Name: Méthodes expérimentales pour tester les effets du peptide neurotrophique, ADNF-9, contre lapoptose induite par lalcool pendant la grossesse dans C57BL / 6 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Découvrez les effets neuroprotecteurs des peptides trophiques contre l'apoptose induite par l'alcool chez les souris C57BL/6. Cette méthode permet d'évaluer les stratégies thérapeutiques pour protéger le développement cérébral fœtal.

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Ce projet de recherche a été soutenue par Nombre de prix R21AA017735 (YS) des Instituts national sur l&#39;abus d&#39;alcool et l&#39;alcoolisme. Le contenu relève de la seule responsabilité de l&#39;auteur et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l&#39;Institut national sur l&#39;abus d&#39;alcool et l&#39;alcoolisme ou de la National Institutes of Health. L&#39;auteur tient également à remercier Charisse Montgomery pour éditer ce manuscrit.

1. Animaux d&#39;élevage et de traitement de peptide trophique <ol><li> Race C57BL/mice en plaçant les souris femelles (~ 6 semaines, poids moyen 20 g) dans les cages du mâle pendant 2 heures. </li><li> Voir pour un bouchon de spermatozoïdes et / ou frottis vaginal immédiatement après. </li><li> Si elle est positive, désigner ce point de temps que embryonnaire jour 0 (E0). </li><li> Le E7, poids-match femelles gravides au contrôle et à des groupes de traitement (3 groupes) sont attribuées comme décrit récemment 4: 1) L&#39;alcool (éthanol) groupe de diète liquide (ALC), 2) nourri en groupe contrôle (PF); 3) groupe de traitement peptide, qui devrait recevoir une injection intrapéritonéale (IP) de l&#39;ADNF-9 peptide instar de l&#39;alcool régime liquide d&#39;exposition (ALC/ADNF-9). Les détails de la préparation de la SLA et les régimes PF et la procédure d&#39;injections IP peuvent être trouvées dans notre récente 4 de travail. </li><li> Mesurer alimentation quotidienne de liquide d&#39;alcool qui peut être fourni que le libre accès comme la seule source de nutriments. Diète liquide PF attelé individuellement to un barrage ALC peut être mesurée tous les jours ainsi. </li><li> Le volume de diète liquide consommé au cours des 24 heures précédentes peut être enregistré à partir de 30 ml gradué tubes à bouchon à vis et l&#39;alimentation fraîchement préparée doit être fournie chaque jour à partir de E7 à E13. </li></ol> 2. Dissection du fœtus et microdissection cerveaux foetaux <ol><li> Le sacrifice des souris gravides sur E13 par euthanasie profondément les souris avec une procédure CO 2 suivie d&#39;une dislocation cervicale. </li><li> Nettoyer le site d&#39;incision abdominale à l&#39;éthanol 70%. </li><li> Faire une incision abdominale à l&#39;aide des ciseaux et des pinces stériles. </li><li> Une fois l&#39;abdomen est ouvert, disséquer l&#39;utérus en le tenant avec une pince et en utilisant les autres pinces pour arracher le mésomètre loin de l&#39;utérus. Assurez-vous de faire cette procédure lentement afin d&#39;éviter de percer les embryons. </li><li> Retirez les embryons de l&#39;utérus et les transférer dans un plat de culture cellulaire (60 mm x 15 mm) contenant une solution saline équilibrée de Hanks<html> (HBSS) dans de l&#39;eau glacée. </li><li> Disséquer le cerveau du fœtus à partir des embryons entiers sous loupe binoculaire pour microdissection. </li><li> En utilisant des pinces ultra-fines pour microdissection, retirer la peau des embryons à la partie supérieure de la tête pour exposer le crâne. </li><li> Une fois que le crâne est exposé clairement et visualisé sous la loupe binoculaire, microdissection, puis décoller le crâne à partir de la partie postérieure du cerveau à la moelle épinière et les zones du tronc cérébral. </li><li> Assurez-vous de détacher la pièce de crâne par morceau d&#39;arrière en partie antérieure de la tête. </li><li> Une fois que le cerveau du fœtus sont exposés visuellement, procéder à leur extraction. </li><li> Disséquer le cerveau du fœtus à partir de la base du bulbe olfactif ébauche à la base de la métencéphale. </li><li> Postfix tout disséqué les cerveaux foetaux dans du paraformaldéhyde 4% pendant 2-3 jours. Vous pouvez également congeler les autres cerveaux foetaux de chaque barrage si vous les testez pour le Western Blot ou dosages enzymatiques. </li></ol>nt &quot;&gt; Remarque: Les procédures d&#39;utilisation des animaux ont été approuvés par le soin des animaux institutionnel et l&#39;utilisation Comité de l&#39;Université de Toledo qui sont en conformité avec les directives de l&#39;Institutional Animal Care et utiliser Comité à la National Institutes of Health et le Guide pour l&#39; soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. 3. Intégration Brains fœtus dans de la gélatine pour la coupe <ol><li> Préparer 10% de gélatine de catégorie A. </li><li> Remplir un moule pelable intégration à mi-chemin et attendre que les solidifie gélatine. </li><li> Placer le contrôle et fœtale cerveaux side-by-side traitée avant la naissance sur le dessus de la gélatine solidifiée. Cela permet de garder des conditions uniformes de détection immunologique de la mort cellulaire entre les deux groupes témoins et expérimentaux. </li><li> Ajouter la gélatine liquide sur le dessus du cerveau du fœtus pour faire un moule complet (assurez-vous que la gélatine n&#39;est pas trop chaud). </li><li> Réfrigérer le moule de gélatine préparée qui détient le cerveau du fœtus pendant 15 min. </li><li> Décollezle moule en plastique d&#39;enrobage et ensuite transférer les pré-faites de gélatine contenant cerveau du fœtus dans du paraformaldéhyde 4% pendant deux jours. </li><li> Lieu et partie fixe cerveau du fœtus en gélatine à l&#39;aide vibratome machine à découpe (Leica VT 1000S) à 50 um d&#39;épaisseur pour la coupe coronale. Cette épaisseur est testé dans nos études, car il offre de meilleures caractéristiques anatomiques. En outre, les épaisseurs de 25 um et plus peuvent également être testés avec cette technique impliquant intégrée de cerveau du fœtus en gélatine à 10%. Notez que les coupes coronales ont été coupés à l&#39;aide vibratome au niveau de l&#39;éminence des noyaux gris centraux du cerveau antérieur sur </li><li> Recueillir les sections du cerveau du fœtus dans (PBS) solution saline tamponnée au phosphate. </li><li> Montez les sections du cerveau du fœtus dans Superfrost majoré des diapositives dans l&#39;eau. </li><li> Sécher les sections montées pour 15 min. </li><li> Placer les lames (monté avec les sections du cerveau du fœtus) dans PBS pour le test le lendemain de réaction TUNEL. </li></ol> 4. TUNEL réaction de Detection de la mort cellulaire ou apoptose (TUNEL: TdT médiée dUTP Nick étiquetage End; TdT: désoxynucléotidyltransférase terminale). Ce test vise à déterminer la mort cellulaire. <ol><li> Traiter les sections du cerveau du fœtus montés dans Superfrost plus diapositives avec la protéinase K (20 pg / ml) pendant 5 min à 37 ° C (300 pi de la protéinase K mixte dans 20 ml de PBS). Les lames sont assemblées en 5 Plend ouvert maile). </li><li> Rincer les coupes de cerveau fœtal (montés dans les diapositives) avec PBS trois fois pendant 5 min sous orbital. </li><li> Incuber les sections avec 3% de H 2 O 2 dans le méthanol pendant 10 min à température ambiante (3 ml 30% H 2 O 2 dans 27 ml de méthanol à 100%) (diapositives ne doivent pas être dans un shaker). </li><li> Rincer sections avec PBS trois fois pendant 5 min dans un agitateur orbital. </li><li> Incuber les coupes dans une solution de perméabilisation (0,1% Triton X-100 à 0,1% de citrate de sodium) pendant 2 minutes sur de la glace (4 ° C) (100 TritonX pi + 0,1 g de citrate de sodium + 99,9 ml distilléeeau d). </li><li> Rincer sections dans PBS deux fois pendant 5 min dans un agitateur orbital. </li><li> Zone sèche autour des sections dans les coulisses. </li><li> Dessinez barrière sur des lames Superfrost majoré en utilisant Pen PAP. Ceci a pour but d&#39;éviter toute fuite de la solution qui est utilisée pour traiter les articles pour la détection de cellules positives au TUNEL. </li><li> Incuber les sections avec le mélange de réaction TUNEL (50 pl de la bouteille 1 et 450 ul de la bouteille 2) pendant 1 heure à 37 ° C, la commande sera utilisé par incubation dans une solution de la bouteille 2. </li><li> Rincer avec du PBS trois fois 5 minutes sous Orbit shaker. </li><li> Zone sèche autour du tissu. </li><li> Incuber les coupes avec convertisseur-POD pendant 30 min à 37 ° C. </li><li> Rincer les sections trois fois pendant 5 minutes avec Tris HCl (pH 7,5, 0,05 M). </li><li> Incuber les sections pour 7 min à 0,05% de tétrachlorhydrate 3&#39;-3 &#39;-diaminobenzidine (DAB) et 0,003% de H 2 O 2 (25 ml Tris HCl, pH 7,5, 0,05 M + 25 pi 3% de H 2 0 2 + 500 DAB ul) Sous Oribtal agitateur à 4 ° C (dans la glace) et dans l&#39;obscurité (assurez-vous d&#39;effectuer cette procédure à nouveau 5 Plend ouvert mailer). </li><li> Rincer les sections avec PBS trois fois 5 minutes sous orbital. </li><li> Gardez les sections de lames dans du PBS pour pas plus de 24 heures dans du PBS, puis de les traiter pour la coloration de Nissl comme indiqué dans le protocole de la prochaine section. </li></ol> Note: DAB est un cancérogène. Utiliser des gants et nettoyer tous les plats utilisés avec l&#39;eau de Javel une fois fini avec toutes les expériences. 5. Coloration Nissl pour la préparation de coupes de cerveau fœtal pour l&#39;observation microscopique <ol><li> Procédure de coloration Nissl doit être effectuée sous une hotte de sécurité biologique. </li><li> Rincer les sections des diaporamas avec de l&#39;eau déminéralisée pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections de l&#39;éthanol à 70% pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections dans l&#39;éthanol à 95% pendant 6 min. </li><li> Incuber les sections de l&#39;éthanol à 70% pendant 2 min. </li><li> Rincer les sections déminéralisée water pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections de crésyl violet Stain pendant 3 min. </li><li> Rincer les sections dans l&#39;eau déminéralisée pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections de l&#39;éthanol à 70% pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections dans 95% d&#39;éthanol + 3 ml d&#39;acide acétique glacial pendant 3 min. </li><li> Incuber les sections dans l&#39;éthanol à 95% pendant 2 min. </li><li> Incuber les sections dans l&#39;éthanol à 100% pendant 2 min trois fois. </li><li> Incuber les sections dans le xylène pendant 10 minutes trois fois. </li><li> Diapositives détenant les sections du cerveau du fœtus peuvent être montés à l&#39;aide Permount et des lames de verre de glissement de couverture. </li><li> Laisser le diapositives montées nuit avant l&#39;observation et l&#39;analyse microscopique. </li><li> Observation et microphotographies au microscope peuvent être réalisées en vertu de Leica microscope droit. </li></ol>

<ol><li>Sari, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neuroprotective+protein-derived+peptide%2C+NAP%2C+preventing+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neuroprotective protein-derived peptide, NAP, preventing alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 158 (4), 1426-1435 (2009).</li>
<li>Sari, Y., Chiba, T., Yamada, M., Rebec, G. V., Aiso, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+peptide%2C+colivelin%2C+prevents+alcohol-induced+apoptosis+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mice%3A+signaling+pathway+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A novel peptide, colivelin, prevents alcohol-induced apoptosis in fetal brain of C57BL/6 mice: signaling pathway investigations.</a> Neuroscience. 164 (4), 1653-1664 (2009).</li>
<li>Sari, Y., Hammad, L. A., Saleh, M. M., Rebec, G. V., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+selective+neurotransmitters+in+fetal+brains+of+prenatally+alcohol-treated+C57BL%2F6+mice%3A+quantitative+analysis+using+liquid+chromatography%2Ftandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alteration of selective neurotransmitters in fetal brains of prenatally alcohol-treated C57BL/6 mice: quantitative analysis using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 28 (3), 263-269 (2010).</li>
<li>Sari, Y., Weedman, J. M., Ge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotrophic+factor-derived+peptide+prevents+alcohol-induced+apoptosis%2C+in+part%2C+through+Bcl2+and+c-Jun+N-terminal+kinase+signaling+pathways+in+fetal+brain+of+C57BL%2F6+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotrophic factor-derived peptide prevents alcohol-induced apoptosis, in part, through Bcl2 and c-Jun N-terminal kinase signaling pathways in fetal brain of C57BL/6 mouse.</a> Neuroscience. 202, 465-473 (2012).</li>
<li>Sari, Y., Zhang, M., Mechref, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+proteins+in+fetal+brains+of+alcohol-treated+prenatally+C57BL%2F6+mice%3A+a+proteomic+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Differential expression of proteins in fetal brains of alcohol-treated prenatally C57BL/6 mice: a proteomic investigation.</a> Electrophoresis. 31, 1-14 (2010).</li>
<li>Bassan, M., Zamostiano, R., Davidson, A., Pinhasov, A., Giladi, E., Perl, O., Bassan, H., Blat, C., Gibney, G., Glazner, G., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequence+of+a+novel+protein+containing+a+femtomolar-activity-dependent+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Complete sequence of a novel protein containing a femtomolar-activity-dependent neuroprotective peptide.</a> J. Neurochem. 72 (3), 1283-1293 (1999).</li>
<li>Brenneman, D. E., Hauser, J., Neale, E., Rubinraut, S., Fridkin, M., Davidson, A., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotrophic+factor%3A+structure-activity+relationships+of+femtomolar-acting+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotrophic factor: structure-activity relationships of femtomolar-acting peptides.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 285 (2), 619-627 (1998).</li>
<li>Spong, C. Y., Abebe, D. T., Gozes, I., Brenneman, D. E., Hill, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+fetal+demise+and+growth+restriction+in+a+mouse+model+of+fetal+alcohol+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of fetal demise and growth restriction in a mouse model of fetal alcohol syndrome.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 297 (2), 774-779 (2001).</li>
<li>Sari, Y., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+deficits+associated+with+fetal+alcohol+exposure+may+be+protected%2C+in+part%2C+by+peptides+derived+from+activity-dependent+neurotrophic+factor+and+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Brain deficits associated with fetal alcohol exposure may be protected, in part, by peptides derived from activity-dependent neurotrophic factor and activity-dependent neuroprotective protein.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 52 (1), 107-118 (2006).</li>
<li>Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+femtomolar-acting+neuroprotective+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A femtomolar-acting neuroprotective peptide.</a> J. Clin. Invest. 97 (10), 2299-2307 (1996).</li>
<li>Zamostiano, R., Pinhasov, A., Gelber, E., Steingart, R. A., Seroussi, E., Giladi, E., Bassan, M., Wollman, Y., Eyre, H. J., Mulley, J. C., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+characterization+of+the+human+activity-dependent+neuroprotective+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and characterization of the human activity-dependent neuroprotective protein.</a> J. Biol. Chem. 276 (1), 708-714 (2001).</li>
<li>Offen, D., Sherki, Y., Melamed, E., Fridkin, M., Brenneman, D. E., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasoactive+intestinal+peptide+%28VIP%29+prevents+neurotoxicity+in+neuronal+cultures%3A+relevance+to+neuroprotection+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Vasoactive intestinal peptide (VIP) prevents neurotoxicity in neuronal cultures: relevance to neuroprotection in Parkinson's disease.</a> Brain Res. 854 (1-2), 257-262 (2000).</li>
<li>Steingart, R. A., Solomon, B., Brenneman, D. E., Fridkin, M., Gozes, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIP+and+peptides+related+to+activity-dependent+neurotrophic+factor+protect+PC12+cells+against+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VIP and peptides related to activity-dependent neurotrophic factor protect PC12 cells against oxidative stress.</a> J. Mol. Neurosci. 15 (3), 137-145 (2000).</li>
</ol>

Pas de révélations à faire.

La méthodologie et la technologie présentée dans cette étude mettent en évidence les effets de l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool dans le cerveau du fœtus et le rôle des peptides trophiques dans la prévention de ces effets. Ceux-ci peuvent fournir des informations sur la façon d&#39;étudier d&#39;autres drogues ou d&#39;autres substances chimiques toxiques dans le cerveau du fœtus au cours des différentes étapes de la grossesse. En ce qui concerne le paradigme de reproduction, dans ce...

L&#39;objectif des méthodes expérimentales décrites ici est d&#39;évaluer les effets neuroprotecteurs de peptides trophiques dans un modèle d&#39;exposition d&#39;alcoolisation fœtale en utilisant plusieurs techniques concernant la reproduction, l&#39;alimentation, microdissecting, et la détection de la mort cellulaire. Le travail de notre laboratoire a impliqué une diète liquide mélangé avec de l&#39;alcool comme un modèle de consommation d&#39;alcool modérée, ce qui pourrait être similaire à un paradigme à la consommation humaine en termes de la quantité d&#39;alcool consommée 1-5. Nous et d&#39;autres avons identifié trois peptides dérivés qui sont neuroprotecteur contre les effets délétères de l&#39;exposition d&#39;alcoolisme foetal. Les études portant sur l&#39;exposition à l&#39;alcool pendant les stades embryonnaires utilisant des modèles animaux peuvent conduire à l&#39;identification des mécanismes potentiels de neuroprotection et de permettre le développement de procédures d&#39;intervention. Cela peut fournir suffisamment d&#39;informations sur les effets neuroprotecteurs et l&#39;atténuation des effets délétères de l&#39;exposition à l&#39;alcool pendant la grossesse. Prévention possible des effets de l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool peut impliquer le traitement des souris gravides avec des peptides qui ont été montrés pour être impliqués dans la neuroprotection in vitro et in vivo 6,7 1,2,4,8,9. Parmi ces peptides, SALLRSIPA, connu sous le nom ADNF-9 ou SAL, est dérivé d&#39;activité dépendant de facteur neurotrophique (ADNF) 7,10. Un autre peptide avec la séquence NAPVSIPQ peptide, appelé PAN, dérivé de la protéine neuroprotectrice dépendant de l&#39;activité (ADNP) 6,11, a démontré un effet protecteur puissant contre le stress oxydatif associé à l&#39;exposition à l&#39;alcool 12,13. En outre, nous avons récemment identifié un nouveau peptide synthétisé, colivelin qui semble jouer un rôle clé neuroprotecteur dans le alcoolisation fœtale modèle d&#39;exposition 2. Colivelin est composé de ADNF-9 et AGA (C8R) HNG17 (PAGASRLLLLTGEIDLP). L&#39;importance de l&#39;utilisation de ces peptides, c&#39;est qu&#39;ils ont la capacité detraverser la barrière sang-cerveau pour prévenir les effets de l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool et les déficits de croissance du cerveau. Les méthodes expérimentales ont utilisé des souris C57BL / 6 pour tester les effets neuroprotecteurs contre l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool. Nous avons adopté une fenêtre de 2 heures au lieu de reproduction pendant la nuit afin d&#39;estimer avec précision le jour embryonnaire 0 (E0), car il peut être révélée par la détection d&#39;un bouchon de sperme et un frottis vaginal 1-5. Nous avons utilisé une diète liquide avec des tubes d&#39;alimentation, car cela est considéré comme libre accès au lieu de la livraison de l&#39;alcool par voie gavage, ce qui peut induire un stress à des souris gravides. D&#39;autre part, microdissection peut être difficile en raison de la douceur du tissu du cerveau du fœtus, ce qui peut être rencontrée en disséquant le cerveau du fœtus aux stades embryonnaires. Ici, nous montrons techniques visualisées pour faire face à tous les défis impliquant microdissection. En outre, depuis le sectionnement du cerveau du fœtus peut aussi être difficile, nous avons adoptéune technique qui consiste à intégrer le cerveau du fœtus en gélatine à l&#39;aide pelable intégration des moules. Nous avons réussi à réduire le cerveau du fœtus dans les sections flottantes à 50 um d&#39;épaisseur. Cela nous permet d&#39;étudier des modifications de protéines contenu dans les sections du cerveau du fœtus, y compris l&#39;identification de la mort cellulaire.

<table><tbody><tr><td>Glissières Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>PAP PEN</td><td>Research Products Int. Corp.</td><td></td><td></td>195506</tr><tr><td>5-Plend Open Mailer </td><td>Heathrow Scientific, LLC</td><td>HS 15983G</td><td></td></tr><tr><td>Moules d’enrobage pelables</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70182</td><td></td></tr><tr><td>Kit de détection de la mort cellulaire in situ, POD</td><td>Roche Diagnostics, Inc</td><td>11684817910</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution</td><td>Invitrogen</td><td>14170-120</td><td></td></tr><tr><td>Gélatine de type A</td><td>FisherScientific</td><td>G8-500</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>Leica M60, KL 200 LED</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Vibratome</td><td>Leica, Inc</td><td>Leica VT 1000S</td><td></td></tr><tr><td>Moria Pince ultra fine </td><td>Outils de science fine</td><td>11370-40</td><td>2 paires</td></tr><tr><td>Graduate 30 ml Tubes d’alimentation</td><td>Dyets, Inc</td><td>900012</td><td></td></tr><tr><td>Vitamin Mix </td><td>Bio-Serv. Inc.</td><td>F8031</td><td></td></tr><tr><td>Mélange minéral</td><td>Bio-Serv. Inc.</td><td>F8598</td><td></td></tr><tr><td>Maltose Dextrin</td><td>Bio-Serv. Inc.</td><td>3650</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique 190 Proof, 5 gallons</td><td>111000190-SS05</td><td>Microscope droit Pharmco-AAPER</td><td></td></tr><tr><td></td><td>W. NUHSBAUM, Inc</td><td>LEICA DM 4000</td><td></td></tr></tbody></table>

méthodes expérimentales pour tester les effets du peptide neurotrophique, adnf-9, contre l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool pendant la grossesse dans c57bl / 6

Experimental Methods for Testing the Effects of Neurotrophic Peptide, ADNF-9, Against Alcohol-induced Apoptosis during Pregnancy in C57BL/6 Mice

Les modèles expérimentaux pour étudier les effets de l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool au cours de stades embryonnaires de la croissance du cerveau du fœtus sont difficiles. Cela est principalement dû à la difficulté de microdissection du cerveau du fœtus et leur sectionnement pour la détermination des cellules apoptotiques causées par l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool. Les expériences décrites ici fournir des techniques visualisées à partir des souris d&#39;élevage à l&#39;identification de la mort cellulaire dans les tissus du cerveau du fœtus. Cette étude a utilisé C57BL / 6 que le modèle animal pour l&#39;étude de l&#39;exposition d&#39;alcoolisation fœtale et le rôle du peptide trophique contre l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool. La sélection consiste en une fenêtre de matage en 2 heures pour déterminer le degré exact de l&#39;âge embryonnaire. Un modèle d&#39;exposition d&#39;alcoolisation fœtale établie a été utilisée dans cette étude afin de déterminer les effets de l&#39;exposition prénatale à l&#39;alcool dans le cerveau du fœtus. Cela implique le libre accès à l&#39;alcool ou nourri en régimes liquides comme la seule source de nutriments pour les souris enceintes. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Les techniques impliquant dissection des fœtus et microdissection du cerveau du fœtus sont décrites avec soin, puisque celle-ci peut être difficile. Microdissection nécessite un microscope stéréoscopique et pince ultra-fines. Procédures étape par étape pour disséquer le cerveau du fœtus sont fournis visuellement. Les cerveaux sont disséqués foetales à partir de la base du bulbe olfactif ébauche à la base de la métencéphale. Pour enquêter sur l&#39;apoptose, le cerveau du fœtus sont d&#39;abord ancrées dans la gélatine à l&#39;aide d&#39;un moule pelable afin de faciliter leur sectionnement avec un appareil vibratome. Cerveau fœtal embarqués et fixes en paraformaldéhyde sont facilement sectionné, et les sections flottantes peuvent être montés en plus des diapositives SUPERFROST pour la détermination de l&#39;apoptose ou mort cellulaire. TUNEL (TdT médiée dUTP Nick étiquetage End; TdT: désoxynucléotidyltransférase terminale) test a été utilisée pour identifier la mort des cellules ou des cellules apoptotiques. Il est à noter que l&#39;APoptosis et la cytotoxicité à médiation cellulaire sont caractérisés par la fragmentation de l&#39;ADN. Ainsi, les cellules TUNEL positifs visualisés sont révélateurs de la mort des cellules ou des cellules apoptotiques. Les modèles expérimentaux ici fournissent des informations sur l&#39;utilisation d&#39;un régime liquide établi pour étudier les effets de l&#39;alcool et le rôle des peptides neurotrophiques dans le cerveau pendant la grossesse foetus. Il s&#39;agit de reproduction et d&#39;alimentation des souris gravides, microdissecting cerveau du fœtus, et la détermination de l&#39;apoptose. Ensemble, ces techniques visuelles et textuelles peuvent être une source d&#39;enquêter sur l&#39;exposition prénatale de substances nocives dans le cerveau du fœtus.

Les méthodes expérimentales décrites ici montrent qu&#39;une fenêtre de sélection de 2 heures est essentielle pour estimer stade gestationnel précis. Nous avons démontré la dissection des embryons à l&#39;âge de E13. Nous avons également démontré microdissection du cerveau fœtal à E13. La procédure comporte plusieurs étapes (AC), tel que décrit dans la figure 1. Cerveau du fœtus sont disséqués à partir de la base du bulbe olfactif de primordium à la base de la métencéphale (Figure 1). C...

Les modèles expérimentaux proposés ici se concentrer sur l&#39;étude des effets de l&#39;exposition à l&#39;alcool dans l&#39;apoptose et l&#39;application de peptide neurotrophique pendant la grossesse dans le cerveau du fœtus. Une description détaillée de l&#39;élevage à la collecte de cerveau du fœtus est décrite. Techniques pour la détermination de l&#39;apoptose sont également décrites en détail.

Méthodes expérimentales pour tester les effets du peptide neurotrophique, ADNF-9, contre l&#39;apoptose induite par l&#39;alcool pendant la grossesse dans C57BL / 6

Experimental designs for investigating the effects of prenatal alcohol exposure during early embryonic stages in fetal brain growth are challenging. This ...

Le but de cette procédure est d’évaluer les effets neuroprotecteurs des peptides trophiques dans un modèle d’exposition fœtale à l’alcool. Ceci est réalisé en accouplant d’abord les animaux de laboratoire, puis en traitant les femelles enceintes avec des peptides trophiques. Dans un deuxième temps, les fœtus sont disséqués pour isoler le cerveau des fœtus à des fins expérimentales. Ensuite, les cerveaux fœtaux sont incorporés dans de la gélatine pour la section, suivie d’une coloration en tunnel pour déterminer les résultats de la mort cellulaire.Cela montre que l’exposition prénatale à l’alcool augmente le nombre de cellules positives dans le tunnel de l’éminence ganglionnaire. Par rapport à l’administration du peptide trophique dans le groupe témoin, un D et un F neuf ont significativement réduit l’augmentation des cellules positives sous tunnel induite par l’alcool par rapport aux animaux témoins traités à l’alcool. La démonstration visuelle de ce métal est donc essentielle, car la dissection du cerveau fœtal et les étapes intégrées sont difficiles à apprendre car les cerveaux fœtaux sont très petits à disséquer et à traiter pour la section. Première race C 57 souris noires six en plaçant des souris femelles de six semaines d’environ 20 grammes dans des cages domestiques mâles pendant deux heures immédiatement après le retrait.Vérifiez la présence d’un bouchon de spermatozoïde pour confirmer que l’accouplement a eu lieu. Si un bouchon de spermatozoïde est présent, désignez ce jour embryonnaire zéro sur E sept poids correspondre les femelles enceintes en quatre groupes. Un groupe de régime liquide à base d’alcool fourni en accès libre comme seule source de nutriments.Deux groupes témoins Perfed groupe de traitement peptidique trois, qui devrait recevoir une injection intrapéritonéale d’un peptide DNF neuf en plus de l’exposition à l’alcool. Régime liquide. Enregistrez le volume de nourriture liquide consommé par les animaux en 24 heures à partir de tubes à bouchon à vis gradués de 30 millilitres pour déterminer la quantité quotidienne d’alcool, de nourriture liquide ou de régime liquide apparié qui peut être fournie par un excès libre comme seule source de nutriments.Assurez-vous qu’un régime liquide fraîchement préparé est fourni quotidiennement de E sept à E 13 après avoir sacrifié le Myer E 13 enceinte par euthanasie au dioxyde de carbone, suivie d’une luxation cervicale. Posez la carcasse sur la planche de dissection en position couchée et nettoyez l’abdomen avec de l’éthanol à 70 %. Utilisez des ciseaux stériles et des pinces pour faire une incision abdominale.Une fois l’abdomen ouvert, tenez l’utérus avec une pince et utilisez une deuxième pince pour arracher lentement et doucement l’endomètre de l’utérus sans perforer les embryons. Retirez soigneusement les embryons de l’utérus et transférez-les dans la solution de tri équilibré de Hank Dans une boîte de culture cellulaire de 60 millimètres sur 15 millilitres sur de la glace humide, placez la boîte et le récipient à glace sur la platine d’un microscope stéréoscopique à l’aide d’une pince ultra-fine pour la microdissection. Retirez la peau des embryons dans la partie supérieure de la tête pour exposer le crâne.Une fois que le crâne est exposé et clairement visualisé au stéréomicroscope, saisissez la base du crâne au niveau de la moelle épinière et du tronc cérébral avec des pinces et commencez à décoller le crâne. Continuez à décoller le crâne morceau par morceau, de l’arrière vers l’avant de la tête. Une fois que le cerveau est complètement exposé, utilisez des pinces pour l’extraire.Ensuite, disséquez le cerveau fœtal de la base du bulbe primordial ou d’usine à la base du Met Postfix tous les cerveaux fœtaux disséqués dans du paraldéhyde à 4 % pendant deux à trois jours. Les cerveaux fœtaux peuvent également être congelés si vous les testez pour le western blot ou les tests enzymatiques. Après avoir préparé une solution à 10 % de gélatine de grade A préparée dans de l’eau distillée, remplissez à moitié un moule d’enrobage détachable et attendez que la gélatine se solidifie.Placez les cerveaux du fœtus témoin et traité prénatal côte à côte sur la gélatine solidifiée. Il s’agit de maintenir des conditions cohérentes entre le groupe témoin et le groupe expérimental. Assurez-vous que la gélatine n’est pas trop chaude et ajoutez de la gélatine liquide sur le dessus de la cervelle fœtale pour faire un moule complet.Le moule final doit ressembler à cette image, réfrigérez le moule à gélatine préparé qui contient le cerveau du fœtus pendant 15 minutes. Ensuite, décollez le plastique du moule d’enrobage. Le moule final devrait ressembler à ceci, puis transférer la gélatine contenant le cerveau fœtal dans du paraldéhyde à 4 % pendant deux jours.Le troisième jour, fixez le bloc de gélatine contenant des cerveaux fœtaux fixes au stade du viome. Ensuite, sectionnez les cerveaux à l’aide d’un viome réglé à 25 à 50 microns d’épaisseur pour la section coronale. Collectez les sections de cerveau fœtal dans PBS, puis montez les sections de cerveau fœtal sur des lames de super frost plus dans l’eau et laissez-les sécher pendant 15 minutes.Au bout de 15 minutes. Placez les lames dans le PBS pour tester la réaction tunnel le lendemain. Tout d’abord, immergez les lames dans une solution de 20 microgrammes par millilitre de protéinase K et de PBS pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Ensuite, rincez trois fois dans du PBS pendant cinq minutes chacune sur un agitateur orbital. Incuber les sections avec 3 % de peroxyde d’hydrogène dans du méthanol pendant 10 minutes à température ambiante sans secouer. Lavez ensuite les lames comme précédemment.Ensuite, incubez des sections dans une solution perméable pendant deux minutes sur de la glace. Après l’incubation, lavé deux fois dans PBS. Comme précédemment, utilisez un mouchoir de laboratoire pour sécher la zone de la lame autour des sections.Ensuite, utilisez un stylo pour dessiner autour des sections de la diapositive. Cela permet d’éviter les fuites de la solution de coloration, ce qui permet d’utiliser un petit volume. Incuber une section dans chaque paire avec un mélange de réaction tunnel préparé selon les instructions du fabricant.Ajouter une solution porteuse sans réactif tunnel à la section de contrôle négatif. Ensuite, incubez les lames pendant une heure à 37 degrés Celsius. Une fois le temps d’incubation écoulé, laver les lames trois fois dans du PBS sur un agitateur orbital comme précédemment.Séchez ensuite la zone autour du tissu avec une lingette de laboratoire. Ensuite, incubez les sections avec la solution POD du convertisseur pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius sans secouer. Rincez ensuite les sections trois fois pendant cinq minutes chacune avec du tris HCL.Transférez les lames dans un support et placez-les dans un bocal coplin contenant 0,05 % de DAB et 0,003 % de peroxyde d’hydrogène. Couvrez le bocal de papier d’aluminium et placez-le sur un agitateur orbital sur de la glace pendant sept minutes après l’incubation, en lavant PBS comme avant si vous le souhaitez. Les lames peuvent être stockées dans le PBS avant de procéder à la coloration du compteur de missiles, comme détaillé dans la partie texte du protocole.Les images suivantes montrent les effets du peptide neurotrophique, A DNF neuf contre l’apoptose induite par l’alcool à l’aide d’un test tunnel dans l’éminence ganglionnaire comme l’exposition prénatale à l’alcool au stade E 13 induit des augmentations de la mort cellulaire comme indiqué par les pointes de flèches dans le groupe A LC par rapport au groupe PF. L’administration d’un D NF neuf associée à une exposition prénatale à l’alcool a induit une diminution des cellules positives pour le tunnel. L’analyse statistique a démontré que l’administration de MA et de F neuf empêchait l’augmentation induite par l’alcool dans les cellules positives au tunnel.Les valeurs sont indiquées sous forme de moyennes plus moins l’erreur type de la moyenne. Un seul astérisque indique une valeur P inférieure à 0,052. L’astérisque indique une valeur P inférieure à 0,01 par le test post-hoc de Newman Coles.Chaque groupe contenait un N de quatre. Ainsi, après son développement, cette technique permet aux chercheurs et au domaine du développement du cerveau d’explorer les effets des médicaments ou des composés et le développement du cerveau chez la souris.

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Construction des chambres de vapeur utilisée pour exposer des souris à l&#39;alcool pendant l&#39;équivalent de toutes trois trimestres de développement humain

L’objectif du protocole présenté ici est de décrire les procédures d’exposition des rats à des niveaux modérés d’alcool pendant le développement cérébral prénatal et de quantifier les altérations du comportement social qui en résultent à l’âge adulte.

Modéré exposition prénatale à l&#39;alcool et la quantification du comportement social chez les rats adultes

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L’utilisation de Trace Eyeblink conditionnement de classique pour évaluer le dysfonctionnement hippocampique dans un modèle de Rat de Fetal Alcohol Spectrum Disorders

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