Gene piégeage utilisant Gal4 chez le poisson zèbre

L'objectif général de cette procédure est de produire des poissons mutants en utilisant un transposon perturbateur de gènes sur des vecteurs comportant GAL quatre, VP 16 comme rapporteur principal de piégeage génique. Ceci est réalisé en co-injectant d'abord le vecteur de piégeage génique ainsi que le transposase Tall deux dans des embryons de poisson zèbre. Les embryons injectés sont criblés pour détecter la fluorescence GFP trois jours après la fécondation, et environ 30 % des embryons les plus fluorescents sont sélectionnés pour constituer le lot F zéro.

Ensuite, les poissons F zéro sont croisés avec la lignée témoin U-A-S-M-R-F-P afin de sélectionner la transmission germinale des événements de piégeage génique. L'étape finale consiste à effectuer un croisement extérieur des F1 pour établir la génération F deux et produire des embryons destinés à la caractérisation moléculaire des événements de piégeage génique par PCR inverse et RACE en cinq prime. En fin de compte, environ un poisson F zéro sur dix analysés devrait produire une descendance présentant un piégeage génique.

Les transposons briseurs de gènes ont été conçus pour ne produire aucune mutation lors de leur intégration au niveau des entrées des gènes codant pour des protéines. Nos vecteurs GBT utilisent G four P 16 comme rapporteur principal de piégeage génique. Cette modification augmente la sensibilité pour les gènes exprimés à des niveaux faibles et nous permet d'utiliser les mutants de piégeage génique sans phénomènes de sur-évitement des phénotypes, en tant que moteurs G four pour l'expression tissu-spécifique d'autres transgènes.

Nous pensons que le principal goulot d'étranglement de notre méthode réside dans l'obtention de taux suffisamment élevés d'intégration du piège à gènes dans la lignée germinale des poissons F zéro. Dans cette démonstration, nous aborderons plusieurs étapes critiques : la préparation de l'ADN, la microinjection et le criblage des F zéro. Le vecteur de piège à gènes GBTB1 utilise GAL4-VP16 comme rapporteur principal du piège à gènes.

Des vecteurs courts minimaux à deux transposons orientés vers les extrémités sont utilisés pour l'insertion par piégeage génique. Les événements de piégeage génique sont détectés directement par un rapporteur EGFP sous le contrôle de 14 X GAL quatre UAS. L'ensemble du cassette de piégeage génique est encadré par des sites P directs.

Cela rend les événements de piégeage génique réversibles par l'expression de Cree combs, permettant ainsi de démontrer un lien de causalité entre une intégration spécifique de transposon et un phénotype observé. En outre, la cassette U-A-S-E-G-F-P est encadrée par des sites FRT directs. L'injection d'ARNm de flip combs entraînera l'excision de la cassette U-A-S-E-G-F-P, laissant la mutation de piégeage génique non marquée par la fluorescence de EGFP et permettant son utilisation dans des lignées transgéniques qui marquent des tissus ou des événements développementaux spécifiques par fluorescence de GFP avant la micro-injection.

Préparez le transposon sur l'ADN et les ARNm transposés. Préparez le vecteur d'insertion génique GBTB en ADN. En utilisant un kit de minipréparation standard et en suivant le protocole du fabricant, il est essentiel d'inclure l'étape de lavage PB lors de la préparation de l'ADN.

Sinon, l'ADN de la mini-préparation sera contaminé par les ARN, ce qui entraînera la dégradation des ARN messagers transposés. Diluez l'ADN dans de l'eau exempte d'ARN à raison de 10 nanogrammes par microlitre. Pour préparer les deux ARN messagers transposés, commencez par linéariser le PT3TST2 à l'aide de XboI. Ensuite, transcrivez l'ADN linéarisé à l'aide d'un kit de transcription in vitro M Message Machine T3, avec une modification.

Ajouter 0,5 microlitre d'inhibiteur d'ARN rib lock après l'étape de purification de l'ADN, puis purifier l'ARNm à l'aide d'un kit standard et évaluer la qualité de l'ARNm transcrit in vitro par électrophorèse sur gel d'agarose. Diluer l'ARNm dans de l'eau exempte d'ARNases à une concentration de 40 nanogrammes par microlitre et conserver en aliquots de deux microlitres à −80 degrés Celsius juste avant l'injection micro-injectée. Préparer le mélange d'injection en ajoutant huit microlitres d'ADN transpose dilué à un aliquot de deux microlitres d'ARNm transpose.

Injecter trois nanolitres de mélange ADN-ARN dans le jaune d'œufs d'embryons de poisson zèbre à une cellule en utilisant des techniques standards de microinjection, en visant l'interface entre le jaune et l'embryon. Après l'injection, analyser cinq microlitres de la solution restante sur un gel d'agarose à 1 % pour le contrôle qualité, afin de s'assurer que l'ARN messager transcrit n'a pas été dégradé. Environ six à huit heures après l'injection, éliminer les embryons non fécondés et morts, puis répartir les embryons à raison de 60 à 80 par boîte de Pétri de 100 millimètres. Retirer les embryons anormaux et morts un jour, deux jours et trois jours après la fécondation, et ce, trois jours après la fécondation, sous un microscope stéréo équipé de fluorescence ou un microscope droit.

Examinez les embryons et retirez tous les embryons anormaux. Examinez les embryons restants ne présentant pas de défauts évidents. Pour la fluorescence GFP, sélectionnez les embryons F zéro les plus fluorescents et élevez-les selon les procédures standard d'élevage de zebrafish dans ce laboratoire.

Les GBT sont généralement injectés dans des lignées présentant des motifs de pigmentation de type sauvage ou léopard. Il est raisonnable de s'attendre à ce que de 20 à 30 % des embryons injectés et sélectionnés pour être élevés survivent jusqu'à l'âge adulte. L'intégration du vecteur de piégeage génique GBTB peut conduire à l'expression d'EGFP par deux mécanismes différents.

Le premier correspond à un événement réel de piégeage génique. Le vecteur s'insère dans un gène, produisant une fusion entre l'extrémité 5' du transcrit de ce gène endogène et le GAL quatre VP 16, qui est ensuite traduit en une protéine de fusion contenant l'extrémité C-terminale de la protéine, recouverte par le gène muté inséré ainsi que le GAL quatre, VP 16. Cette protéine de fusion se lie à la séquence 14 XUAS et active la transcription de l'EGFP.

Le deuxième événement, moins souhaitable, est un piège à enhanceurs. Le promoteur minimal situé en amont d'EGFP passe sous le contrôle d'un enhanceur voisin du site d'intégration, entraînant la production d'EGFP en l'absence de GAL quatre, VP 16. Pour distinguer entre ces deux types d'événements, une lignée transgénique 14 X-U-A-S-M-R-F-P marquée par un GFP spécifique du cristallin gamma du cristallinien a été créée.

Les événements de piégeage génique sont vérifiés en croisant des poissons injectés avec GBT et des poissons homozygotes U-A-S-M-R-F-P, puis en recherchant une co-expression de GFP et de RFP, ce qui n'est possible que si GAL quatre et VP 16 sont produits et activent U-A-S-M-R-F-P en trans. Le protocole de dépistage des poissons F zéro consiste à croiser individuellement chaque poisson F zéro avec des poissons homozygotes U-A-S-M-R-F-P. Étant donné que les poissons injectés avec GBT présentent un phénotype pigmentaire sauvage ou léopard, tandis que la lignée homozygote U-A-S-M-R-F-P possède un fond brass, les poissons F zéro peuvent être facilement distingués des poissons U-A-S-M-R-F-P, ce qui élimine la nécessité d'enregistrer si le poisson F zéro dépisté était mâle ou femelle, ainsi que les erreurs potentielles découlant d'erreurs d'enregistrement ou de détermination du sexe de chaque poisson. Le lendemain.

Replacer les poissons U-A-S-M-R-F-P en laiton dans leur aquarium. Placer les poissons F zéro ayant produit des embryons dans des aquariums individuels statiques pendant que les embryons sont collectés pour le dépistage, puis transférer les embryons collectés dans de nouvelles boîtes de Pétri l'après-midi du jour zéro. Analyser les embryons pour la fluorescence GFP et RFP un jour après la fécondation et trois jours après la fécondation.

Extraire les embryons positifs pour GFP et RFP, puis les trier selon leur profil d'expression G-F-P-R-F-P. Si plus d'un profil est observé dans une ponte, les élever pour établir la génération F1. Noter que les embryons PF 3D positifs pour GFP mais négatifs pour RFP ne sont pas extraits, car ils représentent des événements de piégeage d'enhancer.

Croisez à nouveau les poissons F0 ayant produit une descendance positive pour G-F-P-R-F-P afin d'obtenir un second lot de positifs. Les poissons F1 sont triés afin d'établir des lignées F2, documenter le profil d'expression du gène piégé et congeler des lots d'embryons pour l'identification moléculaire des sites de piégeage génique. Effectuez d'abord un croisement entre des poissons F1 individuels et des poissons U-A-S-M-R-F-P homozygotes le jour suivant. Placez les poissons F1 ayant produit des embryons dans des aquariums statiques individuels, tandis que les embryons sont collectés pour être triés à un jour post-fécondation.

L'étiquetage RFP peut ne pas encore être apparu ; examinez donc les embryons à la recherche de la fluorescence GFP et isolez les embryons positifs pour GFP trois jours après la fécondation, puis effectuez un dépistage pour les fluorescences GFP et RFP et retirez les embryons doublement positifs. Photographiez ensuite les embryons positifs pour les deux fluorescences GFP et RFP cinq jours après la fécondation. Congelez des lots de 20 embryons positifs G-F-P-R-F-P et de 20 embryons négatifs G-F-P-R-F-P en vue de l'identification des gènes mutés par insertion à l'aide de la PCR inverse et de la technique 5' RACE. Élevez les embryons restants positifs G-F-P-R-F-P afin d'établir la génération F2 suite à une injection réussie.

Au moins 80 % des embryons injectés avec le mélange d'ADN du piège à gènes et de transposase ARN affichent un certain degré de fluorescence GFP. Une faible expression de GFP indique soit une injection infructueuse, soit une dégradation de l'ARN de transposase due à une contamination par des ARNases. Lorsque les embryons positifs GFP les plus fluorescents sont sélectionnés pour établir le lot F zéro, environ un poisson F zéro sur 10 examinés donnera une descendance porteuse du piège à gènes parmi les poissons F zéro à partir desquels les événements de piège à gènes sont récupérés.

La majorité transmet un seul événement d’insertion d’un gène piège, en plus de plusieurs insertions de transposons non exprimés. Étant donné que tout le cassette du gène piège est encadré par des sites P directs, toute mutation par insertion d’un gène piège, illustrée sur ce schéma par des boîtes bleues représentant les exons du gène muté, peut être inversée par l’expression de CRE recombinase. Ces images montrent la co-expression de GFP et de RFP dans le système nerveux de la lignée transgénique NSF TP six portant un gène piège ; l’injection d’ARN de CRE dans des embryons NSF TP six entraîne la perte de l’expression de GFP et de RFP.

Remarquez qu'il n'y a aucune réduction de l'expression de la GFP dans le cristallin, comme prévu. La plupart des procédures décrites ici s'appliquent également à d'autres écrans de piège à gènes ainsi qu'aux expériences classiques de transgénèse avec le transposon TOL2 et d'autres transposons. En suivant la procédure de piège à gènes décrite ici, la mise en place de 20 à 30 croisements F0 par semaine devrait permettre d'obtenir un piège à gènes par semaine.

Cependant, le protocole peut facilement être amplifié.