Name: Mesures rigidité en flexion des biopolymères en utilisant des essais de vol à voile (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Apprenez à mesurer la rigidité en flexion des microtubules par essai de vol à voile entraîné par la kinesine. Cette méthode permet de déterminer la longueur de persistance des biopolymères individuels en biophysique cellulaire.

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Nous tenons à remercier Melissa Klocke d&#39;assistance préparer la Figure 1 et Anna Ratliff pour démontrer le protocole. Ce travail a été soutenu par la Société pour l&#39;avancement de la recherche scientifique.

1. Microtubules vol à voile Assay Solutions mères Préparer à l&#39;avance de dosage glisse. <ol><li> Polymériser 0,5 mg microtubules peu marquées avec un fluorophore organique lumineuse 22. La concentration étiquette cible est de 1 fluorophore par micromètre de microtubules, soit une densité étiquetage d&#39;environ 1 fluorophore par 1.500 dimères de tubuline. Entreposer à la température ambiante, la lumière protégée avec de l&#39;aluminium, une feuille pour un maximum de deux semaines. </li><li> Purifier biotine-kinésine 21 à environ 1 uM. Conserver à -80 ° C en 5 aliquotes pour utilisation dans des expériences individuelles. </li><li> Préparer le tampon de dosage (AB) de 50 mM imidiazole, 50 mM de chlorure de potassium (KCl), 4 mM de chlorure de magnésium (MgCl 2), 2 mM d&#39;éthylène-glycol d&#39;acide tétraacétique (EGTA), pH 6,7. Filtre stérile et conserver à 4 ° C. </li><li> Dissoudre biotinylé albumine de sérum bovin (BSA-biotine) à 2 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue.Conserver à -80 ° C en aliquotes de 100 pi pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un mois. </li><li> Dissoudre la streptavidine (SA) à 10 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en 20 aliquotes pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un maximum de deux semaines. </li><li> Dissoudre α-caséine à 5 mg / ml à AB. Filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en aliquotes de 100 pi pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant un maximum de deux semaines. </li><li> Dissoudre dithiothréitol (DTT) dans de l&#39;eau déminéralisée à 200 mM. Conserver à -20 ° C en aliquotes de 100 pi, utiliser dans les 8 heures de décongélation. Peut-être recongelé. </li><li> Dissoudre le paclitaxel (PT) en HPLC du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 4 mM. Boutique en 10 aliquotes à -80 ° C à long terme, de -20 ° C à court terme. Utiliser dans les 8 heures suivant la décongélation. Peut-être recongelé. </li><li> Dissoudre le glucose dans de l&#39;eau désionisée à 120 mg / ml. Conserver dans aliquotes de 100 pi à -20 ° C. Peut-être recongelé. </li><li> Disrésoudre l&#39;adénosine triphosphate (ATP) dans de l&#39;eau déminéralisée à 150 mM, pH 7,0. Boutique en 5 aliquotes à -80 ° C, utiliser dans les 8 heures de décongélation. </li><li> Préparer stocks d&#39;oxygène 100x balayage 25 par dissolution de 10.000 unités de glucose-oxydase et catalase 156.000 unités dans 600 ul du tampon de dosage total. Centrifuger brièvement dans une microcentrifugeuse à granulés solides; surnageant filtre avec filtre de 0,2 um seringue. Conserver à -80 ° C en 10 aliquotes pendant de longues périodes, à 4 ° C pendant une semaine. </li></ol> 2. Microtubules Gliding test, même Préparation de la solution Jour Préparer les solutions de 02.01 à 02.06 le jour de l&#39;expérience. Avec la pratique, les solutions de 2.2 à 2.6 peuvent être préparés pendant l&#39;écoulement des cellules lavage. Sauf indication contraire, gardez solutions mères sur la glace. <ol><li> Préparer AB, 1 ml de tampon de dosage avec 10 ul de la TNT stock (AB avec 2 mM de DTT). Conserver à température ambiante. </li><li> Préparer bio-BSA tampon, 40 &amp; mu, L d&#39;un mélange 1:1 du stock biotine-BSA et AB. Conserver à température ambiante. </li><li> Préparer un tampon BSA, mélangeant 645 ul de AB avec 5,5 ul de BSA (1 mg / ml de BSA dans AB). Conserver à température ambiante. </li><li> Préparer un tampon SA, en mélangeant 57 ul de AB avec 3 streptavidine actions ul (0,5 mg / ml de streptavidine dans AB). Conserver à température ambiante. </li><li> Préparer α-caséine tampon, mélanger 200 pi de tampon BSA, 50 ul de stock caséine et 0,8 ul de 15 uM (1 mg / ml α-caséine, 0,8 mg / ml de BSA, 50 nM d&#39;ATP dans AB) ATP. Conserver à température ambiante. </li><li> Préparer la fluorescence anti-eau de Javel tampon, mélangeant 95 pl de tampon α-caséine, 2,5 ul de stock de glucose, 1 ul mélange d&#39;oxygène 100x balayage, 1 stock paclitaxel pi, 1 pi 2-mercaptoéthanol (ßME). Ajouter ßME sous une hotte. Utilisez la fluorescence anti-eau de Javel tampon dans 1 h de préparation. ATTENTION: ßME est hautement toxique et sent mauvais. Assurez-vous d&#39;être ouvert uniquement sous la hotte. Bouteille dans le magasinl&#39;absence de lumière, la lumière dégrade ßME et sa capacité à réduire photoblanchiment. </li></ol> 3. Microtubules Gliding Assay <ol><li> Construire environ quatre voies d&#39;écoulement entre une lamelle 24 x 60 mm et 22 mm x 22 lamelle avec de la graisse à vide, extrudés à partir d&#39;une seringue à travers un embout de pipette, comme un élément d&#39;espacement. Chaque voie d&#39;écoulement doit être d&#39;environ 10 pi en volume (échelle des volumes suivants en conséquence). </li><li> Lavez 10 ul de bio-BSA tampon dans chaque couloir. Incuber 5 minutes pour permettre BSA pour revêtir les surfaces de verre. </li><li> Laver chaque voie trois fois avec 15 pi de tampon BSA pour enlever la biotine libre-BSA, tout en continuant à bloquer la surface de glissement. Utilisez un Kimwipe ou de papier filtre pour éliminer le tampon du côté opposé de chambre d&#39;écoulement, en étant sûr de ne pas laisser de bulles d&#39;air à passer par la chambre d&#39;écoulement. </li><li> Lavez 15 pi SA-tampon dans chaque couloir. Attendre 10 minutes, ou jusqu&#39;à 2 heures. La streptavidine se lie à la biotine lié à la surface-BSA. </li><li> Laver chaque voie trois fois avec 15 pi de tampon BSA pour retirer gratuitement SA, tout en continuant de bloquer la surface de glissement. </li><li> Laver chaque voie avec 15 ul de tampon α-caséine. α-caséine permet en outre de bloquer liaison non spécifique de la kinésine et des microtubules dans le verre. </li><li> Diluer kinésine à 10 nM dans α-caséine tampon et laver chaque voie avec 15 ul de cette kinésine - α-caséine solution. Attendre 15 minutes (ou jusqu&#39;à une heure) de la kinésine biotinylé de se lier spécifiquement à la streptavidine liée à la surface. Les domaines kinésine moteur resteront libres de lier les microtubules. </li><li> Diluer le paclitaxel à 40 pM dans la température ambiante α-caséine tampons, et laver chaque voie avec 15 ul de cette solution pour laver la kinésine libre et de pré-charger chaque chambre d&#39;écoulement avec une solution de paclitaxel pour éviter de dépolymérisation des microtubules. Froide dépolymérise également microtubules, alors assurez-vous que ces étapes se produisent à température ambiante avec salle de temre des solutions. </li><li> Diluer marqué par fluorescence microtubules 1:100-1:1,000 de la fluorescence anti-eau de Javel tampon avec 1 mM d&#39;ATP. Lavez 15 ul dans une voie et d&#39;observer dans les 30 minutes. </li></ol> 4. Collecte des données <ol><li> Observez le glissement des microtubules en utilisant la microscopie à fluorescence, un microscope capable de résoudre fluorophores simples comme une installation commerciale ou maison de construction FRBR est nécessaire 26 (figure 2). Les microtubules devrait être propulsé par les moteurs de kinésine sur le substrat à environ 0,5 mm / s, en fonction de la température. Si le champ de vision du microscope est de 50 um, les microtubules individuels doit être visible pendant environ 100 secondes. Réglez l&#39;intensité lumineuse de telle sorte que les fluorophores simples ne photoblanchiment plus vite que 100 sec. Si l&#39;on utilise une excitation laser, un réglage de puissance de l&#39;ordre de 3-5 mW est approprié. </li><li> Recueillir des séquences d&#39;images pour l&#39;analyse. 600 images à5 Hz (2 min au total) fonctionne bien. Utiliser des séquences assez longtemps que les microtubules traversent l&#39;ensemble du champ de vision. </li></ol> 5. Analyse des données Une routine IDL, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50117/50117IDL_Routines.zip" target="_blank">get_lp.pro</a> , est annexé. Cette routine renvoie une valeur de longueur de persistance basée sur les microtubules glisse dans une séquence d&#39;images donné. Soit exécuter cette routine sur chaque séquence d&#39;images, la modification des paramètres d&#39;intensité en fonction de la configuration de votre microscope particulier, ou procédez comme suit: <ol><li> Suivre chaque fluorophore attaché à un microtubule à créer des trajectoires fluorophores. </li><li> Mélanger tous les trajectoires des fluorophores sur un microtubule donné dans une trajectoire globale des microtubules; répétez pour chaque microtubules dans la séquence d&#39;images (figure 3). </li><li> Calculer l&#39;angle de la tangente à chaque point le long de la trajectoire (figure 4), Et calculer &lt;cos θ s&gt; dans l&#39;équation. 1 en faisant la moyenne du cosinus de la différence d&#39;angle pour chaque paire de points séparés par un chemin de longueur l (figure 5). Trouver la longueur de persistance pour un microtubule ou un groupe de microtubules par &lt;cos montage θ s&gt; à Eq. 1, la pondération des points de données individuels dans l&#39;ajustement par le nombre de valeurs indépendantes du cos θ s qui sont utilisés pour calculer la moyenne. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Les mesures de longueur de persistance sont une bonne caractérisation des propriétés mécaniques des biopolymères individuels. Dans cet article, nous avons décrit une méthode de mesure de la longueur de persistance des microtubules. Comme indiqué dans l&#39;introduction, cette méthode est facilement étendu à l&#39;examen des propriétés mécaniques des microtubules dans une variété de conditions tout simplement en faisant varier les réactifs, la température, la viscosité ou à l&#39;étape finale de l&#39;épreuve de glisse, ...

Le cytosquelette, un réseau de biopolymères présent dans la plupart des cellules eucaryotes, joue un rôle dans l'organisation cellulaire, le transport intracellulaire et la mécanique cellulaire. Les caractéristiques mécaniques des biopolymères du cytosquelette (principalement l'actine et les microtubules) jouent un rôle important dans la détermination des caractéristiques mécaniques de la cellule dans son ensemble12. Puisque la mécanique de la cellule entière permet de caractériser les cellules saines et malades13,14 et est impliquée dans la motilité cellulaire15, les propriétés mécaniques des composants cytosquelettiques sous-jacents font l'objet d'études approfondies depuis deux décennies1.
La flexibilité (ou rigidité) des biopolymères est caractérisée par la longueur de persistance, qui correspond à la longueur de polymère se courbant d’environ un radian sous l’effet des fluctuations thermiques à température ambiante. Plusieurs techniques ont été mises au point pour mesurer la longueur de persistance16, par exemple des techniques actives impliquant la déformation du polymère à l’aide d’un écoulement hydrodynamique, de pièges optiques ou de champs électriques4,17,18, ainsi que des techniques passives mesurant les fluctuations de polymères libres en solution5,6. Les mesures actives nécessitent toutefois des dispositifs spécialisés permettant d’appliquer des forces connues à l’échelle micrométrique, tandis que les mesures de fluctuations libres peuvent s’avérer difficiles en raison de la diffusion hors du plan de mise au point du microscope utilisé.
Dans cet article, nous décrivons une technique complémentaire et passive permettant de mesurer la longueur de persistance des microtubules, un polymère du cytosquelette. La technique repose sur des essais de glissement, qui garantissent que le polymère reste toujours dans le plan focal19. De plus, elle implique le suivi de fluorophores uniques fixés de manière permanente au polymère d'intérêt, de sorte que des emplacements spécifiques le long du polymère soient bien caractérisés.
Un schéma de la méthode est présenté dans Figure 1. La kinésine se déplace spécifiquement vers l'extrémité + des microtubules, de sorte que les microtubules dans un test de glissement sont propulsés de manière unidirectionnelle. L'extrémité avant du microtubule, au-delà de la dernière kinésine attachée, est libre de fluctuer sous l'effet des forces thermiques de la solution environnante. Lorsque le microtubule est propulsé vers l'avant, cette extrémité fluctue jusqu'à ce que sa liaison avec une nouvelle molécule de kinésine située plus loin sur la lame de verre fige une fluctuation donnée. Étant donné que la kinésine fixe les microtubules très fortement, le microtubule est contraint de suivre le trajet de son extrémité avant. Ainsi, les fluctuations statistiques figées dans la trajectoire du microtubule sont identiques aux fluctuations statistiques de l'extrémité libre des microtubules11, et peuvent donc être utilisées pour calculer la longueur de persistance selon20
<img alt="Équation d'équilibre statique ; ⟨cosθ_s⟩=e^(-s/l_p). Formule pour l'analyse scientifique." fo:content-width="1in" fo:src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50117/50117eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Équation 1"> 
où lp est la longueur de persistance du microtubule, θs est l'angle entre les tangentes à la trajectoire séparées par une longueur curviligne s, et &lt;&gt; désigne une moyenne effectuée sur toutes les paires de positions séparées par une longueur curviligne s.
Le test de glissement utilise une kinesine biotinylée au niveau du domaine en hélice enroulée21, fixée spécifiquement sur la lame de verre par un lien streptavidine-biotine. Cette fixation garantit que les domaines moteurs restent libres pour se lier aux microtubules et les propulser. Afin de suivre les trajectoires des microtubules, ceux-ci sont marqués de manière clairsemée par des fluorophores organiques22,23 — le marquage doit être suffisamment dilué pour que chaque fluorophore individuel puisse être résolu par microscopie de fluorescence monocellulaire. Les fluorophores uniques sont suivis à l’aide de programmes d’analyse d’image écrits en IDL. Les trajectoires de chaque fluorophore lié à un microtubule donné sont automatiquement combinées en une trajectoire composite du microtubule24. Les angles tangentiels θ en chaque point d’une trajectoire sont calculés ; à partir de ces angles tangentiels, la valeur &lt;cosθs&gt; est déterminée pour chaque longueur curviligne s. Enfin, ces données sont ajustées selon l’équation 1 afin d’obtenir la longueur de persistance d’un microtubule donné, ou de plusieurs microtubules issus du même test de glissement.
La méthode est suffisamment robuste pour fonctionner avec des microtubules préparés dans une grande variété de conditions (avec différents agents stabilisants ou autres petites molécules liées au microtubule, avec des protéines associées aux microtubules (MAPs) liées, ou dans diverses solutions visqueuses). Dans notre laboratoire, cette technique a été utilisée pour caractériser la longueur de persistance des microtubules en fonction de leur longueur et des microtubules contenant différents agents stabilisants. La principale restriction est que les microtubules doivent encore permettre la motilité de la kinésine. Étant donné que la kinésine est une enzyme motrice robuste, cette restriction est relativement faible. En remplaçant les microtubules par de l’actine et la kinésine par une enzyme de la famille de la myosine, la longueur de persistance de l’actine peut être mesurée à l’aide de la même technique.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactifs </td></tr><tr><td>imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>chlorure de magnésium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Calbiochem</td><td>126615</td><td></td></tr><tr><td>biotinylé BSA</td><td>Thermo Scientific</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>&alpha ;-caséine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6780</td><td></td></tr><tr><td>streptavidine</td><td>Thermo Scientific</td><td>21125</td><td></td></tr><tr><td>dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>paclitaxel</td><td>LC Laboratories</td><td>P-9600</td><td></td></tr><tr><td>glucose oxydase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td></td></tr><tr><td>catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>2-mercapt&#8211 ; thanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>Toxique. Achetez une petite quantité.</td></tr><tr><td>24X60 mm N° 1 1/2 verre de protection</td><td>VWR</td><td>48393-252</td><td></td></tr><tr><td>22X22 mm N° 1 verre de protection</td><td>Gold Seal</td><td>3306</td><td></td></tr><tr><td>Graisse sous vide poussé</td><td>Dow-Corning</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment </td></tr><tr><td>microscope TIRF</td><td>many</td><td>NA</td><td>Le microscope TIRF utilisé dans cette méthode était fait maison.</td></tr><tr><td>IDL (logiciel)</td><td>Exelis</td><td>NA</td><td>Pourrait remplacer MATLAB, ImageJ ou d’autres logiciels d’analyse d’images.</td></tr></tbody></table>

mesures rigidité en flexion des biopolymères en utilisant des essais de vol à voile

Flexural Rigidity Measurements of Biopolymers Using Gliding Assays

Les microtubules sont des polymères du cytosquelette qui jouent un rôle dans la division cellulaire, mécanique cellulaire et le transport intracellulaire. Chacune de ces fonctions nécessite microtubules qui sont raides et droites assez pour couvrir une fraction significative du diamètre cellulaire. En conséquence, la longueur de persistance des microtubules, une mesure de rigidité, a été activement étudiée pour les deux dernières décennies 1. Néanmoins, des questions restent ouvertes: microtubules courts sont 10-50 fois moins rigide que les microtubules longues 2-4, et même microtubules longs ont mesuré la longueur de persistance qui varient d&#39;un ordre de grandeur 5-9. Ici, nous présentons une méthode pour mesurer la longueur de persistance des microtubules. La méthode est basée sur une analyse axée sur la kinésine microtubules glisse 10. En combinant rares marquage fluorescent des microtubules individuels avec suivi de particule unique de fluorophores individuelles attachées à des microtubules, le Glidintrajectoires g de microtubules simples sont suivis du nanomètre-niveau de précision. La longueur de persistance de la trajectoire est la même que la longueur de persistance de l&#39;microtubules dans les conditions utilisées 11. Un sous-programme de suivi automatisé est utilisé pour créer des trajectoires des microtubules à partir de fluorophores liés aux microtubules individuels, et la longueur de persistance de cette trajectoire est calculée à l&#39;aide des routines écrites en langage IDL. Cette technique est rapidement réalisable, et capable de mesurer la longueur de persistance de 100 microtubules dans un jour de l&#39;expérimentation. La méthode peut être étendue pour mesurer la longueur de persistance sous une variété de conditions, y compris la durée de persistance en fonction de la longueur le long des microtubules. En outre, les routines d&#39;analyse utilisés peuvent être étendus à la myosine à base de tests effet de glisse, pour mesurer la longueur de persistance des filaments d&#39;actine ainsi.

Une image extraite d'un test de glissement est présentée dans la Figure 2. Une densité adéquate de microtubules correspond à 1-10 microtubules par champ observé ; une densité nettement plus élevée entraînera des erreurs de suivi lorsque les microtubules se croisent. Un graphique représentant les trajectoires de 11 microtubules issues du test de glissement de la Figure 2 est montré dans la Figure 3. Les trajectoires typiques ont une longueur de 10 à 30 μm ; certaines traj...

Procédé pour mesurer la longueur de persistance ou la rigidité en flexion de biopolymères est décrit. La méthode utilise une kinésine axée sur les microtubules glisse test pour déterminer expérimentalement la longueur de persistance des microtubules individuels et est adaptable à l&#39;actine des essais à base de glisse.

Mesures rigidité en flexion des biopolymères en utilisant des essais de vol à voile

Microtubules are cytoskeletal polymers which  play a role in cell division, cell mechanics, and intracellular transport. Each of these functions requires ...

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser un test de glissement pour mesurer la rigidité UAL des microtubules. Ceci est accompli en fixant d’abord spécifiquement la protéine motrice kinésine à une lame de microscope avec des domaines moteurs libres de lier les microtubules. La deuxième étape consiste à ajouter à l’échantillon des microtubules marqués par fluorescence, qui sont traduits par la kinésine.Les vidéos suivantes de microtubules planants sont collectées à l’aide de la microscopie à fluorescence. La dernière étape consiste à analyser les vidéos de test de glissement pour calculer la rigidité en flexion des micro-tubules. En fin de compte, les tests de glissement sont utilisés pour déterminer la rigidité en flexion des microtubules uniques.Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la mécanique du cytosquelette, telles que la rigidité à la flexion des polymères cytosquelettiques individuels. Anna Ratliff, une étudiante de mon laboratoire, fera la démonstration de cette procédure. Pour commencer cette procédure, préparez le tampon de test fonctionnel en ajoutant 10 microlitres de 200 milli moles, DIO trois, atol ou DTT à un millilitre de solution de tampon de test mère et mélangez.Conservez cette solution et toutes les autres solutions de travail à température ambiante pendant la procédure. Ensuite, à l’aide du tampon de dosage, préparez 40 microlitres de tampon BSA de biotine en combinant de l’albumine sérique bovine biotinylée, filtrée et stérile à raison de deux milligrammes par millilitre avec le tampon de dosage de travail dans un rapport de un pour un et en mélangeant la solution. Préparez ensuite le tampon BSA en combinant 645 microlitres de tampon de dosage avec 5,5 microlitres de 117 milligrammes par millilitre de BSA, et en mélangeant la solution.Préparez également le tampon de tritine en mélangeant 57 microlitres de tampon de test avec trois microlitres de streptocoque din filtré stérile à 10 milligrammes par millilitre dans le tampon de test. Ensuite, construisez les voies d’écoulement sur une lamelle de 24 x 60 millimètres et extrudez cinq fines lignes de graisse sous vide à partir d’une seringue de 10 millilitres. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres pour réguler le débit, les conduites doivent être espacées d’environ quatre millimètres.Placez une lamelle de 22 x 22 millimètres sur la graisse sous vide et appuyez légèrement pour former les canaux. Avec un volume approximatif de 10 microlitres, les conduites de graisse sous vide doivent s’étendre sur environ deux fois la largeur d’origine. L’étape suivante consiste à précocer les voies avec de l’albumine sérique bovine biotinylée en pipetant 10 microlitres du tampon bioTE BSA dans chaque voie d’écoulement en utilisant la force capillaire pour aspirer le tampon incubé pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, rincez chaque voie trois fois en injectant 15 microlitres de tampon BSA dans un côté de chaque voie tout en aspirant la solution de l’autre côté à l’aide d’une lingette Kim ou d’un papier filtre. Veillez à ne pas introduire de bulles d’air dans les voies. Ensuite, 15 microlitres de streptavidine tamponnent dans chaque voie et incuberont jusqu’à deux heures avec un minimum de 10 minutes.Pendant l’incubation, préparez l’alpha KC dans le tampon en mélangeant 200 microlitres de tampon BSA, 50 microlitres d’alpha KC filtré stérile à cinq milligrammes par millilitre dans le tampon de dosage et 0,8 microlitre de 15 micromolaires a TP à pH sept. Préparez également la solution de kinésine en pipetant le tampon alpha KCM dans un nouveau tube et en ajoutant la biotine kinésine à 10 nanomolaires, puis en mélangeant après l’incubation avec le tampon de streptavidine. Rincez chaque voie trois fois avec 15 microlitres de tampon BSA.Rincez ensuite chaque voie avec 15 microlitres de tampon alpha kcn afin de réduire la liaison non spécifique de la kinésine et des microtubules au verre. Ensuite, ajoutez 15 microlitres de solution de kinésine dans chaque voie et incubez pendant 15 minutes à une heure. Pendant ce temps, la kinésine de biotine formera une liaison forte avec la streptavidine liée à la surface et permettra aux domaines moteurs de la kinésine d’être accessibles pour la liaison des microtubules.Pendant ce temps, préparez une solution de 40 micromolaires de paclitaxel et d’alpha KC et un tampon. Le paclitaxel est important pour empêcher les microtubules de se dépolymériser. Dans une hotte, préparez le tampon anti-blanchiment de fluorescence en mélangeant 95 microlitres de tampon alpha KCM, 2,5 microlitres de stock de glucose, un microlitre de 100 x piégeage d’oxygène.Mélangez un microlitre de Paclitaxel et de DMSO à quatre millimolaires. Et enfin, un microlitre de bêta-me-capto-éthanol. Après l’incubation, rincez toute biotine kinésine libre en lavant chaque voie avec 15 microlitres à température ambiante.Le paclitaxel dans une solution d’alpha Kian à l’aide d’un tampon froid peut dépolymériser les microtubules. Enfin, versez le tampon anti-blanchiment par fluorescence dans un nouveau tube et ajoutez les microtubules marqués par fluorescence à une dilution de un à 100 à un à 1000. Ajoutez ensuite un millimolaire de TP et mélangez.Injectez 15 microlitres de la solution de microtubules dans une voie et observez à l’aide de la microscopie à fluorescence dans les 30 minutes. Les aspects les plus critiques de cette procédure sont d’avoir une concentration optimale de microtubules pour s’assurer qu’ils ne se chevauchent pas et d’avoir un faible bruit de fond. Les voies restantes sont utilisées pour optimiser la concentration des microtubules, et nous utilisons le microscope lui-même pour les aligner et les focaliser.L’imagerie des microtubules planants est réalisée à l’aide d’un microscope à fluorescence à réflexion interne totale fait maison. Un objectif à haute ouverture numérique de 100 x affiche un champ d’environ 50 microns par 50 microns, ce qui est suffisant pour voir le mouvement pendant environ 100 secondes à une vitesse de 0,5 micron par seconde. Le laser utilisé pour l’excitation à une puissance de trois à cinq milliwatts.Cette puissance est suffisamment faible pour empêcher le photoblanchiment du sol de quatre plus rapidement que 100 secondes pour permettre un temps d’imagerie adéquat. À l’aide d’un logiciel de capture d’images, collectez des séquences d’images à cinq images par seconde pendant deux minutes. Les séquences doivent être suffisamment longues pour que les microtubules puissent traverser tout le champ de vision.Analysez les données d’image à l’aide d’une routine IDL telle que le fichier, obtenez LP Pro, qui peut être obtenu à partir du matériel supplémentaire. Cette routine DL renvoie une valeur de longueur de persistance basée sur le glissement de tous les microtubules dans une séquence d’images donnée. Modifiez les paramètres d’intensité en fonction de l’intensité du fluoro quatre et de la configuration du microscope.Voici un test de glissement réalisé par microscopie à fluorescence à réflexion interne totale. Les quatre Fluor peuvent être vus peu décorés sur toute la longueur des microtubules. Les trajectoires simples de fluoro quatre qui viennent d’être montrées sont fusionnées, combinant une moyenne de 10 fluors quatre en un seul point tous les 100 nanomètres pour améliorer l’analyse des données.Lorsque l’on examine un seul microtubule, l’angle tangent entre chaque point peut être facilement calculé et cartographié en fonction de la longueur. À l’aide des angles tangents, la longueur de persistance peut être calculée et la longueur moyenne du cosign par segment peut être tracée à l’aide de l’équation illustrée ici. Une ligne de meilleur ajustement peut être déterminée une fois maîtrisé.Cette technique peut être utilisée pour mesurer la rigidité en flexion de plusieurs dizaines de microtubules en trois ou quatre heures si elle est correctement réalisée.

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