C. elegans Chemotaxis Assay
27 avril 2013
Procédé d'évaluation quantitative de la réponse chimiotactique des Caenorhabditis elegans Est décrite. Un indice chimiotactique (CI) a été utilisé comme un moyen d'évaluer précisément la réponse des vers de terre pour certaines cibles, et de servir de plate-forme de comparaison entre les souches et les composés d'intérêt.
L'objectif global de l'expérience suivante est de quantifier la réponse chimiotactique de C élégance en utilisant un dosage simple et peu coûteux. Ceci est réalisé en isolant des vers à stade déterminé et en les plaçant au centre d'une plaque marquée. À égale distance de tous les sites de test et de contrôle déposés sur chaque site se trouve un composé d'intérêt ou un composé de contrôle, tous deux combinés à un anesthésique qui arrêtera les vers à leur approche.
Après 60 minutes, la distribution finale des vers sur la plaque est comptabilisée, et le rapport des emplacements des vers est utilisé pour fournir un indice d'analyse. En fin de compte, la quantification de l'attraction de la mer élégante pour certains composés peut être utilisée pour évaluer les conséquences comportementales des manipulations expérimentales sous-jacentes. Le principal avantage de cette technique est qu'elle inclut de nombreux aspects bénéfiques de ses prédécesseurs, tout en permettant une plus grande facilité d'utilisation.
Ce dosage fournit un aperçu du comportement de la mer élégante et est particulièrement utile en combinaison avec des manipulations neurogénétiques et d'autres dosages neurobiologiques. Commencez avec des plaques de cinq centimètres chargées d'agar chimiotactique ou de NGM. Marquez le dessous des plaques en quatre quadrants égaux.
Préparez au moins trois plaques pour au moins trois essais par souche génétique testée et par condition testée. Ensuite, tracez un cercle d'un rayon de 0,5 centimètre autour de l'origine. Puis marquez des points dans les quadrants opposés avec un T pour test ou un C pour contrôle, en veillant à ce que les sites soient équidistants de l'origine et les uns des autres.
Les points doivent être à au moins deux centimètres de l'origine pour ce dosage. Ayez des vers jeunes adultes préparés en développement synchronisé sur des plaques de chimiotaxie de cinq centimètres. Les vers qui se trouvent à différents stades de développement peuvent réagir différemment aux analytes.
Par conséquent, il est très important que tous les vers utilisés dans le dosage soient dans la même phase de développement. Une fois que les vers ont effacé une pelouse d'OP 50 e coli, aspirez deux millilitres de tampon S basal sur la plaque. Manipulez la plaque pour faire entrer tous les vers dans le tampon afin de laver les vers.
Aspirez un millilitre des vers dans le tampon dans un tube de microcentrifugation et centrifugez-les pendant 10 secondes. À l'aide d'un pico fuge à 6 600 tr/min, aspirez le basilic, en laissant le culot de vers intact. Lavez maintenant ces vers trois fois de plus en utilisant la même méthode.
Commencez par ajouter le tampon S basilic au tube et inversez le tube pour remettre les vers en solution. Après le dernier lavage, centrifugez les vers pendant encore 10 secondes puis aspirez le surnageant jusqu'à un volume final de 100 microlitres. Assurez-vous ensuite d'une densité suffisante de vers en pipettant deux microlitres des vers lavés du culot sur une plaque NGM.
Il doit y avoir au moins 50 vers, mais pas plus de 250 vers. S'il y a trop de vers, augmentez le volume de la solution de basilic ESP. Et s'il y a trop peu de vers, centrifugez-les et remettez-les en suspension dans un volume plus faible.
Placez le tube de vers dans une hotte. Une fois préparés, les vers peuvent être utilisés dans le dosage chimiotactique pendant une heure maximum. Tout d'abord, préparez les solutions.
Mélangez la solution de test en combinant des volumes égaux du composé de test avec l'azide de sodium anesthésique à 0,5 molaire. Ensuite, mélangez une solution de contrôle du solvant utilisé pour diluer le composé de test avec de l'azide de sodium à 0,5 molaire. Préparez maintenant une plaque de test.
Aspirez d'abord deux microlitres de solution de vers du culot à l'origine d'une plaque de test. Ajoutez ensuite les odeurs en aspirant deux microlitres de la solution de test sur les deux sites T et aspirez deux microlitres de la solution de contrôle sur les deux sites T. Une fois que les vers et les gouttes d'odeurs ont été absorbés dans l'agar, replacez les couvercles, retournez les plaques et laissez 60 minutes pour le temps d'analyse.
Pour que le temps de diffusion de l'azide de sodium soit standardisé entre les essais. Il est important que les vers soient ajoutés immédiatement avant les odeurs.
De plus, chaque plaque doit être entièrement préparée et l'analyse commencée avant de préparer la plaque suivante. Après l'essai de 60 minutes, placez les vers dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Plus tard, retirez la plaque du réfrigérateur lorsqu'elle peut être comptée.
Ne les comptez pas immédiatement et laissez les vers à température ambiante, ce qui peut leur permettre de se mobiliser. Enregistrez à nouveau l'emplacement des vers qui ont complètement dépassé le cercle intérieur à partir des données. Calculez l'indice de chimiotaxie.
La valeur varie de moins un à plus un, représentant une répulsion maximale à une attraction maximale. Répétez le processus en utilisant la solution de contrôle dans les quadrants de test et de contrôle. Cela servira de plaque de contrôle. Trois.
De telles plaques doivent être fabriquées et exécutées pour chaque condition expérimentale. Diacetyl. Un attractant chimique connu de C élégance a été utilisé pour comparer les vers de type sauvage aux mutants dépourvus du récepteur du diacetyl. Comme prévu, le diacetyl a suscité une réponse chimiotactique significative des vers de type sauvage.
En revanche, les mutants ODR 10 n'étaient pas plus attirés par le diacetyl qu'ils ne l'étaient par le composé de contrôle éthanol Une fois maîtrisée. Cette technique peut être réalisée en moins de 90 minutes si elle est correctement effectuée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d'évaluer efficacement la réponse chimiotactique de la mer élégante aux solutions d'analytes.
Soyez particulièrement attentif à vous assurer que tous les vers testés atteignent un stade de développement synchronisé et qu'un nombre suffisant de vers est utilisé. Chaque essai.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article décrit une méthode d'évaluation quantitative de la réponse chimiotactique de Caenorhabditis elegans à l'aide d'un test simple et rentable. L'approche consiste à mesurer la distribution des vers en réponse à divers composés, fournissant un indice chimiotactique pour comparaison.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Biologie comportementale
- Essais expérimentaux
Contexte
- Caenorhabditis elegans est un organisme modèle utilisé pour étudier les réponses comportementales.
- La chimiotaxie est un comportement critique qui peut être évalué quantitativement.
- Les méthodes précédentes manquaient de précision et de facilité d'utilisation.
- Cette étude vise à améliorer les techniques existantes pour évaluer les réponses chimiotactiques.
Objectif de l'étude
- Quantifier la réponse chimiotactique de C. elegans à divers composés.
- Établir un indice chimiotactique fiable pour la comparaison entre différentes souches et composés.
- Faciliter l'évaluation des conséquences comportementales des manipulations expérimentales.
Méthodes utilisées
- Isolation de vers en stade pour les tests.
- Placement des vers au centre d'une plaque marquée.
- Placement équidistant des composés de test et de contrôle combinés avec des anesthésiques.
- Décompte de la distribution des vers après 60 minutes pour calculer l'indice chimiotactique.
Résultats principaux
- Le test quantifie efficacement l'attraction des vers vers des composés spécifiques.
- Les résultats fournissent un indice chimiotactique clair pour comparaison.
- La méthode démontre une facilité d'utilisation par rapport aux techniques précédentes.
- Les conséquences comportementales des réponses des vers peuvent être évaluées sur la base des résultats.
Conclusions
- La méthode développée offre un moyen fiable d'évaluer le comportement chimiotactique chez C. elegans.
- Cette approche peut améliorer la compréhension des réponses comportementales dans divers contextes expérimentaux.
- Des études futures peuvent s'appuyer sur cette méthode pour explorer des composés et des conditions supplémentaires.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Quantifying chemotactic responses in model organisms enables early-stage target validation by linking genetic or pharmacological manipulations to measurable behavioral outputs. This assay supports mechanistic de-risking in neuroscience discovery by providing a quantitative, reproducible readout for sensory pathway function. Its simplicity and scalability enhance predictive confidence in target engagement studies prior to lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking gene function to sensory behavior in a whole-organism context.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative behavioral phenotyping.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by de-risking targets based on observable chemotactic phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative outputs suitable for compound screening campaigns.
- Scalability: Four-quadrant design increases sample size and reduces bias, enabling reliable replicate testing.
- Workflow Integration: Allows unattended operation and endpoint scoring, improving throughput in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects genetic findings to behavioral outputs, supporting disease-relevant model validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies pathway function through dose- and genotype-dependent chemotactic responses.
- Preclinical Alignment: Enables evaluation of behavioral consequences from target modulation in a genetically tractable system.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing a functional behavioral readout that informs target credibility.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying behavioral responses to compounds or genetic perturbations.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative chemotactic indices that enable comparison across conditions and strains.
- Analytics: Generates a normalized chemotaxis index (−1 to +1) that facilitates data comparison and statistical evaluation.
- Translational Research: Links neurogenetic manipulations to phenotypic outcomes, supporting target-to-behavior translation.
- Enterprise Reuse: Represents a modular, low-cost behavioral assay adaptable across multiple discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in behavioral phenotypes.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized worm staging, plate preparation, and blinded scoring.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on functional behavioral data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying targets with strong phenotypic validation in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in worm handling, synchronization, and developmental staging.
- Depends on standard laboratory equipment including centrifuges, microcentrifuge tubes, and incubators.
- Necessitates cross-team standardization of worm preparation and assay timing for reproducible results.
- Adaptation to other model systems may require adjustments to arena design and anesthetic compatibility.
- Practical limitations include sensitivity to worm density and developmental stage variability, which must be controlled.
