Gene piégeage utilisant Gal4 chez le poisson zèbre

L’objectif global de cette procédure est de produire des poissons mutants en utilisant la transposition de gènes sur des vecteurs avec GAL quatre, VP 16 comme principal rapporteur de piège à gènes. Ceci est accompli en co-injectant d’abord le vecteur de piège génétique avec deux grandes transposes dans des embryons de poisson-zèbre. Les embryons injectés sont soumis à un dépistage de la fluorescence GFP trois jours après la fécondation et environ 30 % des embryons les plus brillants sont sélectionnés pour établir le pool F zéro.

Ensuite, les poissons F zéro sont croisés avec la ligne de test U-A-S-M-R-F-P pour dépister la transmission germinale des événements de piège génétique. La dernière étape consiste à croiser le F1 pour établir la génération F deux et à générer des embryons pour la caractérisation moléculaire des événements de piège à gènes par PCR inverse et race à cinq primes. En fin de compte, environ un poisson F zéro sur 10 devrait produire une progéniture de piège à gènes.

Les transpos de rupture de gènes ont été conçus pour ne produire aucune mutation lors de l’intégration dans les entrées de gènes codant pour des protéines. Nos vecteurs GBT utilisent G four P 16 comme principal rapporteur de pièges génétiques. Cette modification augmente la sensibilité pour les gènes exprimés à de faibles niveaux et nous permet d’utiliser des mutants de piège à gènes sans éviter excessivement les phénotypes comme G quatre moteurs pour l’expression tissulaire spécifique d’autres transgènes.

Nous pensons que le principal goulot d’étranglement de notre méthode est d’obtenir des taux suffisamment élevés d’intégration du gène trapp dans la lignée germinale du poisson F zéro. Dans cette démonstration, nous aborderons plusieurs étapes critiques, la préparation de l’ADN, la MICRO-injection et le criblage F zéro. Le vecteur GBTB one gene trap utilise GAL quatre VP 16 comme principal rapporteur de piège génétique.

Deux transpositions minimales hautes aux extrémités sont utilisées pour l’intégration du piège à gènes. Les événements de piège à gènes sont directement détectés par un rapporteur EGFP sous le contrôle de 14 UAS 14 X GAL. L’ensemble de la cassette de pièges à gènes est flanqué de verrous directs P sites.

Cela rend les événements de piège à gènes réversibles par l’expression de peignes Cree pour établir la preuve d’une relation de causalité entre l’intégration d’un piège à gènes spécifique et un phénotype observé. De plus, la cassette U-A-S-E-G-F-P est flanquée de sites FRT directs. L’injection d’ARNm en peigne retourné conduira à l’excision de la cassette U-A-S-E-G-F-P, laissant la mutation du piège génique non marquée par la fluorescence EGFP et permettant son utilisation dans des lignées transgéniques qui marquent des tissus spécifiques ou des événements de développement par fluorescence GFP avant la micro-injection.

Préparez la transposée sur l’ADN et transposez l’ARNm. Préparez l’ADN vecteur du piège à un gène GBTB. À l’aide d’un mini kit de préparation standard et en suivant le protocole du fabricant, il est essentiel d’inclure l’étape de lavage PB lors de la préparation de l’ADN.

Sinon, l’ADN mini prep sera contaminé par des ARN, A entraînant une dégradation des transposes Mr.NA, diluer l’ADN dans de l’eau libre d’ARN à 10 nanogrammes par microlitre. Pour préparer les deux grandes transposes de l’ARNm : d’abord, linéarisé PT, trois, TS, T, deux, en utilisant xbo un. Ensuite, transcrivez l’ADN linéarisé à l’aide d’une machine à messages M T trois kit de transcription in vitro avec une modification.

Ajoutez 0,5 microlitre d’inhibiteur d’ARN de verrouillage des côtes après l’étape de traitement de l’ADN, purifiez l’ARNm à l’aide d’un kit standard et évaluez la qualité de l’ARNm transcrit in vitro par électrophorèse sur gel agros. Diluez l’ARNm dans de l’eau libre d’ARN à 40 nanogrammes par microlitre et stockez-le sous forme d’aliquotes de deux microlitres à moins 80 degrés Celsius juste avant la micro-injection. Préparez le mélange d’injection en ajoutant huit microlitres de transposition diluée sur l’ADN à une aliquote de deux microlitres de transposés ARNm.

Injecter trois nanolitres de mélange D-N-A-R-N-A dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre à une cellule en utilisant des techniques de micro-injection standard visant l’interface du blasphémateur du jaune Après l’injection, exécutez cinq microlitres de solution d’injection restante sur un gel à 1 % pour le contrôle de la qualité afin de s’assurer que l’ARNm transposé n’a pas été dégradé environ six à huit heures après l’injection. Retirez les embryons non fécondés et morts et distribuez les embryons à 60 à 80 par boîte de Pétri de 100 millimètres. Les embryons anormaux et morts sont retirés un jour après la fécondation, deux jours après la fécondation et trois jours après la fécondation trois jours après la fécondation sous un stéréomicroscope équipé d’une fluorescence ou d’un microscope vertical.

Dépister les embryons et retirer tout embryon anormal. Examinez les embryons restants sans défauts manifestes. Pour la fluorescence GFP, sélectionnez les embryons F zéro les plus brillants et élevez-les en utilisant les procédures standard d’élevage de poissons-zèbres zèbres dans ce laboratoire.

Les GBT sont généralement injectés dans des lignes avec des motifs de pigmentation de type sauvage ou léopard. Il est raisonnable de s’attendre à ce que 20 à 30 % des embryons injectés sélectionnés pour l’élevage survivent jusqu’à l’âge adulte. L’intégration du vecteur GBTB à un seul gène piège peut conduire à l’expression de l’EGFP par deux mécanismes différents.

Le premier est un véritable événement de piège à gènes. Le vecteur intègre dans un gène un transcrit de fusion entre les cinq premiers de ce transcrit de gène endogène et le GAL quatre VP 16 est fabriqué et traduit en une protéine de fusion contenant l’extrémité terminale de la protéine et enrobée par le gène muté de l’insert et le GAL quatre, VP 16. Cette protéine de fusion se lie aux 14 XUAS et active la transcription de l’EGFP.

Le deuxième événement moins souhaitable est un piège amplificateur. Le promoteur minimal devant EGFP tombe sous le contrôle d’un amplificateur près du site d’intégration conduisant à la production d’EGFP en l’absence de GAL quatre, VP 16. Pour distinguer ces deux classes d’événements, une ligne transgénique 14 X-U-A-S-M-R-F-P marquée par une GFP gammacristalline spécifique à la lentille a été réalisée.

Les événements de piège à gènes sont vérifiés en croisant des poissons injectés de GBT avec des poissons homozygotes U-A-S-M-R-F-P et en criblant la co-expression de GFP et RFP, ce qui n’est possible que si GAL quatre, VP 16 est fabriqué et active U-A-S-M-R-F-P en trans pour commencer la procédure de dépistage des poissons F zéro croisés individuels F zéro avec des poissons homozygotes U-A-S-M-R-F-P. Étant donné que les poissons injectés de GBT ont des motifs de pigmentation de type sauvage ou léopard et que la ligne homozygote U-A-S-M-R-F-P est sur un fond laiton, le poisson F zéro peut être facilement distingué du poisson U-A-S-M-R-F-P, éliminant ainsi la nécessité d’enregistrer si le F zéro contrôlé était un mâle ou une femelle, ainsi que les erreurs potentielles résultant d’erreurs dans l’enregistrement ou la détermination du sexe de chaque poisson. Le lendemain.

Remettez les poissons en laiton U-A-S-M-R-F-P dans leur aquarium. Placez les poissons F zéro qui ont donné des embryons dans des réservoirs statiques individuels pendant que les embryons sont collectés pour le dépistage, nettoyez et transférez les embryons collectés dans de nouvelles boîtes de Pétri dans l’après-midi du jour zéro. Dépister les embryons pour la fluorescence GFP et RFP un jour après la fécondation et trois jours après la fécondation.

Extrayez les embryons positifs pour la GFP et la RFP, triez-les par modèle d’expression G-F-P-R-F-P. Si plus d’un motif est observé dans une couvée, relevez-les pour établir la génération F1. Notez que les embryons de PF 3D qui sont positifs pour la GFP mais pas pour la RFP ne sont pas retirés car ils représentent des événements de piège amplificateur.

Croisez le poisson F zéro qui a produit une descendance G-F-P-R-F-P à nouveau positive pour obtenir un deuxième lot de poissons positifs. Les poissons F1 sont criblés pour établir deux familles F, pour documenter le profil d’expression des gènes trapp et pour congeler des lots d’embryons pour l’identification moléculaire des loci de pièges génétiques Croisez d’abord des poissons F1 individuels avec le poisson homozygote U-A-S-M-R-F-P le lendemain. Placez les poissons F1 qui ont donné des embryons dans des bassins statiques individuels pendant que les embryons sont collectés pour le dépistage un jour après la fécondation.

Il se peut que l’étiquetage RFP n’ait pas encore été publié, alors dépister les embryons pour la fluorescence GFP et retirer les embryons positifs à la GFP trois jours après la fécondation, dépister la fluorescence GFP et RFP et extraire les doubles positifs. Ensuite, photographiez les embryons positifs pour la GFP et la RFP cinq jours après la fécondation, des lots de congélation de 20 embryons G-F-P-R-F-P positifs et 20 G-F-P-R-F-P négatifs pour l’identification des gènes mutés d’insertion par PCR inverse et cinq races principales. Élevez les embryons G-F-P-R-F-P positifs restants pour établir la génération F deux lors d’une injection réussie.

Au moins 80 % des embryons injectés avec le mélange d’ARNm de deux transposes d’ADN piège à gènes présenteront un certain degré de fluorescence GFP. Une faible expression de la GFP indique soit l’échec de l’injection, soit la dégradation de l’ARN transposé en raison de la contamination par les ARN. Lorsque les embryons positifs à la GFP les plus brillants sont sélectionnés pour établir le pool F zéro, environ un poisson F zéro sur 10 sélectionné produira une descendance de piège à gènes parmi les poissons F zéro à partir desquels les événements de piège à gènes sont récupérés.

La plupart transmettent un seul événement de piège génique en plus de plusieurs transposes non exprimant sur les intégrations. Étant donné que l’ensemble de la cassette de pièges à gènes est flanquée de verrous directs P sites, toute mutation de piège à gènes illustrée dans ce schéma avec des cases bleues représentant les exons du gène muté est réversible par l’expression des rayons CRE. Ces images montrent la co-expression de la GFP et de la RFP dans le système nerveux de la lignée de piège à six gènes NSF TP L’injection d’ARN Cree dans les embryons N SF TP six entraîne une perte d’expression de la GFP et de la RFP.

Notez qu’il n’y a pas de réduction de l’expression de la GFP dans le cristallin comme prévu. La plupart des procédures décrites ici sont applicables à d’autres criblages de pièges à gènes ainsi qu’à des expériences de transgenèse régulières avec TOL deux et d’autres transposons avec la procédure de piège à gènes décrite ici. La mise en place de 20 à 30 croisements de zéro F par semaine devrait entraîner la récupération d’un piège à gènes par semaine.

Cependant, la procédure peut facilement être étendue.