Name: Protéines transfection de poumon de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 21 s
Description: Découvrez une méthode de transfection protéique efficace dans le poumon de souris utilisant un microsprayeur ultrafin. Cette technique réduit les effets hors cible et améliore l'expression protéique pour les études pulmonaires.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (7R01HL098528-03) et Innovator Award clinique de FAMRI.

1. Préparation de la protéine réactif de transfection <ol><li> Dissoudre le réactif Pro-Ject en ajoutant 250 ul de méthanol ou le chloroforme dans le tube contenant le film sec. </li><li> Vortex pendant 10-20 secondes à la vitesse supérieure. </li><li> Pipette 20 ul de réactif Pro-Ject dans des microtubes séparés. </li><li> Évaporer le solvant en plaçant les microtubes contenant le réactif Pro-Ject sous une hotte à flux laminaire pour un minimum de 6 heures à température ambiante. Il doit être complètement sec. Sinon, sécher le réactif Pro-Ject l&#39;aide d&#39;un dessiccateur à vide. </li><li> Conserver les tubes à -20 ° C. Ils sont bons pour un an à cette température. </li></ol> 2. L&#39;ajout de protéines de réactif Pro-Ject <ol><li> Distribuer 50 l de PBS, contenant 2,0 mg de la protéine d&#39;intérêt, dans un tube contenant 20 pi de réactif de transfection séché Pro-Ject. </li><li> Après l&#39;ajout de la protéine, mélanger la solution au vortex à basse vitesse fou 3-5 sec suivie d&#39;une incubation de 30 min à température ambiante. </li></ol> 3. L&#39;administration intratrachéale de protéines <ol><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale de kétamine / xylazine (100 mg / kg et 10 mg / kg). </li><li> Après sédation est atteint, les souris sont suspendus à leurs incisives supérieures en utilisant une plate-forme spécialement conçue (figure 1). </li><li> En utilisant des pinces et un trombone comme un laryngoscope, l&#39;oropharynx est ouverte de sorte que le cathéter peut être introduit (Figure 2). Les cordes vocales sont visualisées en plaçant une source lumineuse contre la trachée de souris. </li><li> Le mélange réactif protéine / projet (50 pi) est injectée à travers la trachée à l&#39;aide d&#39;un siècle Microsprayer Penn. </li></ol>

<ol><li>Glasser, S. W., Korfhagen, T. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+models+for+study+of+pulmonary+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transgenic models for study of pulmonary development and disease.</a> Am. J. Physiol. 267, 489-497 (1994).</li>
<li>D'Armiento, J., Dalal, S. S., Okada, Y., Berg, R. A., Chada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+expression+in+the+lungs+of+transgenic+mice+causes+pulmonary+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Collagenase expression in the lungs of transgenic mice causes pulmonary emphysema.</a> Cell. 71, 955-961 (1992).</li>
<li>Foronjy, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+expression+attenuates+cigarette+smoke-+or+elastase-generated+emphysema+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase expression attenuates cigarette smoke- or elastase-generated emphysema in mice.</a> Am. J. Respir Crit. Care Med. 173, 623-631 (2006).</li>
<li>Foronjy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+divergent+roles+of+secreted+frizzled+related+protein-1+%28SFRP1%29+in+lung+morphogenesis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The divergent roles of secreted frizzled related protein-1 (SFRP1) in lung morphogenesis and emphysema.</a> Am. J. Pathol. 177, 598-607 (2010).</li>
<li>Costa, R. H., Kalinichenko, V. V., Lim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+mouse+lung+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in mouse lung development and function.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 280, 823-838 (2001).</li>
<li>Perl, A. K., Tichelaar, J. W., Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+gene+expression+in+the+respiratory+epithelium+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Conditional gene expression in the respiratory epithelium of the mouse.</a> Transgenic Research. 11, 21-29 (2002).</li>
<li>Morimoto, M., Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rtTA+toxicity+limits+the+usefulness+of+the+SP-C-rtTA+transgenic+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">rtTA toxicity limits the usefulness of the SP-C-rtTA transgenic mouse.</a> Dev. Biol. 325, 171-178 (2009).</li>
<li>Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+targeted+viral+vectors+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engineering targeted viral vectors for gene therapy.</a> Nature reviews. Genetics. 8, 573-587 (2007).</li>
<li>Crystal, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+an+adenovirus+containing+the+human+CFTR+cDNA+to+the+respiratory+tract+of+individuals+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis.</a> Nat. Genet. 8, 42-51 (1994).</li>
<li>Merkel, O. M., Zheng, M., Debus, H., Kissel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+gene+delivery+using+polymeric+nonviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pulmonary gene delivery using polymeric nonviral vectors.</a> Bioconjugate Chemistry. 23, 3-20 (2012).</li>
<li>Yang, Y., Li, Q., Ertl, H. C., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+humoral+immune+responses+to+viral+antigens+create+barriers+to+lung-directed+gene+therapy+with+recombinant+adenoviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular and humoral immune responses to viral antigens create barriers to lung-directed gene therapy with recombinant adenoviruses.</a> J. Virol. 69, 2004-2015 (1995).</li>
<li>Liu, Q., Muruve, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+inflammatory+response+to+adenovirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the inflammatory response to adenovirus vectors.</a> Gene Ther. 10, 935-940 (2003).</li>
<li>Pfeifer, C., Aneja, M. K., Hasenpusch, G., Rudolph, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotype+9-mediated+pulmonary+transgene+expression%3A+effect+of+mouse+strain%2C+animal+gender+and+lung+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotype 9-mediated pulmonary transgene expression: effect of mouse strain, animal gender and lung inflammation.</a> Gene Ther. 18, 1034-1042 (2011).</li>
<li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+regulates+innate+immune+and+proteolytic+responses+to+cigarette+smoke+exposure+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A regulates innate immune and proteolytic responses to cigarette smoke exposure in the lung.</a> Toxicol. Sci. 126, 589-599 (2012).</li>
<li>Wallace, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Phosphatase+2a+%28Pp2a%29+Regulates+Innate+Immune+and+Proteolytic+Responses+to+Cigarette+Smoke+Exposure+in+the+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein Phosphatase 2a (Pp2a) Regulates Innate Immune and Proteolytic Responses to Cigarette Smoke Exposure in the Lung.</a> Toxicol. Sci. , (2012).</li>
<li>Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+of+endotracheal+intubation+and+pulmonary+functional+assessment+for+repeated+studies+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice.</a> J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucun conflit d&#39;intérêts à déclarer.

L&#39;avantage de cette technique par rapport à d&#39;autres méthodes est qu&#39;elle produit une augmentation des niveaux de protéines et l&#39;activité dans le tissu pulmonaire lui-même. En outre, il pénètre dans les régions les plus distales du poumon plutôt que de rester simplement dans les voies aériennes. Nous avons mesuré l&#39;activité accrue des protéines de notre injectat même après lavaging les voies respiratoires avec une solution saline 15. Les analyses de l&#39;activité de tissus indiquent que l...

<table><tbody><tr><td>Pro-Ject</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td>Micropulvérisateur</td><td>Penn Century</td><td>FMJ-250</td><td></td></tr><tr><td>Bêta-galactosidase</td><td>Pierce Bio</td><td>89850</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-bêta-galactosidase</td><td>Santa Cruz Bio</td><td>SC-19119</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de souris albumine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3139</td><td></td></tr><tr><td>Kétamine/xylazine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>K113</td><td></td></tr></tbody></table>

protéines transfection de poumon de souris

Protein Transfection of Mouse Lung

L&#39;augmentation de l&#39;expression des protéines permet aux chercheurs de mieux comprendre le rôle fonctionnel de cette protéine dans la régulation de processus biologiques essentiels 1. Dans le poumon, ceci a été réalisé généralement par des approches génétiques qui utilisent des souris transgéniques 2,3 ou de vecteurs viraux ou non viraux qui élèvent les niveaux de protéines via une expression accrue du gène 4. Les souris transgéniques sont coûteux et chronophage pour générer et l&#39;insertion aléatoire d&#39;une expression de gène transgénique ou chroniques peuvent altérer le développement normal des poumons et donc limiter l&#39;utilité du modèle 5. Alors que les transgéniques conditionnelles éviter les problèmes associés à l&#39;expression chronique de gène 6, les souris inverse tétracycline transactivateur contrôlé (rtTA), qui sont utilisés pour générer une expression conditionnelle, développent spontanément élargissement de l&#39;espace aérien 7. Comme avec les transgéniques, l&#39;utilisation de vecteurs viraux et non viraux est cher 8 et peut provoquer des doses dréactions inflammatoires ependent que brouiller les résultats 9 et nuisent à l&#39;expression 10. Par ailleurs, l&#39;efficacité de doses répétées sont limitées par des réponses immunitaires renforcées au vecteur 11,12. Les chercheurs développent adéno-associé (AAV vecteurs viraux) qui provoquent moins d&#39;inflammation et avoir plus d&#39;expression dans le poumon 13. Utilisation de β-galactosidase, nous présentons une méthode pour l&#39;expression des protéines rapidement et efficacement croissante au sein du poumon en utilisant une technique de transfection directe des protéines. Ce protocole associe un montant fixe de protéine purifiée avec 20 pi d&#39;un réactif de transfection à base de lipides (Pro-Ject, Pierce Bio) pour permettre la pénétration dans le tissu pulmonaire lui-même. Le mélange de protéines liposomale est ensuite injecté dans les poumons des souris via la trachée en utilisant un microsprayer (Penn siècle, Philadelphie, PA). Le microsprayer génère une amende panache d&#39;aérosol liquide à travers les poumons. En utilisant la techniquenous avons démontré un dépôt uniforme de la protéine injectée à travers les voies respiratoires et les alvéoles de souris 14. La technique de transfection en lipides permet l&#39;utilisation d&#39;une petite quantité de protéine pour obtenir un effet. Cela limite la réponse inflammatoire qui serait autrement provoquée par l&#39;administration riche en protéines. En effet, en utilisant cette technique, nous avons publié que nous avons réussi à augmenter de manière significative l&#39;activité de PP2A dans les poumons sans affecter les poumons cellularité lavage 15. Lung lavage cellularité pris 24 heures après la provocation était comparable aux témoins (27 ± 4 contrôle contre 31 ± 5 transfectées albumine, N = 6 par le groupe). Par ailleurs, il augmente les niveaux de protéines sans induire les changements développementaux du poumon ou modifications architecturales qui peuvent se produire dans les modèles transgéniques. Cependant, la nécessité pour les administrations répétées peut rendre cette technique moins favorable pour les études portant sur les effets des augmentations à long terme dans l&#39;expression des protéines. Cela serait particulièrement true pour les protéines à demi-vie courte.

<html> Pour démontrer l&#39;efficacité de notre technique, nous avons utilisé un microsprayer (Penn siècle) pour injecter la trachée des souris avec 2 pg de souris albumine (Sigma) dissous dans 50 pi de PBS qui contenait 20 pi de réactif de transfection Pro-Ject. Les souris traitées albumine ont été comparées avec des souris qui ont été traités de manière identique avec 2 pg de protéine bêta-galactosidase (Pierce Bio). Après 24 heures, les souris ont été euthanasiées et les poumons ont été traitées pour l&#39;analyse his...

Des souris transgéniques ou des vecteurs viraux ont été utilisés pour augmenter l&#39;expression des protéines dans le poumon. Cependant, ces techniques sont fastidieux, difficile techniquement et avoir des effets hors-cible qui peut fausser les résultats. Notre protocole de transfection de la protéine utilise un réactif de transfection à base de lipides et une microsprayer ultrafine pour fournir uniformément protéine active à des cellules de poumon.

Protéines transfection de poumon de souris

Increasing protein expression enables researchers to  better understand the functional role of that protein in regulating key  biological processes1. In ...

L'objectif général de cette procédure est de transfecter une protéine dans le poumon de souris. Cela est réalisé en suspendant d'abord la protéine d'intérêt dans un réactif de transfection. Ensuite, une souris est anesthésiée et placée sur une plateforme spéciale pour l'injection.Une source lumineuse est utilisée pour faciliter l'insertion du micro-pulvérisateur dans la trachée. Enfin, 50 microlitres de liquide contenant la protéine d'intérêt sont injectés. En définitive, cette technique de transfection protéique sert à montrer une augmentation des niveaux de protéine dans les poumons de souris.Bien que cette méthode ait été conçue pour être utilisée dans la maladie pulmonaire obstructive chronique, elle peut également être appliquée à d'autres affections telles que l'asthme ou la fibrose pulmonaire. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle. Étant donné que les étapes de l'injection intratrachéale sont difficiles à apprendre, elles nécessitent un positionnement adéquat des voies respiratoires de la souris et une transillumination des cordes vocales.Commencez par préparer le réactif de transfection protéique. Ajoutez 250 microlitres de méthanol ou de chloroforme dans le tube contenant le project.Film sec. Ensuite, vortexez le tube de 10 à 20 secondes à vitesse maximale.Une fois dissous, pipeter 20 microlitres du réactif du projet dans des tubes de microcentrifugation séparés. Placer ces tubes sous une hotte à flux laminaire pour évaporer le solvant pendant au moins six heures. À température ambiante, les tubes doivent être complètement secs.Conserver les tubes à moins 20 degrés Celsius, où ils resteront stables pendant un an. Le jour de la transfection, prélever une aliquote du réactif de transfection et 50 microlitres de PBS contenant deux microgrammes de la protéine d'intérêt. Mélanger la solution par vortex à basse vitesse pendant trois à cinq secondes, puis incuber à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation.Lorsque la protéine est prête, anesthésiez une souris afin de procéder à l'administration intratrachéenne. Une plateforme spécialement conçue est utilisée pour l'injection intratrachéenne. Elle comporte une rampe inclinée à un angle de 45 degrés par rapport à sa base et un fil métallique suspendu à deux crochets situés en haut.Une fois anesthésié, ce fil est utilisé pour suspendre la souris par ses incisives supérieures. Après avoir fixé la souris, placez une source lumineuse contre la trachée afin de faciliter la visualisation des cordes vocales à l’aide de pinces et d’un trombone. En tant que laryngoscope, ouvrez l’oropharynx et introduisez le cathéter.Lors de l'utilisation du pulvérisateur Micros, il est important d'appliquer une force suffisante en appuyant sur le piston. Sinon, au lieu de produire un brouillard fin, vous créerez des gouttelettes qui pourraient potentiellement obstruer les voies respiratoires de la souris. Une fois que tout est en place, injectez 50 microlitres du mélange protéique par la trachée à l'aide d'un pulvérisateur micro-pipette pen century.Dans cet exemple, des souris ont été injectées par voie intratrachéenne soit avec de l'albumine murine, soit avec du beta galacto 24 heures après la transfection protéique au beta galacto. Une coloration, indiquée ici par de larges flèches, a été détectée dans les voies respiratoires des souris traitées au beta galacto, mais pas dans celles traitées à l'albumine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 à 15 minutes, si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la méthode d'injection intratrachéenne chez la souris à des fins de transfection protéique.

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cette vidéo démontre une méthode pour générer un modèle murin de dissémination pleurale en injectant une suspension de cellules cancéreuses du poumon dans la cavité thoracique d’une souris immunodéficiente.

Établissement d’un modèle murin de cancer du poumon pleural disséminé

Les cellules épithéliales bronchiques humaines primaires sont difficiles à transduire. Ce protocole décrit la production de lentivirus et leur concentration ainsi que les conditions de culture optimales nécessaires pour réaliser des transductions très efficaces dans ces cellules tout au long de la différenciation vers un épithélium pseudo-stratifié.

Optimal Lentivirus Production et culture cellulaire Conditions nécessaires pour réussir Cellules transduction humains primaires épithéliales bronchiques

Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie multiphotonique pour effectuer une imagerie à long terme, à haute résolution, sur cellule unique, du poumon intact en temps réel à l’aide d’une fenêtre d’imagerie stabilisée sous vide.

À long terme à haute résolution Microscopie intravitale dans le poumon avec un vide Stabilisé Imaging Window

Ce manuscrit fournit une description de la méthodologie utilisée pour établir des modèles murins de transduction-transplantation. Un compte rendu détaillé est donné des erreurs techniques à éviter lors de la réalisation de greffes de moelle osseuse. Il faut bien comprendre l’importance d’un titre viral élevé, de la transfection/transduction et de l’irradiation.

Transduction-Transplantation Modèle de souris de syndrome myéloprolifératif

Nous présentons ici un protocole visant à promouvoir l’intégration du transgène et la production de souris transgéniques fondateur avec grande efficacité par une simple injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un ovocyte fécondé.

Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

Nous décrivons ici un modèle de transplantation orthotopique syngénique minimalement invasives des cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris comme un modèle de temps - et réduction des coûts pour étudier le cancer du poumon non à petites cellules.

Orthotopic Transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire syngénique pour étudier l’Expression des PD-L1

Ce protocole décrit les étapes prises pour induire des tumeurs pulmonaires de KRAS chez les souris aussi bien que la quantification des tumeurs formées par l’imagerie d’ultrason. Les petites tumeurs sont visualisées dans les premiers temps comme des lignes B. À des moments plus tard, des mesures relatives de volume de tumeur sont réalisées par l’outil de mesure dans le logiciel d’ultrason.

Détection de la progression des tumeurs pulmonaires chez les souris par imagerie par ultrasons

Nous démontrons un protocole étape par étape pour l’étude de la fonction des gènes dans les macrophages résidents du tissu péritonéal in vivo, en utilisant des vecteurs lentiviraux.

Préparation de vecteur lentiviral pour une modulation efficace des gènes et des microARN de macrophages résidents dans les tissus de la cavité péritonéale in vivo chez la souris

Ici, un protocole de production d’AAV à base de cellules HEK293 en suspension est présenté, ce qui permet de réduire le temps et la main-d’œuvre nécessaires à la production de vecteurs à l’aide de composants disponibles à des fins de recherche auprès de fournisseurs commerciaux.

Production de lots de vecteurs associés à l’adénographie à haut rendement à l’aide de cellules en suspension HEK293

Ce protocole décrit une approche de dépistage intraductale évolutive de CRISPR permettant des études parallèles d’élimination et d’activation du gène in vivo dans la glande mammaire de la souris.

Dépistage in vivo parallèle de l’élimination et de l’activation du gène dans la glande mammaire de la souris

Découvrez une méthode de transfection protéique efficace dans le poumon de souris utilisant un microsprayeur ultrafin. Cette technique réduit les effets hors cible et améliore l'expression protéique pour les études pulmonaires.

Protéines transfection de poumon de souris

Explorer plus de vidéos