Isolement et culture des astrocytes corticaux de souris

L’objectif général de cette procédure est d’obtenir des cultures d’astrocytes purs en isolant et en cultivant des cellules corticales mixtes de P un à P quatre petits souris. Ceci est accompli en récoltant d’abord les cortex cérébraux des bébés souris et en enlevant les méninges. La deuxième étape consiste à couper le cortex en petits morceaux, à dissocier les morceaux du cortex par la trypsine et la tation pour obtenir des cellules uniques et à plaquer les cellules uniques sur des flacons de culture tissulaire enrobés de poly de lycine.

Ensuite, après sept à huit jours, les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes auront formé différentes couches et la séparation des astrocytes de la microglie et des oligodendrocytes est réalisée en secouant le ballon de culture tissulaire sur un agitateur orbitaire. La dernière étape est l’ionisation et la récolte des astrocytes restants, qui sont ensuite replacés dans un flacon de culture tissulaire. En fin de compte, 12 à 14 jours après la première division cellulaire, les astrocytes sont placés à la concentration appropriée pour les expériences et la pureté cellulaire peut être examinée par immunochimie à l’aide de marqueurs spécifiques aux astrocytes.

La méthode décrite ici est basée sur la préparation de la culture d’astrocytes à partir de cerveaux néonatals de rongeurs décrite à l’origine par McCarthy et développée en 1980. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que les questions concernant l’interaction entre les ostéocytes et les neurones, ainsi que le rôle des ostéocytes dans certaines maladies S, où les ostéocytes sont activés et contribuent à la formation de cicatrices inhibitrices. La démonstration visuelle de cette méthode est utile pour les jeunes scientifiques afin de souligner les étapes critiques de la méthode d’isolement et de visualiser la morphologie astrocytaire au cours des différentes étapes de la procédure d’isolement afin d’assurer des cultures d’astrocytes pures et saines.

La démonstration de cette procédure sera faite par deux étudiants diplômés de mon laboratoire, Sebastian Hilker et Khristian Bora. Avant de commencer cette procédure, assurez-vous que tous les réactifs de culture tissulaire et les réactifs et matériaux de dissection sont préparés à l’avance conformément aux instructions du protocole écrit. Après avoir sacrifié un bébé souris P un à P quatre, effectuez une incision médiane d’arrière à avant le long du cuir chevelu pour révéler le crâne, coupez soigneusement le crâne du cou au nez, puis faites une incision antérieure au bulbe olfactif et une autre inférieure au cervelet. Pour déconnecter le crâne de la base du crâne, utilisez une pince à pointe plate pour retourner doucement les volets crâniens d’un côté.

Ensuite, coupez les bulbes olfactifs et le cervelet, puis soulevez le cerveau. Déposez le cerveau dans un plat de HBSS réfrigéré et placez-le sur de la glace. Répétez maintenant la procédure pour récolter les cerveaux de trois autres animaux.

Quatre cerveaux fourniront suffisamment d’astrocytes pour ensemencer un flacon de culture tissulaire T 75 à la bonne densité. Une fois que tous les cerveaux ont été récoltés, transférez la parabole contenant les cerveaux dans un stéréomicroscope. Ensuite, pour isoler les cortex, saisissez l’extrémité postérieure de chaque cerveau avec de fines pinces et effectuez une incision médiane entre les hémisphères.

Ensuite, insérez une deuxième paire de pinces dans le sillon créé et décollez la structure en forme de plaque du cortex du reste du cerveau. Une fois que tous les cortex ont été isolés, décollez soigneusement les méninges du cortex en tirant avec la pince fine. Cette étape permet d’éviter la contamination de la culture finale d’astrocytes par les cellules méningées et les fibroblastes.

Transférez les hémisphères corticaux préparés dans un deuxième plat rempli de HBSS réfrigéré et placez-les sur de la glace. Continuez en conséquence avec les quatre cortex. Enfin, coupez chaque hémisphère en quatre à huit petits morceaux à l’aide de lames tranchantes dans des conditions stériles.

Transférez les morceaux de cortex dans un tube de faucon de 50 millilitres et ajoutez HBSS à un volume final de 22,5 millilitres. Ajoutez ensuite 2,5 millilitres de 2,5 % de voyages. Replacez le mélange de capuchon et incubez le mouchoir dans le bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Mélanger en secouant toutes les 10 minutes. Puis après centrifusion pendant cinq minutes à 300 fois G à granulé. Les morceaux de tissu du cortex décantent soigneusement le surnageant S.

Ajoutez 10 millilitres de milieu de placage d’astrocytes à la pastille et utilisez une pipette de 10 millilitres pour pipeter vigoureusement le milieu contenant le tissu de haut en bas 20 à 30 fois jusqu’à ce qu’une suspension unicellulaire soit obtenue. Ensuite, ajoutez un produit de placage d’astrocytes à un volume final de 20 millilitres et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules hémologique ou automatisé. Selon les procédures standard, une préparation de quatre cortex de petits de souris devrait donner 10 à 15 fois 10 aux six cellules simples dissociées.

Enfin, aspirez la poly de lycine d’une fiole préalablement préparée et transférez la suspension cellulaire dissociée dans la fiole. Incuber la culture à 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture tissulaire pendant deux jours, puis changer de milieu. Les supports doivent ensuite être changés tous les trois jours.

Par la suite, les astrocytes devraient apparaître en complément d’une couche sus-jacente de microglie après sept à huit jours de culture. À ce stade, placez le flacon T 75 sur un agitateur orbital réglé à 180 rotations par minute pendant 30 minutes pour éliminer la microglie, jetez le supinate contenant la microglie ou faites-le tourner et plaquez-le pour la culture. Ajoutez ensuite 20 millilitres de milieu de culture d’astrocytes frais et continuez en agitant le ballon à 240 tr/min pendant six heures pour éliminer les cellules précurseurs d’oligodendrocytes.

Étant donné que certains OPC ne se détachent pas complètement de la couche d’astrocytes, continuez à agiter vigoureusement à la main pendant une minute. Afin d’éviter la contamination par les OPC, encore une fois, jetez le supinate ou faites-le tourner sur une assiette pour cultiver vos OPC. Rincez deux fois la couche d’astrocytes confluents restante avec du PBS, aspirez le PBS et ajoutez cinq millilitres de trips en EDTA dans l’incubateur de culture tissulaire à 37 degrés Celsius.

Vérifiez le détachement des astrocytes toutes les cinq minutes et appliquez le détachement des astrocytes en frappant la fiole contre la paume de votre main deux ou trois fois. Une fois que les astrocytes se sont détachés de la fiole, ajoutez cinq millilitres de milieu de culture d’astrocytes. Faites tourner les cellules à 180 fois G pendant cinq minutes, aspirez le supinate et ajoutez 40 millilitres de placage d’astrocytes frais. Douleur moyenne.

Une fiole T 75 de cellules corticales mixtes devrait produire environ un cent des six cellules enrichies en astrocytes après la première plaque de passage des cellules dans deux fioles de culture T 75 et incuber 37 degrés Celsius dans l’incubateur de culture tissulaire. Changez de milieu tous les deux à trois jours, 12 à 14 jours après la première plaque de massage, les astrocytes à la concentration cellulaire appropriée 24 à 48 heures avant de réaliser l’expérience. Une fiole de culture tissulaire T 75 doit donner environ 1,5 à deux fois 10 à six cellules après la deuxième fente.

Cette image montre des cellules corticales mixtes un jour après le placage. Les flèches noires indiquent les astrocytes attachés au fond du flacon. On peut voir des neurones mourants flotter dans le supinat trois jours après le placage des cellules corticales mixtes.

La couche astrocytaire se forme comme l’indiquent les flèches noires et les neurones sont presque absents. La même culture corticale mixte est observée ici cinq jours après le placage. La première microglie et les premiers OPC au-dessus d’une couche d’astrocytes sont apparents, comme l’indiquent les flèches noires, comme on le voit ici.

La couche d’astrocytes est complètement confluente sept jours après le placage des cellules corticales mixtes. Cette image montre la culture enrichie d’astrocytes. Deux jours après la séparation.

Les cellules attachées montrent une morphologie astrocytaire à faible densité. Ici, les zones indiquent des cellules uniques. Deux semaines plus tard, la couche d’astrocytes a atteint une densité élevée.

La barre d’échelle représente 10 microns. Cette image démontre la pureté des cultures d’astrocytes. Chaque panneau montre les cellules qui ont été immunomarquées pour les marqueurs astrocytaires, G-F-A-P-G-L-A-S-T-S 100 B, l’aquaporine quatre, A, LDH, un L et BLBP indiqués en vert.

Les noyaux sont révélés par une contre-coloration DAPI. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler et de cultiver les astrocytes corticaux. L’isolement et la culture des astrocytes corticaux décrits dans ce protocole constituent un outil puissant pour l’étude de la biologie des astrocytes.

Étant donné que leur facilité de gestion dans diverses applications peut grandement compléter leur étude in vivo.