Intact Caractérisation histologique du cerveau Microdevices-implantées et les tissus environnants

Le but de cette procédure est d’imager l’interface intacte du tissu cérébral autour de microdispositifs implantés de manière chronique dans le tissu cérébral des rongeurs. Ceci est accompli en utilisant d’abord un élastomère de silicone à cellules rapides et un acrylique dentaire en deux parties pour couvrir la craniotomie et former une calotte crânienne autour du dispositif implanté dans le cerveau. Après avoir perfusé l’animal avec un traitement tissulaire fixateur et post-mortem, la partie implantée du cerveau du dispositif est séparée du capuchon de la tête en brûlant l’acrylique dentaire et en coupant à travers la cellule rapide.

Ensuite, le cerveau est retiré et tranché avec un viome pour capturer l’implant dans une section de tissu. La dernière étape consiste à préparer le tissu pour l’imagerie fluorescente en lavant l’étiquetage, puis en nettoyant la section du tissu dans une solution de clarification optique. En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour montrer la réponse biologique intacte que l’implant cérébral pénétrant produit dans les tissus environnants à l’échelle subcellulaire.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’explication, le dispositif, est que la technique évite de perturber le tissu entourant et adhérant au dispositif implanté afin que le tissu d’interface puisse être examiné intact. Cette méthode s’appuie sur des techniques avancées d’immunohistochimie et de microscopie et permet d’obtenir des données de microscopie confocale qui décrivent en détail la région entourant un dispositif implanté dans le cerveau. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neuroprothèses, telles que la mesure dans laquelle la mort cellulaire locale, la formation de cicatrices gliales et la réorganisation des vaisseaux sanguins ont un impact réel sur la durée de vie des dispositifs à micro-électrodes implantés dans le cerveau.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’interface neuronale chronique des réseaux de micro-électrodes implantés dans le cerveau. Les techniques impliquées dans cette méthode peuvent également être appliquées à d’autres domaines de la recherche en neurosciences, y compris les canules implantées ou les fibres optiques Dans une hotte, commencez la procédure en retirant soigneusement la peau et d’autres tissus autour de la calotte crânienne en acrylique, à l’aide de pinces et de petits ciseaux tout en portant les gants insensibles à la chaleur. Utilisez un fer à souder pour produire une fenêtre dans l’acrylique denté et exposer une zone d’étanchéité rapide sous-jacente.

L’appareil doit être visible, enfermé dans le sceau rapide transparent. Ensuite, sous un microscope chirurgical, découpez l’élastomère de silicium à l’aide d’une paire de micro-ciseaux incurvés. Retirez ensuite les petits morceaux de joint rapide à l’aide d’une pince à épiler et de micro-ciseaux jusqu’à la position où l’appareil pénètre dans le cerveau.

Continuez à couper le long de la surface de la craniotomie pour séparer les composants du dispositif qui se fixent au polysilicium et au crâne des composants implantés dans le cerveau. Soyez prudent lorsque vous coupez à travers les composants exposés de l’appareil. Évitez de pousser ou de traîner les implants dans le tissu fixé.

Ensuite, retirez l’os autour du chapeau de tête avec précaution en utilisant les shes crus après cela. Utilisez une spatule pour séparer le cerveau avec le dispositif implanté du crâne. Placez maintenant le cerveau dans une boîte de Pétri en verre remplie de HBHS.

Utilisez le bloc cérébral et des lames de rasoir pour sectionner le cerveau et créer un plan plat correspondant étroitement à l’angle des dispositifs implantés. Après cela, enfoncez deux lames de rasoir à travers le tissu cérébral pour exposer la surface plane qui sera montée sur le Vibram. Ensuite, placez de la glace sous la plate-forme Vibram.

Ensuite, séchez brièvement la surface du tissu sur une serviette en papier. Après cela, orientez l’échantillon de manière à ce que la dimension la plus large soit parallèle à la direction de mouvement de la lame de tonalité vibrante pour éviter que la lame ne renverse potentiellement le tissu, collez immédiatement le plan plat sur la platine avec de la super colle. Ensuite, la colle fixe un PBS réfrigéré sur la boîte de vibrato autour du tissu.

Coupez maintenant les tranches de tissu entre 250 et 500 microns en utilisant le taux de vibration maximal et un taux de progression lent de la lame avec un angle de lame de 10 degrés par rapport à l’horizontale. Ensuite, collectez soigneusement les tranches avec un pinceau et une spatule et conservez un HBHS dans une assiette à 24 puits à quatre degrés Celsius tout en collectant les tranches, gardez une trace de l’épaisseur et de l’emplacement de chaque tranche au fur et à mesure qu’elles sont retirées dans la plaque à 24 puits. Une fois que l’appareil Insitu est visible, prélevez une tranche de tissu d’environ 500 microns d’épaisseur.

Afin de capturer le dispositif en une seule tranche de tissu pour recueillir une section de tissu plus mince, des tranches de 100 microns peuvent être soigneusement prélevées pour s’approcher de près du dispositif. À ce moment-là, une tranche de moins de 500 microns d’épaisseur peut être collectée avec l’appareil à l’intérieur. Commencez le traitement des tissus en lavant les tranches trois fois à cinq minutes par lavage dans HBHS.

Ensuite, incubez-les dans de l’hydrure de borah de sodium pendant 15 minutes. De chaque côté de la tranche, retournez lentement la tranche à l’aide d’un petit pinceau et évitez de toucher les zones autour du dispositif implanté. Une micro-cuillère en acier inoxydable ou recouverte de téflon peut également être utilisée avec le petit pinceau.

Maintenant, lavez les tranches trois fois à cinq minutes par lavage dans une solution de lavage à température ambiante. Bloquez-les dans une solution de lavage pendant deux heures à température ambiante tout en retournant les tranches. Après une heure après deux heures, incubez les tranches dans l’anticorps primaire pendant environ 48 heures à quatre degrés Celsius.

Ensuite, effectuez six lavages rapides de trois minutes avec une solution de lavage. Effectuez ensuite six lavages d’une heure dans une solution de lavage. Après cela, incubez-les dans des anticorps secondaires pendant environ 48 heures à quatre degrés Celsius.

Encore une fois, effectuez six lavages rapides de trois minutes suivis de six lavages d’une heure dans une solution de lavage. Ensuite, retirez la solution de lavage et ajoutez la solution nettoyante pour le tartre U2 à base de glycérol. Couvrir l’assiette de papier d’aluminium et conserver à quatre degrés Celsius.

Laissez les tranches épaisses disparaître environ une semaine ou des sections de tissus très épaisses pendant deux à trois semaines à quatre degrés Celsius. Après le dégagement, montez les sections de tissu sur des lames en utilisant une solution de clarification comme support de montage. Scellez toutes les lames avec du vernis à ongles transparent et conservez-les à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière, en utilisant des objectifs de microscope à plus longue distance.

Commencez l’imagerie avec un microscope confocal à balayage laser ou un microscope à deux photons. Nous ferons la démonstration à l’aide d’un logiciel XS L SM seven 10 Carl Xi send et d’une platine de traduction XY contrôlée par ordinateur pour imager un panorama 3D autour d’un implant afin de corriger l’indice de réfraction de la solution de dégagement. Dans cette démonstration, nous saisissons une valeur d’indice de réfraction de 1,4 dans le logiciel de microscope Leica Zen pour la solution de nettoyage U2.

Ce paramètre ajuste subtilement les intervalles de pas Z pour tenir compte de l’inadéquation de l’indice de réfraction dans le tissu proche de l’appareil. Évaluez grossièrement la fenêtre de l’axe Z appropriée et les paramètres de collecte de données dans la dimension zdi pour chaque canal fluorescent à l’aide d’une faible puissance laser, d’environ 0,5 à 5 % et de grandes tailles de pas Z. Utilisez ensuite le logiciel de panorama Zen pour définir l’objectif au centre XY du panorama final et pour déterminer le nombre de positions de collecte requises pour les axes x et y.

Pour couvrir la zone qui vous intéresse, réévaluez et finalisez la fenêtre de collecte de l’axe Z en vérifiant rapidement la première et la dernière image de la pile. Ensuite, réglez manuellement la sensibilité du détecteur et la puissance du laser pour qu’elles s’adaptent de manière appropriée à l’augmentation de la profondeur. L’objectif est généralement de maintenir à peu près la même intensité d’image, quelle que soit la profondeur d’imagerie dans la tranche de tissu, et d’éviter un bruit de fond élevé.

Collectez chaque série de données d’image fluorescente si nécessaire pour éviter le chevauchement des signaux, exécutez les lignes laser séquentiellement. Modifiez les paramètres du logiciel pour collecter les données ou les données de transmission et utilisez un laser de longueur d’onde plus long et plus pénétrant, tel que 6 à 33 nanomètres pour capturer ces canaux. Ensuite, déterminez la puissance laser appropriée et détectez une sensibilité pour la collecte de réflectance et de transmittance et répétez la même série de collecte autour du dispositif implanté.

Enfin, exportez les données pour un traitement ultérieur, une quantification et une analyse. L’imagerie de chaque côté de la lame peut vous permettre d’évaluer l’interface autour d’un dispositif, comme illustré ici, où les microglies le long du support en silicium d’un MEA sont visibles d’un côté et les microglies le long des sites et des traces d’électrodes sont visibles de l’autre côté. Une fois que le tissu monté peut être imagé à l’aide d’une platine de translation XY, il est possible de générer des aperçus des marqueurs fluorescents sur l’ensemble de la tranche de tissu à la résolution souhaitée.

Ici, les noyaux cellulaires sont colorés avec des crochets 3, 3, 3, 4, 2 et les monocytes microglie marqués avec 3, 2, 9. L’image anti-IBA a été simultanée sur des canaux séparés. La lumière de transmission et la réflectance ont également été collectées, montrant l’emplacement de l’implant de quatre semaines par rapport aux crochets et aux données IVA un, la superposition de tous les canaux, mais la transmission est indiquée ici.

Un examen détaillé de l’interface tissulaire morphologiquement préservée autour des microdispositifs implantés peut être collecté sous un fort grossissement pour l’analyse de la réponse tissulaire locale, la réflectance et la transmittance permettent la localisation du dispositif tandis que les marqueurs d’anticorps fluorescents ou chimiques permettent une imagerie détaillée des composants tissulaires le long de l’interface tissulaire intacte. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre vraiment le temps de séparer soigneusement les dispositifs implantés à travers le capuchon de tête et de prévoir que cette étape prendra plus de 30 minutes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de collecter et de traiter des tranches de cerveau contenant des dispositifs implantés.

Vous devriez également être en mesure d’étiqueter et de collecter des données histologiques décrivant la neurobiologie entourant ces dispositifs.