Méthodes expérimentales pour tester les effets du peptide neurotrophique, ADNF-9, contre l'apoptose induite par l'alcool pendant la grossesse dans C57BL / 6

Le but de cette procédure est d’évaluer les effets neuroprotecteurs des peptides trophiques dans un modèle d’exposition fœtale à l’alcool. Ceci est réalisé en accouplant d’abord les animaux de laboratoire, puis en traitant les femelles enceintes avec des peptides trophiques. Dans un deuxième temps, les fœtus sont disséqués pour isoler le cerveau des fœtus à des fins expérimentales. Ensuite, les cerveaux fœtaux sont incorporés dans de la gélatine pour la section, suivie d’une coloration en tunnel pour déterminer les résultats de la mort cellulaire.

Cela montre que l’exposition prénatale à l’alcool augmente le nombre de cellules positives dans le tunnel de l’éminence ganglionnaire. Par rapport à l’administration du peptide trophique dans le groupe témoin, un D et un F neuf ont significativement réduit l’augmentation des cellules positives sous tunnel induite par l’alcool par rapport aux animaux témoins traités à l’alcool. La démonstration visuelle de ce métal est donc essentielle, car la dissection du cerveau fœtal et les étapes intégrées sont difficiles à apprendre car les cerveaux fœtaux sont très petits à disséquer et à traiter pour la section. Première race C 57 souris noires six en plaçant des souris femelles de six semaines d’environ 20 grammes dans des cages domestiques mâles pendant deux heures immédiatement après le retrait.

Vérifiez la présence d’un bouchon de spermatozoïde pour confirmer que l’accouplement a eu lieu. Si un bouchon de spermatozoïde est présent, désignez ce jour embryonnaire zéro sur E sept poids correspondre les femelles enceintes en quatre groupes. Un groupe de régime liquide à base d’alcool fourni en accès libre comme seule source de nutriments.

Deux groupes témoins Perfed groupe de traitement peptidique trois, qui devrait recevoir une injection intrapéritonéale d’un peptide DNF neuf en plus de l’exposition à l’alcool. Régime liquide. Enregistrez le volume de nourriture liquide consommé par les animaux en 24 heures à partir de tubes à bouchon à vis gradués de 30 millilitres pour déterminer la quantité quotidienne d’alcool, de nourriture liquide ou de régime liquide apparié qui peut être fournie par un excès libre comme seule source de nutriments.

Assurez-vous qu’un régime liquide fraîchement préparé est fourni quotidiennement de E sept à E 13 après avoir sacrifié le Myer E 13 enceinte par euthanasie au dioxyde de carbone, suivie d’une luxation cervicale. Posez la carcasse sur la planche de dissection en position couchée et nettoyez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux stériles et des pinces pour faire une incision abdominale.

Une fois l’abdomen ouvert, tenez l’utérus avec une pince et utilisez une deuxième pince pour arracher lentement et doucement l’endomètre de l’utérus sans perforer les embryons. Retirez soigneusement les embryons de l’utérus et transférez-les dans la solution de tri équilibré de Hank Dans une boîte de culture cellulaire de 60 millimètres sur 15 millilitres sur de la glace humide, placez la boîte et le récipient à glace sur la platine d’un microscope stéréoscopique à l’aide d’une pince ultra-fine pour la microdissection. Retirez la peau des embryons dans la partie supérieure de la tête pour exposer le crâne.

Une fois que le crâne est exposé et clairement visualisé au stéréomicroscope, saisissez la base du crâne au niveau de la moelle épinière et du tronc cérébral avec des pinces et commencez à décoller le crâne. Continuez à décoller le crâne morceau par morceau, de l’arrière vers l’avant de la tête. Une fois que le cerveau est complètement exposé, utilisez des pinces pour l’extraire.

Ensuite, disséquez le cerveau fœtal de la base du bulbe primordial ou d’usine à la base du Met Postfix tous les cerveaux fœtaux disséqués dans du paraldéhyde à 4 % pendant deux à trois jours. Les cerveaux fœtaux peuvent également être congelés si vous les testez pour le western blot ou les tests enzymatiques. Après avoir préparé une solution à 10 % de gélatine de grade A préparée dans de l’eau distillée, remplissez à moitié un moule d’enrobage détachable et attendez que la gélatine se solidifie.

Placez les cerveaux du fœtus témoin et traité prénatal côte à côte sur la gélatine solidifiée. Il s’agit de maintenir des conditions cohérentes entre le groupe témoin et le groupe expérimental. Assurez-vous que la gélatine n’est pas trop chaude et ajoutez de la gélatine liquide sur le dessus de la cervelle fœtale pour faire un moule complet.

Le moule final doit ressembler à cette image, réfrigérez le moule à gélatine préparé qui contient le cerveau du fœtus pendant 15 minutes. Ensuite, décollez le plastique du moule d’enrobage. Le moule final devrait ressembler à ceci, puis transférer la gélatine contenant le cerveau fœtal dans du paraldéhyde à 4 % pendant deux jours.

Le troisième jour, fixez le bloc de gélatine contenant des cerveaux fœtaux fixes au stade du viome. Ensuite, sectionnez les cerveaux à l’aide d’un viome réglé à 25 à 50 microns d’épaisseur pour la section coronale. Collectez les sections de cerveau fœtal dans PBS, puis montez les sections de cerveau fœtal sur des lames de super frost plus dans l’eau et laissez-les sécher pendant 15 minutes.

Au bout de 15 minutes. Placez les lames dans le PBS pour tester la réaction tunnel le lendemain. Tout d’abord, immergez les lames dans une solution de 20 microgrammes par millilitre de protéinase K et de PBS pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, rincez trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune sur un agitateur orbital. Incuber les sections avec 3 % de peroxyde d’hydrogène dans du méthanol pendant 10 minutes à température ambiante sans secouer. Lavez ensuite les lames comme précédemment.

Ensuite, incubez des sections dans une solution perméable pendant deux minutes sur de la glace. Après l’incubation, lavé deux fois dans PBS. Comme précédemment, utilisez un mouchoir de laboratoire pour sécher la zone de la lame autour des sections.

Ensuite, utilisez un stylo pour dessiner autour des sections de la diapositive. Cela permet d’éviter les fuites de la solution de coloration, ce qui permet d’utiliser un petit volume. Incuber une section dans chaque paire avec un mélange de réaction tunnel préparé selon les instructions du fabricant.

Ajouter une solution porteuse sans réactif tunnel à la section de contrôle négatif. Ensuite, incubez les lames pendant une heure à 37 degrés Celsius. Une fois le temps d’incubation écoulé, laver les lames trois fois dans du PBS sur un agitateur orbital comme précédemment.

Séchez ensuite la zone autour du tissu avec une lingette de laboratoire. Ensuite, incubez les sections avec la solution POD du convertisseur pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sans secouer. Rincez ensuite les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec du tris HCL.

Transférez les lames dans un support et placez-les dans un bocal coplin contenant 0,05 % de DAB et 0,003 % de peroxyde d’hydrogène. Couvrez le bocal de papier d’aluminium et placez-le sur un agitateur orbital sur de la glace pendant sept minutes après l’incubation, en lavant PBS comme avant si vous le souhaitez. Les lames peuvent être stockées dans le PBS avant de procéder à la coloration du compteur de missiles, comme détaillé dans la partie texte du protocole.

Les images suivantes montrent les effets du peptide neurotrophique, A DNF neuf contre l’apoptose induite par l’alcool à l’aide d’un test tunnel dans l’éminence ganglionnaire comme l’exposition prénatale à l’alcool au stade E 13 induit des augmentations de la mort cellulaire comme indiqué par les pointes de flèches dans le groupe A LC par rapport au groupe PF. L’administration d’un D NF neuf associée à une exposition prénatale à l’alcool a induit une diminution des cellules positives pour le tunnel. L’analyse statistique a démontré que l’administration de MA et de F neuf empêchait l’augmentation induite par l’alcool dans les cellules positives au tunnel.

Les valeurs sont indiquées sous forme de moyennes plus moins l’erreur type de la moyenne. Un seul astérisque indique une valeur P inférieure à 0,052. L’astérisque indique une valeur P inférieure à 0,01 par le test post-hoc de Newman Coles.

Chaque groupe contenait un N de quatre. Ainsi, après son développement, cette technique permet aux chercheurs et au domaine du développement du cerveau d’explorer les effets des médicaments ou des composés et le développement du cerveau chez la souris.