques et apoptotiques, enregistrez maintenant une pré-image initiale pour déterminer l’occupation du puits et la viabilité cellulaire au début du test. Après une incubation de six heures, enregistrez une deuxième image. Utilisez ensuite l’analyse d’image automatisée pour quantifier la lyse spécifique de l’antigène des cellules T EL quatre CD-19 positives par les cellules T positives à la voiture.

Les résultats obtenus avec cette méthode à haut débit peuvent cribler la lyse spécifique de l’antigène des cibles par des cellules effectrices sur la base d’une coloration positive à la cytoxine. Cinq. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le test de libération de chrome 51 est qu’il est possible d’obtenir de véritables interactions cibles efficaces un à un et de mesurer la fréquence du satellite. L’implication de cette technique s’étend à la thérapie du cancer, car elle permet d’étudier les corrélats d’efficacité dans la thérapie cellulaire autologue Pour fabriquer des nano-puits à l’aide du maître de silicium, mélangez d’abord soigneusement la base du kit d’élastomère cigare 180 4 et l’agent de durcissement à un Rapport de poids de 10 pour un dans un gobelet jetable à l’aide d’un couteau en plastique. Dégazez le mélange dans une chambre à vide pendant une heure.

Versez ensuite le mélange sur le master en silicone et laissez reposer pendant 30 minutes. Maintenant, pour durcir l’élastomère, chauffez l’ensemble dans un four à 80 degrés Celsius pendant deux heures après refroidissement à température ambiante pendant une heure. Retirez avec précaution le réseau de nanopuits PDMS du maître en silicium.

Couvrez-le de scotch jusqu’à utilisation un jour avant le passage de l’expérience 5 millions de cellules cibles dans cinq millilitres. Le jour de l’expérience. Granulez 5 millions de cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres par centrifugation à 340 G pendant cinq minutes.

Aspirez l’excès de milieu en laissant environ 50 microlitres de milieu pour marquer les cellules. Ajoutez 150 microlitres de la solution de travail rouge du traqueur de cellules fraîches et mélangez soigneusement à l’aide d’une pipette P 200, incubez pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. À l’aide d’un hémocytomètre, énumérer les cellules effectrices prélevées sur la culture.

Ensuite, granulez 5 millions de cellules dans un tube conique stérile de 15 millilitres par centrifugation. Aspirez le surplus de support. Ajoutez ensuite une solution de travail fraîche de cinq micromolaires vibrantes de coloration violette et de suspension à l’aide d’une pipette P 200.

Incuber les cellules et les faire mourir pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone à 6,8 millilitres et 6,0 millilitres de R-P-M-I-P-L-G-H pour cibler et mélanger par pipetage, respectivement, et mélanger par pipetage. Ensuite, superposez lentement 3,5 millilitres de fial pack plus au fond de chaque tube, centrifugez les deux tubes à 340 GS pendant 30 minutes sans pause ni accélération pendant la centrifugation, préparez le réseau de nano-puits Transférez d’abord sept millilitres de PBS d’avant-guerre sur une plaque à quatre puits. Nettoyez le fond de la lame de verre avec de l’éthanol à l’aide d’un oxydant plasma.

Traitez le PDMS à un réglage RF élevé pendant 30 à 45 secondes. Placez ensuite le réseau dans le PBS. Transférez la plaque dans une enceinte de biosécurité et aspirez l’excès de PBS, appliquez de la gélose noble chaude à 1 % sur les bords supérieur et inférieur de la lame de verre pour immobiliser le réseau.

Assurez-vous de ne pas laisser sécher le PDMS après 10 minutes à trois millilitres de PBS et d’aspirer l’excès de gélose. Ajoutez ensuite trois millilitres de R 10 sur le dessus du réseau de nano-puits et équilibrez pendant environ 10 minutes. Après la centrifugation Fial, aspirez cinq millilitres de média de la couche supérieure de chaque tube.

En faisant attention de ne pas aspirer la couche contenant les cellules avec une pipette P 1000. Récoltez la couche blanche de cellules entre le fial et le milieu. Transférez les cellules dans de nouveaux tubes coniques stériles.

Maintenant, lavez l’effecteur récolté et les cellules cibles deux fois avec trois millilitres de R-P-M-I-P-L-G-H. Après la centrifugation finale, aspirez l’excédent de média et remettez en suspension la pastille de cellule. Dans 500 microlitres de R 10, comptez les cellules viables à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trian sur un hémocytomètre en aspirant l’excès de milieu du réseau nano will.

Ajoutez ensuite deux millilitres d’aspiration R 10 fraîche. Encore une fois, assurez-vous que le haut du nano réseau n’est ni trop humide ni trop sec, car cela affectera la distribution des cellules. Maintenant, déposez une fois 10 à 10 à la cinquième des cellules fectorales dans 200 microlitres de R 10 sur la surface du réseau de nanovolontés a permis aux cellules de se stabiliser pendant cinq minutes.

Ensuite, à l’aide d’un microscope de culture tissulaire standard, vérifiez la répartition souhaitée des cellules. Ensuite, déposez une fois 10 à la cinquième cellules cibles dans 200 microlitres de R 10 sur la surface du réseau de nano-puits contenant les cellules effectrices. Après cinq minutes, évaluez la distribution cellulaire au microscope.

Ensuite, rincez soigneusement le réseau de nanopuits avec deux millilitres de R 10 et aspirez l’excédent de milieu dans un tube conique stérile séparé de 15 millilitres. Pipeter trois millilitres de préchauffé R 10 à trois microlitres de 0,5 millimolaire de cyt, colorant d’acide nucléique vert, et 60 microlitres d’un X sur cinq LOR 6 47 soigneusement mélangés par pipetage. Maintenant, pipetez doucement la solution de coloration sur la plaque à quatre puits, en vous assurant que les cellules ne sont pas déplacées des puits incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone acquérir des images du réseau de nano-puits à l’aide d’un microscope à fluorescence comme le microscope zes observer Z one, équipé d’une platine motorisée et Lambda DG quatre.

Initialisez le logiciel et le microscope. Vérifiez l’intensité du signal sur la lumière transmise et les autres canaux fluorescents. Ajustez la configuration du microscope pour garantir un rapport signal/bruit maximal tout en évitant la saturation.

Ouvrez maintenant la liste des positions x et Y pour le tableau nelle. Réglez la position zéro XY et mettez le focus à zéro au centre d’un bloc de sept par sept nelle array dans le coin supérieur gauche du tampon nelle array. Réglez les positions XY pour qu’elles coïncident avec le centre de chaque bloc et la valeur Z pour refléter avec précision le focus sur chaque bloc.

Réglez maintenant l’acquisition d’images en mode linéaire et acquérez des images. Après la première série d’imagerie, retournez les réseaux de nanopuits dans l’incubateur de culture cellulaire pendant six heures. Prendre soin de l’agitation peut entraîner un déplacement cellulaire.

Puis répétez l’acquisition des images au deuxième point temporel. Ce test cytolytique à haut débit mesure la fréquence des lyses spécifiques de l’antigène : des cellules T positives spécifiques du CD 19 marquées ont été co-incubées avec quatre cellules cibles EL de souris marquées dans les puits individuels d’un réseau nano L. Les tracés d’histogramme de cellules cibles représentent des puits contenant une seule cellule effectrice et une seule cellule cible.

Après six heures de co-incubation, des histogrammes appariés de cellules cibles sans effecteurs ont été utilisés comme contrôles négatifs pour signaler la fréquence de la mort cellulaire de fond. Il est souhaitable d’obtenir de basses fréquences de lyse non spécifique dans la gamme de deux à 4 %. Le réseau de nano-puits peut être adapté pour l’imagerie en accéléré afin de permettre l’observation de l’effecteur, de la conjugaison de la cible et de la mort cellulaire ultérieure. Ici, des lymphocytes T positifs en voiture non marqués ont été co-incubés avec des cellules cibles NA LM à six cellules cibles GFP dans une NOL et soumis à une surveillance dynamique.

Lorsqu’un Xin five a été ajouté au milieu de culture, les cellules apoptotiques s’étiquettent en rouge une fois maîtrisées. Cette technique peut être réalisée correctement en 10 à 12 heures Suite à cette procédure. D’autres méthodes comme la micro-capture peuvent être utilisées pour déterminer le profil de sécrétion de cytokines des cellules.