Name: Gene piégeage utilisant Gal4 chez le poisson zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 34 s
Description: Découvrez la mutagénèse par piégeage de gènes chez le poisson zèbre utilisant Gal4-VP16 comme rapporteur principal. Cette méthode permet de générer des mutants pour l'analyse fonctionnelle des gènes avec un criblage efficace.

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Nous remercions le Dr Jennifer Emtage pour la lecture critique du manuscrit, Ryan Gill pour l&#39;assistance technique et aide pour les soins du poisson zèbre et le Dr Stephen C. Ekker (Mayo Clinic, Rochster, Minnesota) pour les réactifs. Notre travail a été soutenu par l&#39;University College Temple de la science et de la technologie et le National Institutes of Health (R01-HD061749).

Une. La production de la génération F0 par microinjection du piège de Gene. Nous avons trouvé que les embryons de différentes origines génétiques présentent des tolérances différentes à cette procédure, de type sauvage à base de PET magasin et Tübingen - Long Fin (TLF) étant les plus tolérants alors que les souches AB et Tübingen ont une survie plus faible. <ol><li> Préparation de l&#39;ADN du transposon. Préparer GBT-B1 (pDB783, Balčiūnienė et al. Dans la préparation) ADN plasmidique en utilisant le kit QIAprep miniprep standard (Qiagen 27106). Il est essentiel de comprendre l&#39;étape de lavage de PB (qui est facultative dans la procédure QIAprep), sinon l&#39;ADN miniprep sera contaminé par la RNase A, qui conduit à la dégradation de l&#39;ARNm de la transposase. Avant l&#39;injection, diluer l&#39;ADN dans l&#39;eau sans RNase (Ambion AM9937) à 10 ng / ul. </li><li> Préparation de l&#39;ARNm de transposase. Linéariser pT3TS/Tol2 (pDB600) 13 en utilisant XbaI et transcrire l&#39;ADN linéarisé en utilisant une machine T3 mMessage(Ambion AM1348) dans le kit de transcription in vitro. Nous avons modifié la réaction de transcription in vitro en ajoutant 0,5 pi d&#39;inhibiteur RiboLock RNase (ThermoFisher Fermentas EO0381). Après l&#39;étape de traitement à la DNase, de purifier l&#39;ARNm en utilisant un kit RNeasy MinElute (Qiagen 74204). Évaluer la qualité de l&#39;vitro de l&#39;ARNm transcrit par électrophorèse en gel d&#39;agarose. Diluer l&#39;ARNm dans l&#39;eau sans RNase à 40 ng / ul, et stocker que 2 aliquotes à -80 ° C. </li><li> Préparation du mélange de micro-injection. Avant l&#39;injection, ajouter 8 pi d&#39;ADN de transposon diluée à une partie aliquote de 2 pl de la transposase de l&#39;ARNm. </li><li> La micro-injection. Injecter 3 nl de mélange ADN / ARN dans le jaune de 1 embryons de poisson zèbre de cellulaire en utilisant des techniques de micro-injection standards, visant pour l&#39;interface jaune / blastomère. Recueillir des embryons toutes les 20 minutes pour assurer une injection à une étape de la cellule. Dans notre expérience, une personne habile peut facilement injecter 1.000 embryons en 1-1,5 heures. </li><li> Après l&#39;injection, course 5 pi de gaucheau-dessus de la solution d&#39;injection sur un gel d&#39;agarose à 1% pour le contrôle de la qualité, de sorte que l&#39;ARNm de transposase n&#39;a pas été dégradé. </li><li> Injection soins de l&#39;embryon. En fin d&#39;après midi, enlever les embryons non fécondés et les embryons anormaux et distribuer à 60-80 pour 100 mm boîte de Petri. Embryons anormaux et mortes sont éliminées après la fécondation à 1 jour (DPF), 2 dpf et 3 dpf. </li><li> Criblage pour l&#39;expression de la GFP. embryons d&#39;écran sans défauts manifestes pour fluorescence de la GFP à 3 dpf (Figure 3). Le criblage peut être effectué soit sur un stéréomicroscope équipé d&#39;une fluorescence (nous utilisons un SMZ1500 Nikon) ou sur un microscope droit (nous utilisons un AxioImager Zeiss avec un objectif 5X Fluar). Faible expression de la GFP indique soit injection infructueuse ou de la dégradation de l&#39;ARN de la transposase due à une contamination de RNase (figure 3A). Sélectionner environ 30% des embryons les plus brillants qui soit sont l&#39;expression de GFP dans de nombreux tissus ou dans un fort pourcentage de cellules d&#39;un tissu particulier (F comparerFIGURES 3B et 3C). D&#39;une injection de 1000 embryons, on a généralement jusqu&#39;à 100 haut-exprimant la GFP embryons au stade de développement normales,. </li><li> Levez embryons F0 sélectionnés à l&#39;aide des procédures d&#39;élevage de poisson zèbre standard. Il est raisonnable de s&#39;attendre à ce que 20-30% des embryons injectés sélectionnés pour l&#39;élevage va survivre à l&#39;âge adulte. </li></ol> 2. Maintien de la SAMU: mRFP Tester ligne. Nous avons généré une 14xUAS: ligne mRFP marquée par γCry spécifique objectif: GFP. Depuis SAMU est soumis à du silence par méthylation de l&#39;ADN, il est important de choisir des poissons avec de faibles niveaux de silence à propager le stock. <ol><li> Mettre en place SAMU individu: homozygotes rapport de la direction pour l&#39;accouplement avec l&#39;un de nos lignes de piégeage de gène Gal4 plus fiables, tpl6 NSF (Balčiūnienė et al en préparation.). </li><li> Le lendemain, le transfert des UAS: poissons mRFP qui ont donné des embryons de réservoirs statiques individuels, tandis que les embryons sont collectéset nettoyé. </li><li> embryons d&#39;écran pour la GFP et la fluorescence de la DP à 1 dpf et 3 dpf. </li><li> Poissons Intercross qui a donné des embryons avec l&#39;expression élevée mRFP pour établir la prochaine génération de la SAMU: ligne mRFP. </li></ol> 3. Projection du poisson F0. <ol><li> Traverser F0 individu avec le SAMU homozygote: poissons mRFP (Figure 4). Nous injectons habituellement nos GBTS en lignes avec des motifs de type sauvage ou léopard pigmentation, et nos SAMU homozygotes: ligne mRFP est en laiton fond. Par conséquent poisson F0 GBT-injecté peut être facilement distingués des SAMU: poissons mRFP, éliminant la nécessité d&#39;enregistrer si la F0 le dépistage était un mâle ou une femelle, ainsi que les erreurs potentielles résultant des erreurs dans l&#39;enregistrement et / ou de déterminer le sexe de chaque poisson. Personnel ayant une expérience très limitée, ces étudiants de premier cycle nous, sont donc en mesure de mettre en place et de briser les accouplements de poissons. Cette approche présente un inconvénient que deux fonds génétiques différents sontutilisé, potentiellement compliquer l&#39;interprétation de la perte de phénotypes de fonction. </li><li> Le lendemain, retournez les SAMU en laiton: poissons mRFP de leur réservoir. Placer le poisson de F0 qui a donné des embryons dans des réservoirs statiques individuels (nous utilisons Hagen Exo Terra Faunarium Petit, mais tout petit réservoir peut être utilisé à cette fin), tandis que les embryons sont collectés et examinés. </li><li> Embryons propres et transfert recueillies dans de nouvelles boîtes de Pétri (&lt;100 par boîte) dans l&#39;après-midi du jour 0. </li><li> embryons d&#39;écran pour la GFP et la fluorescence de la DP à 1 dpf, 2 dpf et 3 dpf. Tirez embryons positifs à la fois pour la GFP et RFP sur, les trier par GFP / motif d&#39;expression DP (si plus d&#39;un modèle est observé dans un embrayage) et de les élever à établir génération F1. </li><li> Euthanasier les poissons de F0 qui ne produit que des embryons négatifs (sur un nombre total de 50-100 embryons). </li><li> Traversez le poisson F0 qui a produit de nouveau GFP / RFP positif progéniture pour obtenir un deuxième lot de points positifs. </li></ol> 4.Projection du poisson F1. Le poisson de F1 sont criblés d&#39;établir familles F2, pour documenter modèle d&#39;expression de piégeage de gènes et de geler des lots d&#39;embryons pour l&#39;identification moléculaire de piégeage de gènes loci par 5 &#39;RACE et PCR inverse. <ol><li> Traverser poissons F1 individu avec le SAMU homozygote: poissons mRFP (Figure 4). </li><li> Le lendemain, placez le poisson de F1 qui a donné des embryons dans des réservoirs statiques individuels alors que les embryons sont collectés et examinés. </li><li> embryons d&#39;écran pour la GFP et la fluorescence de la DP à 1 dpf, 2 dpf et 3 dpf. Embryons distincts et photographie positifs à la fois pour la GFP et RFP 24. </li><li> À 5 dpf, geler des lots de 20 GFP / DP-positif et 20 GFP / embryons de la DP-négatif pour l&#39;identification de gènes mutés par insertion par PCR inverse et 5 &#39;RACE 9,10. Levez restants GFP / embryons de la DP-positif d&#39;établir génération F2. </li></ol>

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</ol>

Ces auteurs n&#39;ont rien à révéler.

Les vecteurs de pièges de gène et de la méthodologie décrits ici sont déjà utilisés dans plusieurs laboratoires indépendants. Dans notre expérience, il ya deux étapes importantes dans le processus. La première étape critique est d&#39;atteindre des taux élevés d&#39;intégration de piégeage de gènes dans des embryons de F0 injectés. L&#39;échec de cette étape peut souvent être attribuée à la contamination des réactifs RNase d&#39;injection, en particulier l&#39;ADN miniprep. Il est également très important d&#39;injecter des embryons au stade 1 cellule pour des expériences de piégeage de gènes. Dans notre expérience, la transgénèse Tol2 médiation est très efficace, ce qui permet d&#39;obtenir des lignées transgéniques, même lors de l&#39;injection plus tard au stade 1 cellule ou avec de l&#39;ADN de qualité inférieure. Injections normes sont beaucoup plus problématique dans l&#39;exercice de piégeage de gènes mutagenèse, puisque seule une petite fraction des intégrations vecteur résultat des événements efficaces de piégeage de gène. La deuxième étape critique est de savoir intercepter les événements de gènes par croisement à notre SAMU: ligne mRFP. Absence d&#39;expression est mRFPpresque toujours le signe d&#39;un événement activateur de piège. Cependant, parfois, le manque d&#39;expression mRFP peut indiquer silence des 14x SAMU. Il est donc important de maintenir la SAMU: ligne mRFP dans un état ​​non-réduit au silence par la propagation de la prochaine génération utilisant des individus avec une expression élevée de DP quand on les croise à tpl6 NSF. Nous pouvons prévoir de faire plusieurs améliorations à nos vecteurs de pièges de gène et le protocole. La première consiste à utiliser un UAS moins répétitif dans la construction de piégeage de gènes. Il a été montré qu&#39;une 5x UAS est suffisante pour obtenir une activation complète dans des expériences de culture de cellules, et que les séquences UAS moins répétitives sont moins sensibles à la méthylation et 6,25 taire. Il peut également être possible de concevoir des gènes vecteurs de pièges pour la mutagenèse conditionnelle entièrement, par analogie avec les vecteurs utilisés par le piège à souris du gène consortium international et récemment adaptées pour le poisson zèbre 2,26,27. Une autre amélioration serait d&#39;utiliser un autre tsystème ransposon, par exemple Sleeping Beauty 28, pour générer un UAS: mRFP ligne de journaliste. Cela permettrait injection de pièges de gènes à base de Tol2 directement dans la ligne de journaliste et de dépistage de F0s par incrossing. En outre, ce serait d&#39;éliminer l&#39;utilisation de deux fonds génétiques différents, ce qui rend l&#39;interprétation de la perte de phénotypes de fonction plus simple. Même avec ces améliorations, la Gal4 protocole général de piégeage de gènes présenté ici serait encore pleinement applicable.

La mutagenèse par insertion s&#39;est avérée être une approche puissante pour disséquer la fonction des gènes dans différents systèmes modèles à partir d&#39;organismes unicellulaires tels que des bactéries et des levures à des organismes multicellulaires tels que les souris et les plantes. De préférence de l&#39;ADN exogène (virus, plasmide ou transposon) peut servir comme un agent mutagène en interrompant éléments essentiels de gènes tels que des promoteurs ou des exons. La cible effective de ces approches simples est extrêmement faible dans de grands génomes complexes, étant donné que les exons comprennent seulement 1-3% d&#39;un génome de vertébré typique. Petite taille cible efficace peut être surmontée par des taux d&#39;intégration très élevé de vecteur, comme en témoigne l&#39;énorme succès de la mutagenèse par insertion rétrovirale chez le poisson zèbre 11,12. En revanche, les introns comprennent environ 20 à 30% des génomes de vertébrés. Chez le poisson zèbre, d&#39;insertion des vecteurs de mutagenèse à base de transposons qui introduisent effectivement nulle ou mutations hypomorphic graves sur l&#39;intégration dans les introns ont été nommés &quot;transposo de gène de rupturens &quot;(GBTS) 8-10. Pour une intégration efficace de piégeage de gènes, ils utilisent un Tol2 transposon minimale 13,14. Mutagénicité de GBTS repose sur les poissons dérivé accepteur d&#39;épissage et de la transcription des séquences terminaison / polyadénylation. Les éléments responsables de GBT mutagène sont flanqués par des sites loxP directes pour l&#39;excision par la recombinase Cre. Ainsi, l&#39;injection de Cre ARNm conduit à la réversion efficace des mutations induites par GBT, bien que certaines séquences de transposon restent au niveau du locus d&#39;intégration 9,10. Les vecteurs GBT récemment publiés utilisent mRFP comme le piège de gène rapporteur 9,10, conduisant à deux inconvénients potentiels. Tout d&#39;abord, on ne sait pas quelle fraction de gènes de poisson zèbre sont exprimés à un niveau suffisamment élevé pour être détecté par des protéines de fusion fluorescentes journaliste directs. Deuxièmement, seul un petit sous-ensemble de gènes devraient avoir des fonctions essentielles. Il a été estimé qu&#39;il n&#39;y a que 1,400-2,400 gènes nécessaires pour dével poisson zèbrent 15,16. La plupart des mutants de piège à gènes ne devraient pas afficher les phénotypes visibles et auront donc une utilité limitée. Pour surmonter ces deux limitations, nous avons modifié GBT-R15 9,10 à utiliser avec Gal4-VP16 comme le principal journaliste de piégeage de gènes (Balčiūnienė et al. Dans la préparation). Comme avec AUG-mRFP moins dans GBT-R15, le site d&#39;initiation de la traduction a été retiré de Gal4-VP16. Pour la détection directe des événements de piège à gènes, nos vecteurs contiennent un rapporteur de l&#39;EGFP sous le contrôle de 14x Gal4 SAMU 17,18. Plusieurs fonctionnalités supplémentaires sont conçus dans notre vecteur de piégeage de gènes bipartite. Les SAMU: cassette eGFP est flanqué par des sites FRT directs (des chevrons gris sur la figure 1). Injection de recombinase Flp ARNm conduit à l&#39;excision de l&#39;UAS: Cassette eGFP, laissant la mutation de piégeage de gènes pas marquées par fluorescence eGFP. Il peut ensuite être utilisé dans des lignées transgéniques qui marquent des tissus spécifiques ou à des événements de développement par fluorescence de la GFP. Comme dans les autresGBTS, toute la cassette de piège à gène est flanqué par des sites loxP directs (pentagones ouvertes dans la figure 1). Cela rend les événements de piège à gènes réversibles par l&#39;expression de la recombinase Cre, facilement établir la preuve de la relation de causalité entre une intégration spécifique de piégeage de gènes et observé phénotype (Figure 2). Enfin, la cassette de piège à gène est flanqué par des sites inversées méganucléase I-Scel (triangles noirs sur la figure 1). Chez la drosophile, les intégrations de transposons sont souvent convertis en suppressions (lacunes) par excision imprécise de l&#39;élément de P. Il n&#39;existe aucune preuve que l&#39;excision du transposon Tol2 (ou tout autre transposon actif chez les vertébrés tels que Sleeping Beauty, PiggyBac ou Ac / Ds) peut conduire à des suppressions. Nous avons donc inclus sites I-Scel comme une méthode de substitution potentiel pour l&#39;induction de suppressions, même si rien ne prouve que I-Scel peut induire des délétions chez le poisson zèbre. Il convient de noter que, bien que I-Scel méganucléase peut être utilisé pour faciliter la transgénèse chez le poisson zèbre, clivage de l&#39;ADN par méganucléase I-Scel est utilisée pour étudier les mécanismes de réparation d&#39;ADN, y compris les erreurs fin non homologue rejoindre, dans la levure et les cellules de mammifères 19-22. Intégration de notre vecteur de piégeage de gène peut conduire à l&#39;expression eGFP par deux mécanismes différents. Le premier est un véritable événement de piégeage de gènes (figure 1C): le vecteur s&#39;intègre dans un gène (IMG pour par insertion gène mutant), un transcrit de fusion entre la 5 &#39;de la transcription endogène IMG et le Gal4-VP16 est faite et traduits en un protéine de fusion contenant la terminaison N de la protéine codée par IMG et Gal4-VP16. Cette protéine de fusion se lie à l&#39;UAS 14x et active la transcription de eGFP. Le second cas, moins souhaitable est un piège d&#39;activateur (figure 1D): le promoteur minimal devant eGFP tombe sous le contrôle d&#39;un amplificateur à proximité du site d&#39;intégration, ce qui conduit à la production de eGFP dans la absence de production Gal4-VP16. Dans notre estimation, 30-50% des événements d&#39;expression eGFP sont dus à un piège à un amplificateur et 50-70% sont dus à un piège de gène 23 (Balčiūnienė et al. Dans la préparation). Pour faire la distinction entre ces deux catégories d&#39;événements, nous avons fait un 14xUAS: mRFP lignée transgénique (figure 1B), pour plus de commodité marquée par spécifiques lentille γCry: (. Balčiūnienė et al en préparation) GFP. Gene événements d&#39;interruption sont contrôlés par la co-expression de GFP et RFP (comparer C et D sur la figure 2). Dans l&#39;écran de pilote, nous avons récupéré plus de 40 événements de piège à gènes après criblage 270 F0 poissons injectés avec un mélange d&#39;ADN de transposon et la transposase ARNm. Deux de nos intégrations de piège à gènes ont eu lieu dans des gènes avec déjà publiés mutants chimiquement induites: NSF et ét. Les phénotypes de notre mutants d&#39;insertion tpl6 NSF et ét tpl24 sont superficiellement impossible de distinguer le phénotypes des mutants chimiquement induites correspondantes. Nous avons également remarqué que les événements de piège à gènes semblent biaisées vers les introns près de l&#39;extrémité 5 &#39;des gènes, augmentant ainsi la probabilité d&#39;allèles nuls. Nous faisons observer un certain degré de SAMU silence (panaché) dans l&#39;ensemble de nos lignes de piégeage de gène, et certains lieux sont nettement plus sensibles à la bigarrure que d&#39;autres. Nous ne croyons pas que la SAMU silence est un problème important pour la propagation de lignes de piégeage de gène, comme nous l&#39;avons été en mesure de se propager facilement l&#39;ensemble de nos lignes de piégeage de gène par au moins cinq générations par la sélection pour l&#39;expression de la GFP seule.

<table><tbody><tr><td>Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>En option L’étape de lavage PB est indispensable</td></tr><tr><td>Enzyme de restriction XbaI</td><td>ThermoFisher</td><td>ER0681</td><td></td></tr><tr><td>mMessage Machine T3</td><td>Ambion</td><td>AM1348</td><td></td></tr><tr><td>RiboLock RNase</td><td>Inhibitor ThermoFisher</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td>Peut être remplacé par extraction phénolique et précipitation. N’utilisez pas LiCl !</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td>Doit être traitée sans DEPC</td></tr><tr><td>Capiliaires en verre borosilicaté pour aiguilles de micro-injection</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microcapiliaires pour étalonnage</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-0010</td><td></td></tr><tr><td>Embouts de microchargeur</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur d’aiguille *</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope pour la micro-injection * </td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td>Nous utilisons également Wild 5M et Olympus SZ61 avec support à lumière transmise</td></tr><tr><td>Picoinjecteur *</td><td>Harvard Instruments</td><td>Pli-90</td> Nous utilisons également le microscope de dépistage <td>Pli-100</td></tr><tr><td>avec fluorescence GFP / RFP *</td><td>L’objectif</td><td>Zeiss Zeiss AxioImager</td><td>5X Fluar a une distance</td></tr> <tr><td>de travail suffisanteMicroscope de dépistage avec fluorescence GFP/RFP *</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Nous suggérons cet équipement uniquement parce que nous l’utilisons avec succès dans notre laboratoire. Dans chaque catégorie, plusieurs options comparables de plusieurs fabricants sont disponibles.</td></tr></tbody></table>

gene piégeage utilisant gal4 chez le poisson zèbre

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Grande taille de l&#39;embrayage et du développement externe d&#39;embryons de poisson zèbre optiquement transparents font un système de modèle vertébré exceptionnelle pour la mutagenèse par insertion in vivo en utilisant journalistes fluorescents pour marquer l&#39;expression de gènes mutés. Plusieurs laboratoires ont construit et testé des vecteurs d&#39;amplificateur et de piégeage de gènes chez le poisson zèbre, en utilisant des protéines fluorescentes, des activateurs de la transcription à base de lexA Gal4 et que les journalistes 1-7. Ces vecteurs ont deux inconvénients potentiels: rigueur optimale (par exemple, le manque de capacité de se différencier entre les événements d&#39;amplificateur et de piégeage de gènes) et une faible mutagénicité (par exemple, les intégrations dans des gènes rarement produites allèles nuls). Gene rupture transposon (GBTS) ont été développés pour répondre à ces inconvénients 8-10. Nous avons modifié l&#39;un des premiers vecteurs GBT, GBT-R15, pour une utilisation avec Gal4-VP16 comme le principal journaliste de piégeage de gènes et SAMU ajoutés: eGFP comme le journaliste secondaire pour la détection directe des événements de piège à gènes. Application de Gal4-VP16 comme le principal journaliste de piégeage de gènes offre deux avantages principaux. En premier lieu, il augmente la sensibilité de gènes exprimés à de faibles niveaux d&#39;expression. Deuxièmement, il permet aux chercheurs d&#39;utiliser des lignes de piégeage de gènes que les pilotes Gal4 à l&#39;expression directe d&#39;autres transgènes dans les tissus très spécifiques. Cela est particulièrement pertinent pour les gènes ayant des fonctions non essentielles ou redondants, où l&#39;intégration de piégeage de gènes peut pas donner lieu à des phénotypes manifestes. L&#39;inconvénient d&#39;utiliser Gal4-VP16 comme le primaire reporter de piégeage de gènes est que les gènes codant pour des protéines avec des séquences signal N-terminales ne se prêtent pas à la trappe, comme les protéines de fusion Gal4-VP16 qui en résultent sont peu susceptibles d&#39;être en mesure de pénétrer dans le noyau et activent transcription. Fait important, l&#39;utilisation de Gal4-VP16 ne pas pré-sélectionner pour des protéines nucléaires: nous avons récupéré mutations de piégeage de gènes dans des gènes codant pour des protéines qui fonctionnent dans le noyau, le cytoplasme et la membrane plasmique.

Dans une injection réussie, au moins 80% des embryons injectés avec le piège de gène d&#39;ADN / ARNm transposase Tol2 mélange afficher un certain degré de fluorescence de la GFP (Figure 3). Lorsque les brillants GFP-positives embryons (figure 3C) sont sélectionnés pour établir la piscine de F0, environ un sur 10 blindé poisson F0 cédera gène piège progéniture. Parmi les poissons de F0 à partir de laquelle des événements de piégeage de gènes sont récupérées, plus transmettre un seul événement de piégeage de gènes en plus de plusieurs intégrations de transposon non-exprimant. Cependant, nous avons mis en place jusqu&#39;à quatre lignes de piégeage de gène d&#39;un seul individu F0. Profils d&#39;expression GFP / DP dans les lignes de piégeage de gènes vont de très spécifique du tissu (par exemple en bulbes olfactifs) à assez omniprésent. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig1.jpg" /> Figure 1. Til GAL4 contenant le vecteur de piégeage de gènes bipartite GBT-B1 et ses applications. A. Composantes du vecteur de piégeage de gènes Gal4 contenant: Tol2 5 &#39;et Tol2 3&#39;, minimal Tol2 transposon se termine 13; cSA, Carp β-actine accepteur d&#39;épissage 8; ^ Gal4-VP16, AUG-moins Gal4-VP16; zp ( A), β-actine UTR et poly poisson zèbre 3 &#39;(A) des éléments de GBT-R15 9,10. 14XUAS, eGFP et SV40 p (A) sont des composants de la SAMU: eGFP cassette d&#39;expression 17,18. La flèche indique l&#39;activation de la SAMU: eGFP par Gal4-VP16 produit par le piège de gène B. Le 14XUAS:. MRFP transgène marquée par une γCry spécifique-objectif: la cassette GFP. La flèche indique l&#39;activation de la SAMU: mRFP par Gal4-VP16 en trans événement piège C. Gene.. Boîtes bleues sont exons. Épissage est indiquée par la ligne en pointillés. Événement de piège D. Enhancer. L&#39;intégration du vecteur à proximité d&#39;un activateur (boîte marron) peut placer le promoteur de eGFP minimale sous le contrôle de cet amplificateur (flèche marron). Cela se traduirait par une expression tissu-spécifique de la EGFP, mais étant donné que Gal4-VP16 n&#39;est pas fait, l&#39;expression mRFP ne serait pas activé. <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig2.jpg" /> Figure 2. Réversion des événements de piégeage de gène en utilisant la recombinase Cre. A, B. Schéma d&#39;une mutation de piégeage de gènes (A) et la Cre-revenue allèle de piégeage de gènes (B). C, D. Co-expression de GFP (C) et DP (D) dans le système nerveux du gène tpl6 nsf ligne de piège. E, F. Injection de Cre ARN dans des embryons de tpl6 NSF conduit à la perte de la GFP (E) et DP (F) l&#39;expression. Notez qu&#39;il n&#39;y a pas de réduction de l&#39;expression de GFP dans le verre, comme prévu. Figure 3. Embryons injectés avec le GBT-B1 (pDB783) piège de gène. . A. Les embryons injectés avec pGBT-B1 (pDB783) d&#39;affichage seuls peu de fluorescence de la GFP dans le corps B, C. Les embryons injectés avec pGBT-B1 et Tol2 transposase ARNm: un groupe aléatoire de l&#39;embryon (B) et le haut-expresseurs sélectionnés pour l&#39;élevage (C). <img alt="Figure 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50113/50113fig4.jpg" /> Figure 4. Plan expérimental pour l&#39;établissement de Gal4 lignes de piégeage de gène. Structures rouges / vert qui se chevauchent partiellement indiquent co-expression de la GFP et DP, tandis que le vert indique seule mosaïque pour piéger de gène ou un amplificateur piège événements.

Ce protocole décrit la méthode de piégeage de gènes mutagenèse insertionnelle utilisant Gal4-VP16 comme le journaliste primaire et GFP / DP en tant que reporters secondaires chez le poisson zèbre. Environ une personne sur dix co-exprimant haut exprimant F0 gène de rendement de piège à poissons progéniture GFP et DP. La procédure de criblage peut être facilement mis à l&#39;échelle pour s&#39;adapter à la taille du laboratoire effectuant l&#39;écran de mutagenèse insertionnelle.

Gene piégeage utilisant Gal4 chez le poisson zèbre

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...

L'objectif général de cette procédure est de produire des poissons mutants en utilisant un transposon perturbateur de gènes sur des vecteurs comportant GAL quatre, VP 16 comme rapporteur principal de piégeage génique. Ceci est réalisé en co-injectant d'abord le vecteur de piégeage génique ainsi que le transposase Tall deux dans des embryons de poisson zèbre. Les embryons injectés sont criblés pour détecter la fluorescence GFP trois jours après la fécondation, et environ 30 % des embryons les plus fluorescents sont sélectionnés pour constituer le lot F zéro.Ensuite, les poissons F zéro sont croisés avec la lignée témoin U-A-S-M-R-F-P afin de sélectionner la transmission germinale des événements de piégeage génique. L'étape finale consiste à effectuer un croisement extérieur des F1 pour établir la génération F deux et produire des embryons destinés à la caractérisation moléculaire des événements de piégeage génique par PCR inverse et RACE en cinq prime. En fin de compte, environ un poisson F zéro sur dix analysés devrait produire une descendance présentant un piégeage génique.Les transposons briseurs de gènes ont été conçus pour ne produire aucune mutation lors de leur intégration au niveau des entrées des gènes codant pour des protéines. Nos vecteurs GBT utilisent G four P 16 comme rapporteur principal de piégeage génique. Cette modification augmente la sensibilité pour les gènes exprimés à des niveaux faibles et nous permet d'utiliser les mutants de piégeage génique sans phénomènes de sur-évitement des phénotypes, en tant que moteurs G four pour l'expression tissu-spécifique d'autres transgènes.Nous pensons que le principal goulot d'étranglement de notre méthode réside dans l'obtention de taux suffisamment élevés d'intégration du piège à gènes dans la lignée germinale des poissons F zéro. Dans cette démonstration, nous aborderons plusieurs étapes critiques : la préparation de l'ADN, la microinjection et le criblage des F zéro. Le vecteur de piège à gènes GBTB1 utilise GAL4-VP16 comme rapporteur principal du piège à gènes.Des vecteurs courts minimaux à deux transposons orientés vers les extrémités sont utilisés pour l'insertion par piégeage génique. Les événements de piégeage génique sont détectés directement par un rapporteur EGFP sous le contrôle de 14 X GAL quatre UAS. L'ensemble du cassette de piégeage génique est encadré par des sites P directs.Cela rend les événements de piégeage génique réversibles par l'expression de Cree combs, permettant ainsi de démontrer un lien de causalité entre une intégration spécifique de transposon et un phénotype observé. En outre, la cassette U-A-S-E-G-F-P est encadrée par des sites FRT directs. L'injection d'ARNm de flip combs entraînera l'excision de la cassette U-A-S-E-G-F-P, laissant la mutation de piégeage génique non marquée par la fluorescence de EGFP et permettant son utilisation dans des lignées transgéniques qui marquent des tissus ou des événements développementaux spécifiques par fluorescence de GFP avant la micro-injection.Préparez le transposon sur l'ADN et les ARNm transposés. Préparez le vecteur d'insertion génique GBTB en ADN. En utilisant un kit de minipréparation standard et en suivant le protocole du fabricant, il est essentiel d'inclure l'étape de lavage PB lors de la préparation de l'ADN.Sinon, l'ADN de la mini-préparation sera contaminé par les ARN, ce qui entraînera la dégradation des ARN messagers transposés. Diluez l'ADN dans de l'eau exempte d'ARN à raison de 10 nanogrammes par microlitre. Pour préparer les deux ARN messagers transposés, commencez par linéariser le PT3TST2 à l'aide de XboI. Ensuite, transcrivez l'ADN linéarisé à l'aide d'un kit de transcription in vitro M Message Machine T3, avec une modification.Ajouter 0,5 microlitre d'inhibiteur d'ARN rib lock après l'étape de purification de l'ADN, puis purifier l'ARNm à l'aide d'un kit standard et évaluer la qualité de l'ARNm transcrit in vitro par électrophorèse sur gel d'agarose. Diluer l'ARNm dans de l'eau exempte d'ARNases à une concentration de 40 nanogrammes par microlitre et conserver en aliquots de deux microlitres à −80 degrés Celsius juste avant l'injection micro-injectée. Préparer le mélange d'injection en ajoutant huit microlitres d'ADN transpose dilué à un aliquot de deux microlitres d'ARNm transpose.Injecter trois nanolitres de mélange ADN-ARN dans le jaune d'œufs d'embryons de poisson zèbre à une cellule en utilisant des techniques standards de microinjection, en visant l'interface entre le jaune et l'embryon. Après l'injection, analyser cinq microlitres de la solution restante sur un gel d'agarose à 1 % pour le contrôle qualité, afin de s'assurer que l'ARN messager transcrit n'a pas été dégradé. Environ six à huit heures après l'injection, éliminer les embryons non fécondés et morts, puis répartir les embryons à raison de 60 à 80 par boîte de Pétri de 100 millimètres. Retirer les embryons anormaux et morts un jour, deux jours et trois jours après la fécondation, et ce, trois jours après la fécondation, sous un microscope stéréo équipé de fluorescence ou un microscope droit.Examinez les embryons et retirez tous les embryons anormaux. Examinez les embryons restants ne présentant pas de défauts évidents. Pour la fluorescence GFP, sélectionnez les embryons F zéro les plus fluorescents et élevez-les selon les procédures standard d'élevage de zebrafish dans ce laboratoire.Les GBT sont généralement injectés dans des lignées présentant des motifs de pigmentation de type sauvage ou léopard. Il est raisonnable de s'attendre à ce que de 20 à 30 % des embryons injectés et sélectionnés pour être élevés survivent jusqu'à l'âge adulte. L'intégration du vecteur de piégeage génique GBTB peut conduire à l'expression d'EGFP par deux mécanismes différents.Le premier correspond à un événement réel de piégeage génique. Le vecteur s'insère dans un gène, produisant une fusion entre l'extrémité 5' du transcrit de ce gène endogène et le GAL quatre VP 16, qui est ensuite traduit en une protéine de fusion contenant l'extrémité C-terminale de la protéine, recouverte par le gène muté inséré ainsi que le GAL quatre, VP 16. Cette protéine de fusion se lie à la séquence 14 XUAS et active la transcription de l'EGFP.Le deuxième événement, moins souhaitable, est un piège à enhanceurs. Le promoteur minimal situé en amont d'EGFP passe sous le contrôle d'un enhanceur voisin du site d'intégration, entraînant la production d'EGFP en l'absence de GAL quatre, VP 16. Pour distinguer entre ces deux types d'événements, une lignée transgénique 14 X-U-A-S-M-R-F-P marquée par un GFP spécifique du cristallin gamma du cristallinien a été créée.Les événements de piégeage génique sont vérifiés en croisant des poissons injectés avec GBT et des poissons homozygotes U-A-S-M-R-F-P, puis en recherchant une co-expression de GFP et de RFP, ce qui n'est possible que si GAL quatre et VP 16 sont produits et activent U-A-S-M-R-F-P en trans. Le protocole de dépistage des poissons F zéro consiste à croiser individuellement chaque poisson F zéro avec des poissons homozygotes U-A-S-M-R-F-P. Étant donné que les poissons injectés avec GBT présentent un phénotype pigmentaire sauvage ou léopard, tandis que la lignée homozygote U-A-S-M-R-F-P possède un fond brass, les poissons F zéro peuvent être facilement distingués des poissons U-A-S-M-R-F-P, ce qui élimine la nécessité d'enregistrer si le poisson F zéro dépisté était mâle ou femelle, ainsi que les erreurs potentielles découlant d'erreurs d'enregistrement ou de détermination du sexe de chaque poisson. Le lendemain.Replacer les poissons U-A-S-M-R-F-P en laiton dans leur aquarium. Placer les poissons F zéro ayant produit des embryons dans des aquariums individuels statiques pendant que les embryons sont collectés pour le dépistage, puis transférer les embryons collectés dans de nouvelles boîtes de Pétri l'après-midi du jour zéro. Analyser les embryons pour la fluorescence GFP et RFP un jour après la fécondation et trois jours après la fécondation.Extraire les embryons positifs pour GFP et RFP, puis les trier selon leur profil d'expression G-F-P-R-F-P. Si plus d'un profil est observé dans une ponte, les élever pour établir la génération F1. Noter que les embryons PF 3D positifs pour GFP mais négatifs pour RFP ne sont pas extraits, car ils représentent des événements de piégeage d'enhancer.Croisez à nouveau les poissons F0 ayant produit une descendance positive pour G-F-P-R-F-P afin d'obtenir un second lot de positifs. Les poissons F1 sont triés afin d'établir des lignées F2, documenter le profil d'expression du gène piégé et congeler des lots d'embryons pour l'identification moléculaire des sites de piégeage génique. Effectuez d'abord un croisement entre des poissons F1 individuels et des poissons U-A-S-M-R-F-P homozygotes le jour suivant. Placez les poissons F1 ayant produit des embryons dans des aquariums statiques individuels, tandis que les embryons sont collectés pour être triés à un jour post-fécondation.L'étiquetage RFP peut ne pas encore être apparu ; examinez donc les embryons à la recherche de la fluorescence GFP et isolez les embryons positifs pour GFP trois jours après la fécondation, puis effectuez un dépistage pour les fluorescences GFP et RFP et retirez les embryons doublement positifs. Photographiez ensuite les embryons positifs pour les deux fluorescences GFP et RFP cinq jours après la fécondation. Congelez des lots de 20 embryons positifs G-F-P-R-F-P et de 20 embryons négatifs G-F-P-R-F-P en vue de l'identification des gènes mutés par insertion à l'aide de la PCR inverse et de la technique 5' RACE. Élevez les embryons restants positifs G-F-P-R-F-P afin d'établir la génération F2 suite à une injection réussie.Au moins 80 % des embryons injectés avec le mélange d'ADN du piège à gènes et de transposase ARN affichent un certain degré de fluorescence GFP. Une faible expression de GFP indique soit une injection infructueuse, soit une dégradation de l'ARN de transposase due à une contamination par des ARNases. Lorsque les embryons positifs GFP les plus fluorescents sont sélectionnés pour établir le lot F zéro, environ un poisson F zéro sur 10 examinés donnera une descendance porteuse du piège à gènes parmi les poissons F zéro à partir desquels les événements de piège à gènes sont récupérés.La majorité transmet un seul événement d’insertion d’un gène piège, en plus de plusieurs insertions de transposons non exprimés. Étant donné que tout le cassette du gène piège est encadré par des sites P directs, toute mutation par insertion d’un gène piège, illustrée sur ce schéma par des boîtes bleues représentant les exons du gène muté, peut être inversée par l’expression de CRE recombinase. Ces images montrent la co-expression de GFP et de RFP dans le système nerveux de la lignée transgénique NSF TP six portant un gène piège ; l’injection d’ARN de CRE dans des embryons NSF TP six entraîne la perte de l’expression de GFP et de RFP.Remarquez qu'il n'y a aucune réduction de l'expression de la GFP dans le cristallin, comme prévu. La plupart des procédures décrites ici s'appliquent également à d'autres écrans de piège à gènes ainsi qu'aux expériences classiques de transgénèse avec le transposon TOL2 et d'autres transposons. En suivant la procédure de piège à gènes décrite ici, la mise en place de 20 à 30 croisements F0 par semaine devrait permettre d'obtenir un piège à gènes par semaine.Cependant, le protocole peut facilement être amplifié.

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Les auteurs décrivent les approches pour la manipulation des gènes dans le système de modèle évolutionniste Astyanax mexicanus. Trois techniques différentes sont décrites : Tol2 médiée par transgénèse, manipulation ciblée du génome à l’aide de CRISPR/Cas9 et précipitation d’expression utilisant les morpholinos. Ces outils devraient faciliter l’enquête directe des gènes qui sous-tendent la variation entre les formes de surface - et cavernicoles.

Manipulation de la fonction du gène en mexicain Agassizii

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

Ici, nous présentons un protocole pour marquer les protéines avec une étiquette de protéine de fluorescence chez les larves de poisson-zèbre, un système in vivo nouvellement développé et modifié particulièrement utile pour visualiser les protéines de faible abondance chez le poisson zèbre.

Marquage par fluorescence pour visualiser les protéines faiblement exprimées chez le poisson-zèbre

Ici, nous décrivons un protocole de génération de mutant maternel qui couple une ligne d’entraînement stable zpc :cas9 avec l’administration médiée par Tol2 de cassettes d’expression d’ARNsg.

Génération de mutants maternels à l’aide du poisson-zèbre knock-in zpc :cas9

Découvrez la mutagénèse par piégeage de gènes chez le poisson zèbre utilisant Gal4-VP16 comme rapporteur principal. Cette méthode permet de générer des mutants pour l'analyse fonctionnelle des gènes avec un criblage efficace.

Gene piégeage utilisant Gal4 chez le poisson zèbre

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