Name: Dépistage du mélanome Modificateurs laide dun modèle de tumeur Zebrafish Autochtone (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Découvrez une méthode de criblage rapide des modificateurs du mélanome utilisant un modèle tumoral autochtone chez Danio rerio. Cette approche permet d'évaluer l'initiation et la progression tumorale avec le vecteur miniCoopR.

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Nous remercions le Dr Leonard I. Zon en laboratoire dont ces techniques ont été initialement développées; Kristen Kwan et la fin des années Chi-Bin Chien pour les dons de plasmides utilisés dans ce travail; James Lister et David Raible de l&#39;aide pour coloration des anticorps, et James Neiswender pour la micro-injection vidéo. Ce travail a été financé par le NIH subvention R00AR056899-03 à CJC

1. Dépistage du mélanome Modificateurs Onset <ol><li> Créer des clones de passerelle moyen d&#39;entrée par PCR amplifiant le cadre de pleine longueur de lecture ouvert de gènes d&#39;intérêt (GOI) et la recombinaison en utilisant les batteries BP 221 pDONR clonase II (Invitrogen). Utilisez la technologie de passerelle multi-sites (Invitrogen) pour recombiner p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit N ° 302 p3E_SV40polyA 6 et miniCoopR 5 afin d&#39;ajouter des gènes d&#39;intérêt dans le cadre du promoteur mitfa dans le vecteur miniCoopR (figure 1A). </li><li> Injecter 25 picogrammes de chaque clone ainsi que 25 picogrammes Tol2 ARNm transposase dans une cellule-Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); mitfa (LF) d&#39;embryons de poisson zèbre triplement homozygotes 7 comme décrit précédemment. Incuber les embryons injectés à 28,5 ° C. Retirez tous les embryons morts à 24 hpf. </li><li> Sélectionnez animaux transgéniques avec mélanocytes secourus à 72 hpf en plaçant la boîte de Petri contenant des embryons injectés sur une dissection microscope sous la lumière incidente sur un fond blanc (figure 1A). </li><li> Transfert à 3 réservoirs animaux L dans la pépinière de l&#39;installation poisson zèbre à 4 dpf comme décrit précédemment 8. </li><li> A 2 mois, sélectionnez les animaux avec au moins une zone de sauvetage mélanocytes supérieure à 4 mm 2 (figure 1A). Il ya une forte corrélation entre le degré de sauvetage mélanocytes à 72 hpf et le degré de sauvetage mélanocytes moins 2 mois. Lorsque les embryons ayant sauvetage mélanocytes sont cueillies à 72 hpf, la majorité d&#39;entre eux (environ 80%) ont au moins une zone de sauvetage mélanocytes supérieure à 4 mm 2 à 2 mois. </li><li> Écran animaux sélectionnés hebdomadaires pour la présence de tumeurs (figure 1B). Il ya une forte corrélation entre les changements histopathologiques et morphologiques. Transition de bénigne à maligne est comptabilisé comme un changement morphologique lorsque les lésions se soulèvent à la surface de l&#39;animal. Isoler anima porteur d&#39;une tumeurls pour étude. </li><li> Tracer des courbes de survie sans mélanome avec l&#39;âge dans les semaines en abscisse et le mélanome pour cent de la survie sans en ordonnée. Les animaux atteints de mélanocytes qui expriment un gène d&#39;intérêt sont comparés à des animaux témoins qui expriment l&#39;EGFP (enhanced green fluorescent protein) dans les mélanocytes (figure 1C). L&#39;apparition de tumeur médiane pour animaux injectés avec miniCoopR-EGFP est d&#39;environ 18 semaines. Déterminer si les deux courbes sont statistiquement différentes en utilisant un test du log-rank. </li></ol> 2. Essai de l&#39;invasion tumorale <ol><li> Sélectionnez le poisson-zèbre isolé qui développent des tumeurs dorsalement, dans une région située entre le bord postérieur du cerveau postérieur et bord antérieur de la nageoire dorsale (figure 2A). </li><li> Deux semaines après l&#39;apparition du mélanome euthanasier les poissons selon les directives spécifiées par le Groupe American Veterinary Medical Association sur l&#39;euthanasie et approuvé par l&#39;Université de Massachusetts Medical School Insprotection des animaux et le Comité titutional utilisation (IACUC). Plus précisément, un poisson est placé dans une boîte avec 0,6 mg / ml tricaïne jusqu&#39;à ce que le mouvement s&#39;arrête branchies. </li><li> Faire une incision dans la cavité péritonéale du poisson avec un scalpel, puis placer le poisson dans du paraformaldéhyde 4% (PFA) pendant une nuit à 4 ° C pour la fixation. </li><li> Traiter avec 0,5 M d&#39;EDTA nuit à 4 ° C de la détartrer. </li><li> Fixer avec du formol dans la cassette du jour au lendemain, déshydrater pendant 1 heure, clair avec du xylène 3 fois pendant 1 heure et ensuite traiter avec de la paraffine 2 fois pour 2 heures chacune à 60 ° C. </li><li> Incorporer le tissu dans de la paraffine dans un moule et le laisser se solidifier pendant 30 min à 1 h. </li><li> Assurez-5 sections um, un toutes les 50 Pm. Les sections doivent être transversal et toute la lésion sorte que le point le plus profond de l&#39;invasion peut être identifié. Suivi de l&#39;hématoxyline et éosine. </li><li> Évaluer l&#39;invasion tumorale en mesurant si les cellules tumorales restent en dehors du collagène couche compacte, envahir la dorsalemusculature ou envahir plus loin dans la colonne vertébrale (figure 2B, C). Déterminer différence statistique entre les deux séries d&#39;échantillons. </li></ol> 3. La coloration d&#39;anticorps de mélanocytes échelle <ol><li> Maquillage PO4 tampon avec 80 ml ​​0,1 M Na 2 HPO 4 et 20 ml 0,1 M NaH 2 PO 4. Assurez-vous que le pH est de 7,3. Maquillage tampon fix 2x contenant 8,0 g de saccharose, 0,15 ml 0,2 M CaCl 2 et 90 ml 0,2 M PO 4, pH 7,3. Si nécessaire, ajuster le pH à 7,3 avec NaOH ou HCl, puis compléter à 100 ml avec tampon PO 4. </li><li> Peser jusqu&#39;à 300 mg de solide PFA et ajouter dans un tube à centrifuger. Ajouter 5 mM de NaOH à un volume égal à 4,5 x la masse, en milligrammes, de PFA (par exemple 450 ul 5 mM NaOH à 100 mg PFA). Chauffer à 60-70 ° C avec agitation jusqu&#39;à occasionnelle de la PFA soit dissoute. Isoler les particules restantes et récupérer 20% de PFA surnageant. Assurez frais à chaque fois. </li><li> Préparer une solution contenant de fixation 1x fix tampon et 4% de PFA. </li><li> Anesthésier les poissons de 0,17 mg / ml tricaïne. </li><li> Utilisation de la lumière incidente sous un microscope à dissection arracher écailles dorsales pointues en utilisant une pince à pointe fine, en prenant soin de ne pas endommager la moitié des mélanocytes contenant de l&#39;échelle (figure 3A). Placer les échelles directement à partir de la pince dans 1 ml de solution de fixation et incuber à température ambiante, tout en tournant, pour ≥ 2 h. Transférer le poisson dans l&#39;eau du poisson et de surveiller le poisson pour confirmer la récupération réussie. </li><li> Pour l&#39;eau de Javel mélanocytes pigmentés laver échelles fixes dans du PBST (1x PBS, pH 7,4, 0,1% de Triton X-100) 2 fois pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 1 ml d&#39;une solution fraîchement préparée de blanchiment contenant 0,4 ml de KOH à 10% et 0,15 ml 30% H 2 O 2 dans 5 ml de dH 2 O. Mettez serrures parafilm ou casquette pour empêcher le gaz de l&#39;éclatement des tubes ouverts. Continuer jusqu&#39;à ce que le blanchiment pigment est parti (10 min est typique) (figure 3B, C). Laver à l&#39;PBST quatre fois pendant 5 min à température ambiantetérature. </li><li> Pour bloquer au moins 30 min dans une solution composée de blocs 1x PBS pH 7,4, 0,2% de Triton X-100, 2 mg / ml de BSA, 1% de DMSO, 0,02% NaN 3 et 2% de sérum d&#39;agneau. Laissez de côté NaN 3 si le développement de la réaction HRP. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps primaire en solution bloquer pendant une nuit à température ambiante. Vous devez avoir au moins 400 pi de solution sur les échantillons pour les maintenir immergés. </li><li> Laver les échelles 3 fois pendant 30 min dans du PBST à la température ambiante. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps secondaire de 2 heures ou toute la nuit dans une solution de bloc à température ambiante. </li><li> Colorer pendant 10 min avec du PBST + DAPI uM 0,1. </li><li> Laver 3 fois pendant 5 min avec du PBST. </li><li> Monter les échelles sur une lame de verre dans une goutte d&#39;Vectashield sorte que le côté concave de la balance tournée vers le bas en direction de la lame et de placer une lamelle couvre-objet en verre sur eux. Scellez les bords de la lame avec vernis à ongles transparent et observez les lames sous un microscope à fluorescence (figure 3D, E, F, G </strong&gt;). </li></ol> 4. Transplantation Assay <ol><li> Préparer destinataire 2-3 mois vieux casper 9 poissons par irradiation avec 25 Gy d&#39;irradiation gamma un jour avant la transplantation 10. Permettre aux poissons de se remettre dans l&#39;eau du poisson. </li><li> Euthanasier un poisson porteur d&#39;une tumeur comme décrit précédemment (section 2.2). </li><li> Coupez la tumeur et le mettre dans une boîte de Pétri avec environ 5 ml de filtre stérilisé 0.9x PBS avec 5% de FBS. Dés la tumeur avec un rasoir tandis que dans la solution. </li><li> Travailler à la température ambiante, on triture avec une pipette P1000 pour obtenir des cellules individuelles. Compléter le volume à 25 ml avec du PBS 0.9x stérilisée par filtration avec 5% de FBS. </li><li> Filtrer à travers filtre 40 mesh uM. </li><li> Faites tourner dans une centrifugeuse Eppendorf 5810R table à 1.500 tours par minute (453 rcf) pendant 10 min. </li><li> Enlever le surnageant et faire suspension cellulaire à une concentration d&#39;environ désiré (en supposant 10 7 cellules pour une tumeur 100 mm 3). </li><li> Calculer til précise le nombre de cellules à l&#39;aide d&#39;un hémocytomètre et diluer la suspension cellulaire de sorte que le volume d&#39;injection final est d&#39;environ 5 pl. Par exemple, si 50.000 cellules doivent être injectés, la suspension cellulaire doit être dilué à une concentration finale de 10.000 cellules / ul. Basculez le tube contenant la suspension cellulaire à chaque quelques min pour empêcher l&#39;agglutination des cellules. </li><li> Laver une jauge 26s (pointe conique) 701 N seringue de 10 ul Hamilton 2-3 fois avec de l&#39;éthanol à 100% et 0.9x PBS. Chargez la seringue avec 5 pi de la suspension cellulaire. </li><li> Anesthésier le poisson receveur irradié dans 0,17 mg / ml tricaïne. Placer le poisson sur le côté sur une Kimwipe humide (figure 4A). </li><li> Stabiliser le poisson avec une main et insérez l&#39;aiguille avec le biseau vers le haut à un angle de 45 ° dans le flanc du poisson au-dessus de la cavité péritonéale à mi-chemin entre le bord postérieur du cerveau postérieur et bord antérieur de la nageoire dorsale. Appuyer doucement sur ​​le piston (figure 4B). &lt;/ Li&gt; <li> Permettre aux poissons de se remettre à l&#39;eau les poissons frais et observer les poissons par jour pendant la prise de greffe tumorale (figure 4C). Si la prise de greffe a eu lieu, la croissance continue et le développement des maladies peuvent également être observés. </li></ol>

<ol><li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Curtin, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+sets+of+genetic+alterations+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Distinct sets of genetic alterations in melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 353, 2135-2147 (2005).</li>
<li>Lin, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+genomic+diversity+and+tumor+dependency+in+malignant+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Modeling genomic diversity and tumor dependency in malignant melanoma.</a> Cancer Res. 68, 664-673 (2008).</li>
<li>Patton, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+mutations+are+sufficient+to+promote+nevi+formation+and+cooperate+with+p53+in+the+genesis+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">BRAF mutations are sufficient to promote nevi formation and cooperate with p53 in the genesis of melanoma.</a> Curr. Biol. 15, 249-254 (2005).</li>
<li>Ceol, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+SETDB1+is+recurrently+amplified+in+melanoma+and+accelerates+its+onset%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase SETDB1 is recurrently amplified in melanoma and accelerates its onset.</a> Nature. 471, 513-517 (2011).</li>
<li>Kwan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev. Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+of+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide of the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4, University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nat. Immunol. 4, 1238-1246 (2003).</li>
</ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode miniCoopR permet l&#39;expression de gènes d&#39;intérêt dans les mélanocytes de poisson zèbre. Cette approche tire parti du fait que le gène poisson zèbre mitfa agit cellulaire-autonome. Pour cette raison, les mélanocytes sauvés par le vecteur miniCoopR êtes certain de contenir le minigène et tout gène d&#39;intérêt auquel il est couplé physiquement. Rescued mélanocytes sont clairement visibles et peuvent être obtenus chez les animaux qui ont été injectés dans des embryons unicellulaires. Un degré d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td> Réactifs de recombinaison passerelle </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> miniCoopR </td><td></td><td></td><td> Référence 5 </td></tr><tr><td> Anticorps Mitfa </td><td></td><td></td><td> Référence 5 </td></tr><tr><td> FITC de chèvre anti-IgG de lapin </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Labs </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> casper le poisson-zèbre </td><td></td><td></td><td> Référence 9 </td></tr><tr><td> 701N seringue de 10 ul </td><td> Hamilton / Fisher </td><td> 14-824 </td><td> &amp;nbsp; </td></tr><tr><td> 40 uM de filtre </td><td> BD Falcon / Fisher </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 26140079 </td><td></td></tr></tbody></table>

dépistage du mélanome modificateurs l&#39;aide d&#39;un modèle de tumeur zebrafish autochtone

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Les études génomiques de cancers humains ont révélé une mine de renseignements sur les gènes qui sont altérés dans les tumeurs 1,2,3. Un défi découlant de ces études est que de nombreux gènes sont altérés, et il peut être difficile de distinguer les altérations génétiques qui ont poussé la tumorigenèse de ceux qui se leva d&#39;ailleurs lors de la transformation. Pour faire cette distinction, il est utile d&#39;avoir un test qui peut mesurer quantitativement l&#39;effet d&#39;un gène modifié sur l&#39;initiation de la tumeur et d&#39;autres procédés qui permettent tumeurs à persister et à diffuser. Nous présentons ici un moyen rapide pour cribler un grand nombre de modificateurs de mélanome chez le poisson zèbre candidats à l&#39;aide d&#39;un 4 tumeurs autochtones modèle qui englobe les étapes nécessaires à l&#39;initiation et le maintien du mélanome. Un réactif clé dans ce test est le vecteur miniCoopR, qui couple une copie de type sauvage de la spécification facteur mitfa mélanocytes à une cassette de recombinaison dans lequel la passerelle candidate melAnoma gènes peuvent être recombinées 5. Le vecteur a un minigène miniCoopR sauvetage mitfa qui contient le promoteur, le cadre de lecture ouvert et la région 3 &#39;non traduite du gène de type sauvage mitfa. Il nous permet de faire des constructions à l&#39;aide de longue durée cadres ouverts de lecture de modificateurs de mélanome candidats. Ces clones individuels peuvent ensuite être injecté dans la cellule unique Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); embryons de poisson zèbre mitfa (lf). Le vecteur miniCoopR obtient intégré par Tol2 médiée par transgénèse 6 et sauve mélanocytes. Parce qu&#39;ils sont physiquement couplé à la minigène mitfa sauvetage, les gènes candidats sont exprimés dans les mélanocytes rescapés, dont certains vont transformer et se développer en tumeurs. L&#39;effet d&#39;un gène candidat à l&#39;initiation du mélanome et des cellules de mélanome peut être mesurée à l&#39;aide des courbes de survie sans mélanome, des essais d&#39;invasion, la coloration d&#39;anticorps et les essais de transplantation.

Une cellule-Tg (mitfa: BRAF V600E); p53 (lf); embryons de poisson zèbre mitfa (LF) ont été injectés avec le vecteur contenant l&#39;oncogène miniCoopR mélanome SETDB1 5 ou EGFP, chacun sous le contrôle du promoteur mitfa. Embryons sauvetage mélanocytes ont été sélectionnés et ont permis de mûrir. À 2 mois d&#39;âge avec des animaux sauvetage mélanocytes supérieure à 4 mm 2 ont été sélectionnés. Les animaux ont été examinés par semaine pour les mélanomes....

Un moyen rapide pour le dépistage de modificateurs de mélanome en utilisant un modèle de tumeur poisson zèbre autochtone est présenté. Il tire profit du vecteur miniCoopR qui permet l&#39;expression de gènes candidats de mélanome dans les mélanocytes. Une méthode pour obtenir des courbes de survie sans mélanome, un dosage invasion, un protocole pour la coloration d&#39;anticorps de mélanocytes échelle et un essai de transplantation mélanome sont décrits.

Dépistage du mélanome Modificateurs l&#39;aide d&#39;un modèle de tumeur Zebrafish Autochtone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

L’objectif global de l’expérience suivante est de dépister les modificateurs du mélanome à l’aide d’un modèle de tumeur autogène de poisson-zèbre. Ceci est réalisé en créant des animaux transgéniques chez lesquels les mélanocytes expriment un gène d’intérêt et les poissons sont prédisposés au mélanome. Ensuite, l’apparition du mélanome est notée pour évaluer si le gène d’intérêt modifie l’initiation de la tumeur.Ensuite, l’invasion tumorale et des tests spécifiques aux cellules sont effectués pour déterminer tout impact supplémentaire du gène d’intérêt sur les mélanomes et les mélanocytes pré-malins. Enfin, les cellules de mélanome sont transplantées pour mesurer comment le gène d’intérêt affecte la fréquence des cellules initiatrices de mélanome dans les tumeurs établies. Les résultats montrent comment un gène candidat affecte diverses propriétés des mélanocytes et des mélanomes, y compris l’invasion initiale et la capacité de transplantation.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la transgenèse germinale pour l’étude des gènes cancéreux candidats est qu’elle permet d’économiser du temps, des efforts et de l’argent, et que le débit est augmenté par le dosage. Divers aspects de la tumorgenèse chez les animaux transgéniques à carillon La démonstration de cette procédure sera sherania agar, une étudiante diplômée de mon laboratoire pour générer des constructions pour l’injection. Commencez par créer des clones d’entrée intermédiaire de passerelle par PCR, en amplifiant le cadre de lecture ouvert sur toute la longueur des gènes d’intérêt et en les recombinant en P don R 2 21.Ensuite, utilisez la technologie de passerelle multi-sites pour recombiner le gène d’intérêt promoteur mifa spécifique du mélanocyte et le signal de polyadénylation dans le mini vecteur Cooper pour placer les gènes d’intérêt sous le contrôle du promoteur mifa injecter 25 picogrammes de chaque clone, ainsi que 25 picogrammes de TOL deux transposent l’ARNm en une seule cellule transgénique triple homozygote embryon de poisson-zèbre. Mifa BRAF FP 53. Les animaux mutants sont déficients en mélanocytes et sujets à la transformation et à la formation de mélanome.Avec le gène d’intérêt. Le mini vecteur Cooper contient un mini gène MVA sauveteur. Ainsi, les animaux injectés avec succès développeront des mélanocytes sauvés, qui expriment le gène d’intérêt.Incuber les embryons injectés à 28,5 degrés Celsius 24 heures après la fécondation ou HPF. Retirez tous les embryons morts 72 heures après la fécondation à l’aide d’un microscope de dissection sous une lumière incidente sur fond blanc. Sélectionnez des animaux transgéniques avec des mélanocytes sauvés.Lorsque les animaux atteignent quatre jours après la fécondation, transférez-les dans des réservoirs de trois litres dans la nurserie de l’installation du poisson zèbre. À l’âge de deux mois, sélectionnez les animaux dont au moins une zone de sauvetage de mélanocytes est supérieure à quatre millimètres carrés. Dépister chaque semaine les animaux sélectionnés pour détecter la présence de tumeurs.Isolez des animaux porteurs de tumeurs pour l’étude. Dessinez les courbes de survie sans mélanome avec l’âge en semaines sur l’abdomen et le pourcentage de survie sans mélanome sur l’ordonnée. Comparez des animaux avec des mélanocytes qui expriment un gène d’intérêt pour contrôler les animaux qui expriment l’EGFP et les mélanocytes.Utilisez un test de classement logarithmique pour déterminer si les deux courbes sont statistiquement différentes. Pour effectuer un test d’invasion tumorale. Commencez par sélectionner des poissons-zèbres isolés qui développent des tumeurs dorsalement dans une région située entre la limite postérieure du cerveau postérieur et le bord antérieur de la nageoire dorsale.Deux semaines après l’apparition du mélanome, utilisez trica pour euthanasier le poisson après l’avoir fixé et intégré dans de la paraffine. Faites des sections transversales de cinq micromètres à travers les lésions. Un. Tous les 50 micromètres, coupez toute la lésion afin d’identifier le point d’invasion le plus profond.Utilisez de l’hématine et de l’eoin pour colorer les sections. Évaluez l’invasion tumorale en mesurant si les cellules tumorales restent à l’extérieur de la couche collagène, compactives, envahissent la musculature dorsale ou envahissent davantage la colonne vertébrale. Déterminer la différence statistique entre les deux ensembles d’échantillons pour effectuer une immuno-marquage.Anesthésie le poisson à raison de 0,17 milligramme par millilitre de trica avec une lumière incidente sous un microscope à dissection. Utilisez une pince pointue à pointe fine pour épiler les écailles dorsales. En prenant soin de ne pas endommager le mélanocyte contenant la moitié du tartre.Placez les écailles directement de la pince dans un millilitre de fixateur et incubez à température ambiante en les retournant pendant plus de deux heures. Transférez le poisson dans l’eau de poisson et surveillez-le pour confirmer sa récupération réussie des mélanocytes pigmentés d’eau de Javel. Lavez d’abord les balances fixes dans PBST deux fois pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, ajoutez un millilitre de solution d’eau de Javel fraîchement préparée et couvrez avec du parfum ou des verrous de capuchon pour empêcher le gaz d’ouvrir les tubes. Continuez à blanchir jusqu’à ce que le pigment disparaisse. Ensuite, lavez-vous au PBST quatre fois toutes les cinq minutes à température ambiante.Incuber pendant au moins 30 minutes dans une solution en bloc, puis incuber avec environ 400 microlitres d’anticorps primaires et une solution en bloc pendant la nuit À température ambiante le lendemain, laver les écailles trois fois pendant 30 minutes dans du PBS à température ambiante, incuber avec un anticorps secondaire pendant deux heures à toute la nuit à température ambiante. Après vous être tenu avec dpi, appliquez une goutte de bouclier vectoriel sur une lame de verre et montez les écailles de manière à ce que le côté concave des écailles soit orienté vers le bas contre la diapositive. Placez une lamelle en verre sur les échantillons.Utilisez du vernis à ongles transparent pour sceller les bords et observez les lames au microscope fluorescent. Après un receveur irradiant, un poisson Casper de deux à trois mois avec 25 grays d’irradiation gamma un jour avant la transplantation. Laissez le poisson se rétablir dans l’eau du poisson.Utilisez trica pour euthanasier un poisson porteur d’une tumeur, coupez la tumeur et mettez-la dans une boîte de Pétri avec environ cinq millilitres de filtre stérilisé 0,9 XPBS avec 5 % FBS avec un rasoir en dés la tumeur en solution travaillant à température ambiante et avec une pipette P 1000 itérer pour produire des cellules uniques. Augmentez le volume à 25 millilitres. Filtrez la solution à travers un filtre à mailles de 40 micromètres et faites-la tourner dans une centrifugeuse de table à 453 RCF pendant 10 minutes.Remettre le granulé en suspension dans 0,9 % PBS 5 % FBS à la concentration souhaitée. À l’aide d’un hémocytomètre, calculez le nombre exact de cellules et diluez la suspension cellulaire de manière à ce que le volume d’injection final soit d’environ cinq microlitres. Par exemple, si 50 000 cellules doivent être injectées, la suspension cellulaire doit être diluée à une concentration finale de 10 000 cellules par microlitre.Agitez le tube contenant la suspension cellulaire toutes les quelques minutes pour éviter l’agglutination des cellules avec de l’éthanol à 100 % et 0,9 XPBS. Lavez deux à trois fois une seringue Hamilton de calibre 26 s, 7, 0, 1 et 10 microlitres avant de charger la seringue avec cinq microlitres de suspension cellulaire. Après avoir anesthésié le poisson récepteur irradié dans le trica, placez-le sur le côté sur une lingette Kim humide.Stabilisez le poisson d’une main et insérez l’aiguille avec le biseau vers le haut à un angle de 45 degrés dans le flanc du poisson au-dessus de la cavité péritonéale. À peu près à mi-chemin entre la limite postérieure du cerveau postérieur et le bord antérieur de la nageoire dorsale. Appuyez doucement sur le piston.Laissez les poissons se rétablir dans l’eau douce des poissons et observez les poissons quotidiennement pour la greffe tumorale. Si une greffe a eu lieu, une croissance continue et le développement de la maladie peuvent également être observés. Des embryons de poisson-zèbre MIFA ont été injectés avec le mini vecteur Cooper contenant l’ensemble d’oncogènes du mélanome DB one ou EGFP, chacun sous le contrôle du promoteur MFA, comme indiqué ici.Les courbes d’incidence tumorale pour les adultes ont révélé que le mélanome SET DB one accélérait significativement l’apparition du mélanome par rapport au contrôle EGFP comme on le voit ici, la coloration à l’hématine et à l’EOSIN montre que les mélanomes exprimant SET DB one étaient localement plus invasifs que les mélanomes témoins EGFP. Cette figure montre des écailles dorsales de poisson-zèbre blanchies ou non blanchies qui ont été colorées avec un anticorps reconnaissant le facteur de transcription mifa localisé nucléaire pour évaluer la capacité de transplantation de la tumeur. Des cellules de mélanome ont été isolées à partir d’un poisson mifa BRAF FP 53 injecté avec mini cup R-E-G-F-P 50, 000 cellules ont été injectées par voie sous-cutanée dans un mutant Casper receveur qui avait été irradié la veille avec 25 gris comme on peut le voir ici à l’âge de deux semaines.Les cellules pigmentées dérivées d’un donneur ont été facilement reconnues. Ainsi, après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour étudier les conséquences fonctionnelles des modifications génétiques associées au mélanome en utilisant le poisson-zèbre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de dépister les modificateurs de mélanome par test, les différences dans l’invasion tumorale, l’expression des gènes et la capacité de transplantation à l’aide d’un modèle de tumeur automatique de poisson zèbre.

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Coloration par anticorps des mélanocytes de cochenilles : une technique pour détecter les facteurs de transcription exprimés dans les mélanocytes associés aux écailles dorsales de modèles de poisson-zèbre

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