Dépistage du mélanome Modificateurs l'aide d'un modèle de tumeur Zebrafish Autochtone

L’objectif global de l’expérience suivante est de dépister les modificateurs du mélanome à l’aide d’un modèle de tumeur autogène de poisson-zèbre. Ceci est réalisé en créant des animaux transgéniques chez lesquels les mélanocytes expriment un gène d’intérêt et les poissons sont prédisposés au mélanome. Ensuite, l’apparition du mélanome est notée pour évaluer si le gène d’intérêt modifie l’initiation de la tumeur.

Ensuite, l’invasion tumorale et des tests spécifiques aux cellules sont effectués pour déterminer tout impact supplémentaire du gène d’intérêt sur les mélanomes et les mélanocytes pré-malins. Enfin, les cellules de mélanome sont transplantées pour mesurer comment le gène d’intérêt affecte la fréquence des cellules initiatrices de mélanome dans les tumeurs établies. Les résultats montrent comment un gène candidat affecte diverses propriétés des mélanocytes et des mélanomes, y compris l’invasion initiale et la capacité de transplantation.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transgenèse germinale pour l’étude des gènes cancéreux candidats est qu’elle permet d’économiser du temps, des efforts et de l’argent, et que le débit est augmenté par le dosage. Divers aspects de la tumorgenèse chez les animaux transgéniques à carillon La démonstration de cette procédure sera sherania agar, une étudiante diplômée de mon laboratoire pour générer des constructions pour l’injection. Commencez par créer des clones d’entrée intermédiaire de passerelle par PCR, en amplifiant le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur des gènes d’intérêt et en les recombinant en P don R 2 21.

Ensuite, utilisez la technologie de passerelle multi-sites pour recombiner le gène d’intérêt promoteur mifa spécifique du mélanocyte et le signal de polyadénylation dans le mini vecteur Cooper pour placer les gènes d’intérêt sous le contrôle du promoteur mifa injecter 25 picogrammes de chaque clone, ainsi que 25 picogrammes de TOL deux transposent l’ARNm en une seule cellule transgénique triple homozygote embryon de poisson-zèbre. Mifa BRAF FP 53. Les animaux mutants sont déficients en mélanocytes et sujets à la transformation et à la formation de mélanome.

Avec le gène d’intérêt. Le mini vecteur Cooper contient un mini gène MVA sauveteur. Ainsi, les animaux injectés avec succès développeront des mélanocytes sauvés, qui expriment le gène d’intérêt.

Incuber les embryons injectés à 28,5 degrés Celsius 24 heures après la fécondation ou HPF. Retirez tous les embryons morts 72 heures après la fécondation à l’aide d’un microscope de dissection sous une lumière incidente sur fond blanc. Sélectionnez des animaux transgéniques avec des mélanocytes sauvés.

Lorsque les animaux atteignent quatre jours après la fécondation, transférez-les dans des réservoirs de trois litres dans la nurserie de l’installation du poisson zèbre. À l’âge de deux mois, sélectionnez les animaux dont au moins une zone de sauvetage de mélanocytes est supérieure à quatre millimètres carrés. Dépister chaque semaine les animaux sélectionnés pour détecter la présence de tumeurs.

Isolez des animaux porteurs de tumeurs pour l’étude. Dessinez les courbes de survie sans mélanome avec l’âge en semaines sur l’abdomen et le pourcentage de survie sans mélanome sur l’ordonnée. Comparez des animaux avec des mélanocytes qui expriment un gène d’intérêt pour contrôler les animaux qui expriment l’EGFP et les mélanocytes.

Utilisez un test de classement logarithmique pour déterminer si les deux courbes sont statistiquement différentes. Pour effectuer un test d’invasion tumorale. Commencez par sélectionner des poissons-zèbres isolés qui développent des tumeurs dorsalement dans une région située entre la limite postérieure du cerveau postérieur et le bord antérieur de la nageoire dorsale.

Deux semaines après l’apparition du mélanome, utilisez trica pour euthanasier le poisson après l’avoir fixé et intégré dans de la paraffine. Faites des sections transversales de cinq micromètres à travers les lésions. Un. Tous les 50 micromètres, coupez toute la lésion afin d’identifier le point d’invasion le plus profond.

Utilisez de l’hématine et de l’eoin pour colorer les sections. Évaluez l’invasion tumorale en mesurant si les cellules tumorales restent à l’extérieur de la couche collagène, compactives, envahissent la musculature dorsale ou envahissent davantage la colonne vertébrale. Déterminer la différence statistique entre les deux ensembles d’échantillons pour effectuer une immuno-marquage.

Anesthésie le poisson à raison de 0,17 milligramme par millilitre de trica avec une lumière incidente sous un microscope à dissection. Utilisez une pince pointue à pointe fine pour épiler les écailles dorsales. En prenant soin de ne pas endommager le mélanocyte contenant la moitié du tartre.

Placez les écailles directement de la pince dans un millilitre de fixateur et incubez à température ambiante en les retournant pendant plus de deux heures. Transférez le poisson dans l’eau de poisson et surveillez-le pour confirmer sa récupération réussie des mélanocytes pigmentés d’eau de Javel. Lavez d’abord les balances fixes dans PBST deux fois pendant cinq minutes à température ambiante.

Ensuite, ajoutez un millilitre de solution d’eau de Javel fraîchement préparée et couvrez avec du parfum ou des verrous de capuchon pour empêcher le gaz d’ouvrir les tubes. Continuez à blanchir jusqu’à ce que le pigment disparaisse. Ensuite, lavez-vous au PBST quatre fois toutes les cinq minutes à température ambiante.

Incuber pendant au moins 30 minutes dans une solution en bloc, puis incuber avec environ 400 microlitres d’anticorps primaires et une solution en bloc pendant la nuit À température ambiante le lendemain, laver les écailles trois fois pendant 30 minutes dans du PBS à température ambiante, incuber avec un anticorps secondaire pendant deux heures à toute la nuit à température ambiante. Après vous être tenu avec dpi, appliquez une goutte de bouclier vectoriel sur une lame de verre et montez les écailles de manière à ce que le côté concave des écailles soit orienté vers le bas contre la diapositive. Placez une lamelle en verre sur les échantillons.

Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller les bords et observez les lames au microscope fluorescent. Après un receveur irradiant, un poisson Casper de deux à trois mois avec 25 grays d’irradiation gamma un jour avant la transplantation. Laissez le poisson se rétablir dans l’eau du poisson.

Utilisez trica pour euthanasier un poisson porteur d’une tumeur, coupez la tumeur et mettez-la dans une boîte de Pétri avec environ cinq millilitres de filtre stérilisé 0,9 XPBS avec 5 % FBS avec un rasoir en dés la tumeur en solution travaillant à température ambiante et avec une pipette P 1000 itérer pour produire des cellules uniques. Augmentez le volume à 25 millilitres. Filtrez la solution à travers un filtre à mailles de 40 micromètres et faites-la tourner dans une centrifugeuse de table à 453 RCF pendant 10 minutes.

Remettre le granulé en suspension dans 0,9 % PBS 5 % FBS à la concentration souhaitée. À l’aide d’un hémocytomètre, calculez le nombre exact de cellules et diluez la suspension cellulaire de manière à ce que le volume d’injection final soit d’environ cinq microlitres. Par exemple, si 50 000 cellules doivent être injectées, la suspension cellulaire doit être diluée à une concentration finale de 10 000 cellules par microlitre.

Agitez le tube contenant la suspension cellulaire toutes les quelques minutes pour éviter l’agglutination des cellules avec de l’éthanol à 100 % et 0,9 XPBS. Lavez deux à trois fois une seringue Hamilton de calibre 26 s, 7, 0, 1 et 10 microlitres avant de charger la seringue avec cinq microlitres de suspension cellulaire. Après avoir anesthésié le poisson récepteur irradié dans le trica, placez-le sur le côté sur une lingette Kim humide.

Stabilisez le poisson d’une main et insérez l’aiguille avec le biseau vers le haut à un angle de 45 degrés dans le flanc du poisson au-dessus de la cavité péritonéale. À peu près à mi-chemin entre la limite postérieure du cerveau postérieur et le bord antérieur de la nageoire dorsale. Appuyez doucement sur le piston.

Laissez les poissons se rétablir dans l’eau douce des poissons et observez les poissons quotidiennement pour la greffe tumorale. Si une greffe a eu lieu, une croissance continue et le développement de la maladie peuvent également être observés. Des embryons de poisson-zèbre MIFA ont été injectés avec le mini vecteur Cooper contenant l’ensemble d’oncogènes du mélanome DB one ou EGFP, chacun sous le contrôle du promoteur MFA, comme indiqué ici.

Les courbes d’incidence tumorale pour les adultes ont révélé que le mélanome SET DB one accélérait significativement l’apparition du mélanome par rapport au contrôle EGFP comme on le voit ici, la coloration à l’hématine et à l’EOSIN montre que les mélanomes exprimant SET DB one étaient localement plus invasifs que les mélanomes témoins EGFP. Cette figure montre des écailles dorsales de poisson-zèbre blanchies ou non blanchies qui ont été colorées avec un anticorps reconnaissant le facteur de transcription mifa localisé nucléaire pour évaluer la capacité de transplantation de la tumeur. Des cellules de mélanome ont été isolées à partir d’un poisson mifa BRAF FP 53 injecté avec mini cup R-E-G-F-P 50, 000 cellules ont été injectées par voie sous-cutanée dans un mutant Casper receveur qui avait été irradié la veille avec 25 gris comme on peut le voir ici à l’âge de deux semaines.

Les cellules pigmentées dérivées d’un donneur ont été facilement reconnues. Ainsi, après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour étudier les conséquences fonctionnelles des modifications génétiques associées au mélanome en utilisant le poisson-zèbre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dépister les modificateurs de mélanome par test, les différences dans l’invasion tumorale, l’expression des gènes et la capacité de transplantation à l’aide d’un modèle de tumeur automatique de poisson zèbre.