Visualisation des ARNm localisés dans le réticulum endoplasmique des cellules de mammifères

Le but de cette procédure est de visualiser l’ARN messager associé au réticulum endoplasmique ou re. Pour ce faire, on plaque d’abord des cellules de culture de tissus de mammifères sur des lamelles. La deuxième étape de la procédure consiste à traiter les cellules avec un tampon d’extraction pour éliminer l’ARNm cytoplasmique non lié au re.

Les prochaines étapes consistent à fixer rapidement les cellules et à colorer l’ARNm par hybridation fluorescente in situ. Les dernières étapes consistent à imager puis à quantifier la quantité de fluorescence associée au re. En fin de compte, les résultats peuvent montrer comment les ARNm sont associés à la surface de cet organite dans différentes conditions.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés de biologie cellulaire, par exemple si les ARNm qui codent pour des protéines sécrétoires peuvent être maintenus à la surface du re, indépendamment des ribosomes ou de la synthèse des protéines. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car elle implique quelques étapes délicates de manipulation cellulaire. Ensemencer les cellules de culture tissulaire sur des lamelles de recouvrement traitées à l’acide pendant au moins un jour avant l’expérience a coûté sept et, en raison de la SG, les cellules sont toutes deux des choix appropriés car elles ont une production élevée de protéines sécrétées et des RE bien définis.

Si un Mr NA exogène est recherché, transfectez les cellules un jour après l’ensemencement, puis incubez les cellules pendant 18 heures supplémentaires pour permettre l’IRM. NA. Le jour de l’expérience. Pour obtenir une efficacité d’extraction élevée, les cellules ne doivent pas dépasser 80 % de fluidité sur la lamelle de recouvrement pour détecter si les ARNm interagissent avec le RE indépendamment de la traduction Les cellules peuvent être traitées avec des agents qui perturbent l’interaction entre les ribosomes et l’ARNm au niveau de ces agents ou des milieux de contrôle vers les cellules 30 minutes avant l’extraction.

Dans ce cas, des inhibiteurs de traduction, de la mycine pure et de l’Homo Harrington in ou HHT sont utilisés. Commencez par réchauffer une solution d’extraction fraîchement préparée contenant de la tonine de terre et un tampon de travail d’un XCHO à 37 degrés Celsius. Réglez un bloc chauffant à 40 degrés Celsius et insérez un bloc métallique inversé pour former une surface de travail plane.

Humidifiez le bloc métallique avec de l’eau, puis recouvrez-le d’un morceau de paraforme frais et lissez les bulles à l’aide de gants sans ARN et de tissus non pelucheux. Ensuite, pour chaque paire de lamelles, préparez une plaque à six puits pour laver et fixer les cellules à quatre puits. Ajoutez deux millilitres de tampon CHO réchauffé dans les deux derniers puits.

Ajoutez deux millilitres de solution de fixation. Rangez ensuite l’assiette à 37 degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. Sur le bloc chauffant, placez une goutte de 100 microlitres de la solution d’extraction pour chaque lamelle de cellules à traiter.

Maintenant, à l’aide d’une pince de bijoutier, prenez une lamelle recouverte d’alvéoles et plongez-la dans les premier et deuxième puits contenant le tampon CHO. Cela lave le milieu de croissance. Ensuite, retirez rapidement l’excédent de tampon à l’arrière de la lamelle.

Et placez brièvement le couvercle côté cellule vers le bas sur la solution d’extraction. Après 10 secondes, transférez le côté de la cellule de la lamelle de recouvrement vers le haut dans le tampon de fixation où il doit rester au moins 15 minutes. L’étape d’extraction cellulaire est essentielle pour éliminer tous les ARNm cyop plasticky qui ne sont pas liés au RE.

De plus, préparez une fiche de contrôle où les cellules sont fixées sans l’extraction. Étape après fixation. Lavez ces cellules témoins extraites non ex deux fois avec du PBS, puis perméase dans du PBS et du TRITTON X 100.

Bien que cela ne soit pas obligatoire, les cellules extraites doivent également être lavées avec la même solution de PBS et de Triton pour réduire la fluorescence de fond après la pénétration des cellules. Lavez les lames deux fois avec du PBS pour enlever le fixateur et le détergent. Ensuite, lavez les lames deux fois avec 60 % de fide dans un tampon de citrate de sodium ou SSC à usage unique.

Cependant, si une sonde de poisson oligo DT est utilisée pour colorer toutes les cellules, le polyARNm réduit le niveau de fide à 25 %Ensuite, préparez le tampon d’hybridation avec la sonde de poisson. Diluer la sonde de poisson stock à 0,2 micromolaire dans la même concentration de fide dans le tampon d’hybridation. Préparez maintenant la chambre de coloration.

Remplissez le fond d’une boîte de Pétri de 150 millimètres avec de l’eau. Ensuite, faites flotter un morceau de paraforme sur l’eau et retournez le plat. Le film para adhérera au fond du plat lorsque l’eau s’échappera.

S’il y a des bulles d’air, retirez-les avec des gants et des mouchoirs non pelucheux pour chaque pipette de 100 microlitres de la solution d’hybridation contenant le poisson Sonde sur le film para. Placez maintenant la lamelle de recouvrement côté cellule vers le bas sur la solution. Enfin, incubez la chambre pendant cinq à 24 heures dans une chambre chaude et humidifiée.

Avant la fin du temps de coloration des poissons, préparez une zone de lavage sans ARN, nivelez la surface plane avec de l’eau et couvrez-la de bandes de param. Enlevez toutes les bulles d’air avec des gants et des mouchoirs sans fil. Une fois la coloration terminée, transférez la chambre dans la zone de travail pour chaque lamelle Pipette un millilitre de tampon de lavage sur la zone de lavage.

Para film pour transférer les lamelles : Pipetez d’abord un demi-millilitre de tampon de lavage de poisson près du bord de chaque lamelle. Le liquide sera aspiré sous la lamelle par capillarité. Ensuite, à l’aide d’une pince, retirez les lamelles de la chambre et placez-les sur les gouttes de tampon de lavage.

Et attendez cinq minutes. Répétez cette technique de lavage trois fois de plus. À l’aide de gouttes fraîches d’un millilitre de tampon de lavage sur la zone de lavage.

Pendant ce temps, nettoyez les lames de verre avec de l’éthanol à 70 % et séchez-les avec des mouchoirs non pelucheux. Ensuite, pour chaque lamelle, appliquez 25 microlitres de solution de montage DPI sur une lame À l’aide d’une pince, prenez une lamelle et séchez son dos avec un mouchoir non pelucheux pour éliminer l’excès de tampon de lavage. Transférez ensuite la lamelle de recouvrement côté cellule vers le bas sur la goutte de solution de montage.

Les lames terminées peuvent être stockées à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient imagées. Sept cellules qui ont été transfectées avec des plasmides contenant de la phosphatase alcaline placentaire ou du cytochrome P 4 58 B un ont été soit extraites avec de la tonine, puis fixées, soit directement fixées pour déterminer le pourcentage de ces ARNm associé au RE. La fluorescence non nucléaire a été quantifiée dans les deux échantillons et la fraction d’ARNm associée au RE a été calculée pour les deux ARNm.

Environ 60 % de la fraction cytoplasmique a été associée au RE pour surveiller l’association de ces transcrits dans le RE. Après dissociation des ribosomes, sept cellules ont été traitées avec un milieu de contrôle, pur MYCIN ou HHT, puis extraites de la tonine et de l’ARNm fixé. La coloration a révélé que l’ARNm A LPP, mais pas le CYP huit P un ARNm, restait associé au RE après la perturbation du ribosome.

La quantification de l’ARNm a soutenu cette observation et, de manière importante, a montré que le niveau d’ARNm nucléaire était constant dans tous les échantillons. Ces données révèlent qu’un sous-ensemble d’ARNm ciblés sur le RE, tel que le transcrit A LPP, est maintenu à la surface du RE après le désassemblage des ribosomes. À l’aide de ce protocole, nous pouvons commencer à étudier comment divers ARNm se localisent dans des compartiments subcellulaires distincts tels que le réticule endoplasmique lorsqu’ils sont combinés à d’autres tests utilisés pour analyser l’exportation nucléaire de l’ARNm.

Cette procédure peut être utilisée pour étudier le ciblage initial des ARNm nouvellement synthétisés à la surface du re.