Name: Intact Caractérisation histologique du cerveau Microdevices-implantées et les tissus environnants (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Apprenez une méthode histologique pour imager l'interface intacte entre tissu cérébral et microdispositifs implantés chroniquement chez les rongeurs. Cette technique préserve l'intégrité tissulaire pour analyser la réponse biologique aux implants cérébraux.

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Toutes les expériences ont été effectuées sous la supervision de la protection des animaux et le Comité de Purdue utilisation et le Programme relatif aux animaux de laboratoire à l&#39;Université Purdue. Ce travail a été financé par la Defense Research Projects Agency avancée (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), sous les auspices du Dr Jack Judy W. (jack.judy @ darpa.mil) dans le cadre du programme de technologie Neural fiable, grâce à l&#39;spatiale et navale Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) du Pacifique Grant n ° N66001-11-1-4013. Les auteurs tiennent à remercier Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor, et Kevin Eliceiri pour partager leur expertise en microscopie.

Solutions Phosphate Buffered Saline (PBS) - en g / l, 9 g de NaCl, 0,144 g de KH 2 PO 4, 0,795 g de Na 2 HPO 4, à pH 7,4 Le formaldéhyde 4% - en ml / l; 202 ml de sodium phosphate dibasique solution (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml de sodium phosphate monobasique solution (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml de solution de formaldéhyde à 8%, 250 ml Milli- Q DDi eau, à un pH de 7,4 HEPES solution saline tamponnée de Hank avec l&#39;azoture de sodium (HBHS) - en g / l, 7,5 g de NaCl, 0,3 g de KCl, 0,06 g de KH 2 PO 4, 0,13 g de Na 2 HPO 4, 2 g de glucose, 2,4 HEPES g, 0,05 g de MgCl2 6 parties H 2 O, 0,05 g de MgSO 4 7 parties H 2 O, 0,165 g de CaCl 2, 0,09 g de NaN 3 à pH 7,4 Solution de lavage (WS) - 1% vol / vol, nede sérum de chèvre mal, 0,3% de Triton X-100, en HBHS avec l&#39;azoture de sodium (NaN 3). Réfrigérer le WS à 4 ° C avant son utilisation dans les étapes ultérieures. U2 Sca l e Solution - 4 M d&#39;urée, 30% de glycerol et 0,1% de Triton X-100 17 PROCÉDURE Toutes les expériences ont été effectuées sous la supervision de la protection des animaux et le Comité de Purdue utilisation et le Programme relatif aux animaux de laboratoire à l&#39;Université Purdue. 1. Chirurgie <ol><li> Diverses méthodes chirurgicales aseptiques sont compatibles avec la méthode présentée histologique. L&#39;utilisation d&#39;un cadre stéréotaxique et d&#39;insertion automatiques sont recommandées pour améliorer la reproductibilité angle d&#39;implantation et le contrôle des réseaux de microélectrodes (MEA) par rapport aux plans stéréotaxiques. </li></ol> Remarque: Dans cette démonstration de notre méthode chirurgicale est la suivante: maintenez le sujet rongeur stéréotaxique earbars while sous anesthésie isoflurane (entre 1-3%) porté par l&#39;oxygène de qualité médicale. Test de l&#39;absence d&#39;un orteil-pincement reflètent chez le rat ou le manque d&#39;un réflexe de pincement de la queue de la souris pour confirmer que l&#39;animal est complètement anesthésié. Appliquer une pommade oculaire et nettoyer le site chirurgical avec trois lavages alternés de Bétadine et de l&#39;éthanol. Se laver les mains, gants chirurgicaux, aube résille, masque et une blouse. Injecter un bolus de lidocaïne pour engourdir la zone chirurgicale, créer une incision à l&#39;aide de ciseaux ou d&#39;un scalpel, le périoste clair avec un grattoir à os et applicateurs de coton, et de créer une craniotomie avec une pièce à main dentaire perceuse et foret. Conduire un MEA simple tige dans le cortex à l&#39;aide d&#39;un micromanipulateur. Avoir une aide assistante en chirurgie dans le maintien de conditions aseptiques chirurgie et documenter les progrès de la chirurgie. <ol start="2"><li> Après l&#39;implantation de la MEA dans le cerveau, recueillir des images par le biais d&#39;un microscope chirurgical pour informer le retrait éventuel du crâne de partout dans le bpluie. Parties implantées des dispositifs seront préservés in situ. </li></ol> Remarque: La collecte éventuelle d&#39;un tissu avec des dispositifs situ dépend étroitement correspondant au plan de pose d&#39;un dispositif avec le plan de sectionnement du tissu. Des notes détaillées sur le plan d&#39;insertion dispositif par rapport au cerveau sont donc très importantes. <ol start="3"><li> Après l&#39;implantation du dispositif, appliquer l&#39;élastomère de silicone Kwik-Sil (WPI), autour d&#39;une exposition tiges MEA ou de câblage, et laisser sécher. Un morceau de plastique stérilisés, comme une pointe de pipette coupe, peut être utilisé pour aider à contenir l&#39;élastomère de silicone dans un petit puits autour de la craniotomie pendant le séchage. </li><li> Appliquer une couche de deux parties acrylique dentaire (&quot;Liquid Jet&quot; et &quot;poudre Jet&quot; de Lang dentaire) sur le Kwik-Sil et toute crâne exposé. </li></ol> Remarque: Dans une étape ultérieure, la coiffe est fondu à travers afin de permettre l&#39;implantation à séparerà partir de la boîte crânienne. Durcissant aux UV, acrylique doit être évitée au cours de la Kwik-Sil et craniotomie, car cela acrylique très fort, c&#39;est difficile à faire disparaître. Matériaux opaques visuellement autour de l&#39;implant doit également être évité; clair Kwik-Sil fournit une vue de l&#39;implant au cours des étapes ultérieures de ce protocole. <ol start="5"><li> Effectuez les procédures de soins post-opératoires selon le protocole local de la réglementation de protection des animaux, et revenir à des sujets ambulatoires unique logés en cage boîtes. </li></ol> 2. Perfusion tissulaire et Collection Note: Voir Gage et al. pour une procédure pas à pas la procédure détaillée de perfusion dans le modèle animal de rat 19. <ol><li> Utilisez l&#39;anesthésie et le protocole de perfusion approuvé par les soins des animaux de l&#39;établissement et le comité de l&#39;emploi. Après profondément anesthésier le rongeur (confirmé par un manque de parallélisme pincée réflexe chez le rat ou la queue-pincement réflexe chez la souris) et en exposant le cœur, faire peu profonds coups de ciseaux danspour le ventricule gauche et l&#39;oreillette droite. Insérez une aiguille émoussée dans le ventricule gauche et d&#39;offrir température ambiante PBS. Offrir un total d&#39;environ 10 ml de PBS à ~ 5 ml / min chez la souris et ~ 200 ml de PBS à ~ 100 ml / min chez les rats. Cherchez d&#39;épuration du sang par le foie au cours. </li><li> Injecter étiquettes de produits chimiques histologiquement pertinentes transcardiaque, s&#39;il le désire, par la remise seringue en prenant soin d&#39;éviter d&#39;introduire des bulles. </li></ol> Remarque: Les étiquettes vasculaires (par exemple Dil) et du contre nucléiques colorants acides (par exemple Hoechst 33342) sont des exemples de livrables étiquettes de produits chimiques pendant la perfusion. Lorsqu&#39;il est administré correctement, ces marqueurs histologiques devraient étiqueter l&#39;animal entier 20. <ol start="3"><li> Livrer tamponné température ambiante, le formaldéhyde 4% transcardiaque pour fixer l&#39;animal. Éviter une perforation du septum à travers le cœur, ce qui peut être mis en évidence par le poumon-nez de drainage pendant la perfusion. Recherchez les tremblements de fixation dans les grands musclespour indiquer perfusion complète. Livrer un total de 10 ml de fixateur ~ à ~ 5 ml / min chez la souris et fixateur ~ ~ 200 ml à 100 ml / min chez les rats. </li><li> Après la perfusion, décapiter l&#39;animal, exposer une partie du tronc cérébral ou du cervelet en utilisant rongeurs ou des ciseaux, et la tête dans une solution de formaldéhyde 4% pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver la tête dans trois changements de PBS avec de une à quatre heures d&#39;intervalle entre les lavages. </li><li> Ranger les têtes fixes dans HBHS contenant de l&#39;azoture de sodium à 4 ° C pendant plusieurs jours à plusieurs mois. </li></ol> 3. Retrait cerveau avec Dispositifs situ Remarque: Effectuez cette section sous une hotte tout en portant un équipement de protection individuelle. Éviter le dessèchement des tissus en retournant la tête fixe à HBHS solution périodiquement. <ol><li> Disséquer soigneusement loin la peau et d&#39;autres tissus autour de la calotte acrylique à l&#39;aide de petites pinces et de ciseaux. </li><li> Pendant que vous portez à la chaleur insensitive gants, utilisez un fer à souder pour enlever acrylique dentaire et exposer une zone de sous-jacents clair Kwik-Sil (Figure 2a). </li></ol> Remarque: Le but de cette étape est de permettre aux micro-ciseaux un angle approprié d&#39;accès aux postes où les dispositifs implantés entrent dans le cerveau, de sorte que le cerveau implantés les composants peuvent être séparés des éléments fixés sur le crâne. <ol start="3"><li> Sous un microscope chirurgical, coupé en élastomère de silicone avec micro-ciseaux courbes, enlever des petits morceaux de Kwik-Sil avec des pincettes jusqu&#39;à la position où les dispositifs de pénétrer dans le cerveau. </li><li> Continuer le long de la surface de coupe de la craniotomie avec des micro-ciseaux courbes à séparer les composants de l&#39;appareil attaché au polysilicium et du crâne de composants implantés dans le cerveau. Encore une fois utiliser un grossissement de microscope et un grand soin lors de la coupe à travers les composants de l&#39;appareil exposés, en prenant soin de ne pas pousser ou traîner l&#39;implants dans le tissu fixe. </li><li> Retirer l&#39;os autour de la coiffe avec soin avec des rongeurs. Utilisez une spatule pour séparer le cerveau avec des dispositifs implantés à partir du crâne. Stocker le cerveau en solution HBHS jusqu&#39;au moment de trancher. </li><li> Placez le cerveau dans un plat en verre de Pétri remplie avec HBHS, et utiliser une lame de rasoir pour enlever les tissus étrangers tels que la moelle épinière, le cervelet, le bulbe olfactif ou, selon qu&#39;elles se rapportent à l&#39;emplacement de l&#39;implantation du dispositif. Utiliser un bloc de cerveau (Ted Pella) et des lames de rasoir à l&#39;article du cerveau et de créer une surface plane correspondant étroitement l&#39;angle des dispositifs implantés, ce qui est réalisé en plaçant le cerveau dans un bloc de cerveau de taille adéquate, l&#39;orientation du cerveau telle que toute partie visible de l&#39;implant soit parallèle avec le guide de lame de rasoir, et à placer une lame de rasoir dans une lame de guidage d&#39;au moins 2 mm à partir de l&#39;implant. Appuyer sur la lame de rasoir à travers le tissu. Montez cette surface à une plate-forme vibratome. Alternament, une lame de rasoir montée sur un micromanipulateur peut être utilisé d&#39;une manière similaire au bloc commandé en cerveau de créer un plan correspondant de près au sens de l&#39;implant. </li><li> Lieu de glace sous la plate-forme vibratome, et, après avoir laissé la surface du tissu brièvement sécher sur une serviette en papier, respecter le cerveau à l&#39;aide d&#39;un vibratome Super Glue. Colle le plan du tissu plat créé à l&#39;étape précédente est à l&#39;étage. Avec des dimensions asymétriques de tissus, d&#39;orienter l&#39;échantillon de telle sorte que la plus grande dimension est collée parallèle à la direction de déplacement de la lame pour éviter vibratome la lame potentiellement frapper sur le tissu. Après que la colle (~ 1-2 min), ajouter réfrigérés (~ 4 ° C) PBS pour le plat vibratome autour du tissu. </li><li> Recueillir des tranches de tissu épais entre 200-400 um, y compris les tissus de commande, en utilisant le taux de vibration maximale (~ 100 Hz) et un taux de lame lente progression (&lt;0,2 mm par seconde), avec un angle de la lame de 10 ° à partir de horizontal. Recueillir soigneusement les tranches avec une spatule ou pinceau rond et en magasin HBHS dans une plaque à 24 puits à 4 ° C. </li><li> Une fois le dispositif en place est visible à l&#39;oeil nu ou au microscope chirurgical, collecter des sections plus minces pour approcher le dispositif de découpe en tranches de 100 um ou moins. </li></ol> Remarque: typiques de silicium micro-implants sont visibles à l&#39;œil nu dans le formol fixe tissus du cortex cérébral des rongeurs entre 300 et 500 um de la surface du dispositif. <ol start="10"><li> Avec le dispositif en place maintenant à proximité de la surface du tissu, une coupe de tissu collecter&gt; 250 um contenant le dispositif à l&#39;intérieur. Estimation de l&#39;épaisseur nécessaire peut être facilitée en se référant à des tranches précédemment collectées. </li></ol> Remarque: agrandie dispositifs, appareils et dispositifs multident angulaires peuvent nécessiter des tranches de tissu plus épaisses (&gt; 500 um) pour saisir le dispositif d&#39;une seule pièce de tissu; remembre qui à la fois la pénétration des étiquettes appliquées et de la profondeur de l&#39;imagerie microscopique sera limité à la collecte de données éventuelle de ces tranches très épaisses. Si possible, évitez de frapper l&#39;appareil avec la lame vibratome, car cela peut causer un frottement du dispositif à travers la déformation des tissus et morphologique. 4. Traitement des tissus et de compensation <ol><li> Laver 3x tranches de 5 min par lavage dans HBHS </li><li> Incuber dans du borohydrure de sodium (5 mg de NaBH 4/1 ml de HBHS) pour 30 min au total (15 min de chaque côté de la tranche). Retourner les tranches à l&#39;aide d&#39;un acier inoxydable ou en Téflon cuillère enduit micro et petit pinceau (Ted Pella). Des mouvements lents et réfléchis améliorer le succès de chaque flip tranche. Évitez de toucher les endroits autour de l&#39;implant avec la brosse. Lorsque cela est possible, en ajoutant une solution beaucoup plus que nécessaire (&gt; 2 ml) permet de manipuler et retourner les tranches de tissu plus facilement. </li></ol>Note: Cette étape permet de réduire endogène autofluorescence; sauter cette étape si les marqueurs fluorescents ont été appliquées pendant la perfusion ou XFP marqueurs transgéniques sont présents. <ol start="3"><li> Laver 3x tranches de 5 min par lavage dans la solution de lavage à température ambiante. </li></ol> Remarque: Agitation pendant les étapes de lavage et d&#39;incubation est facultative. Les auteurs supposent que subtile secousses de l&#39;implant rigide par rapport au tissu cérébral environnant peut se produire avec agitation. Toutefois, un mélangeur orbital se déplaçant à une vitesse douce (&lt;60 min) peut éviter ce tout en augmentant la circulation de solutions. <ol start="4"><li> Bloquer pendant 2 heures dans la solution de lavage à température ambiante (tranches à feuilles au bout d&#39;une heure). </li><li> Incuber des anticorps primaires (dilué dans la solution de lavage) pendant environ 48 h (24 h de chaque côté de la tranche) à 4 ° C. </li><li> Effectuer 6 3 lavages rapides min avec la solution de lavage. </li><li> Effectuez 6, 1 h (3 lavages lavagees de chaque côté de la tranche de tissu) dans la solution de lavage (à conserver à 4 ° C si du jour au lendemain à laver). </li><li> Incuber dans Anticorps secondaires (dilué avec la solution de lavage) pendant environ 48 heures (24 h de chaque côté) dans 4 ° C. </li><li> Effectuer 6 3 lavages rapides min avec la solution de lavage. </li><li> Effectuez 6, 1 lave-h (3 lavages de chaque côté) dans la solution de lavage; conserver à 4 ° C si le lavage du jour au lendemain. </li><li> Retirer la solution de lavage et ajouter la base de glycérol &quot;U2 - Sca l e&quot; solution de compensation. Permettre de dégager environ 1 semaine pour tranches épaisses (250-500 um) ou 2-3 semaines pour des coupes de tissus très épais (&gt; 500 um) à 4 ° C. </li><li> Couvrir la plaque avec une feuille et conserver à 4 ° C. </li><li> Montez dans les diapositives pouvant accueillir des coupes de tissus épais (figure 2b, 2c) en utilisant une solution de compensation comme milieu de montage et d&#39;étanchéité avec du vernis à ongles transparent. Conserver à 4 ° C loin de la lumière. </li></ol> 5. Panorama complet d&#39;imagerie de TiInterface quest et des périphériques <ol><li> L&#39;utilisation à long objectifs de microscope de travail à distance (&gt; 2 mm), commencer l&#39;imagerie avec un microscope confocal à balayage laser ou un 2-photon microscope. Nous allons démontrer avec un Zeiss LSM 710, Carl Zeiss &quot;Zen&quot; logiciel (2010), et une platine XY commandé par ordinateur traduire à l&#39;image d&#39;un panorama 3D autour de l&#39;implant. </li></ol> Remarque: correct pour l&#39;indice de réfraction de la solution de compensation soit dans le logiciel, par l&#39;intermédiaire d&#39;un collier de correction de l&#39;objectif, ou dans le traitement des données après la collecte. Dans cette démonstration, nous entrons dans une valeur d&#39;indice de réfraction de la solution &quot;U2&quot; compensation de 1,4 dans le logiciel Leica microscope Zen, ce réglage permet d&#39;ajuster subtilement z étape intervalles pour tenir compte des non-concordance d&#39;indice de réfraction. <ol start="2"><li> Dans le tissu proximité de l&#39;appareil, à peu près évaluer les appropriées axe z les paramètres de collecte de fenêtres et de données dans la dimension z pour chaque canal fluorescente en utilisant la puissance du laser faible (~ 00,5 à 5%) et les grandes z étape tailles (&gt; 25 m). </li></ol> Remarque: inclure un espace supplémentaire au-dessus et au-dessous lors de la fixation de l&#39;axe z lorsque la mise en place pour la collecte de données panoramique, que le tissu ne peut être située entièrement à plat sur ​​la lame porte-objet (~ 20 um dans chaque sens). <ol start="3"><li> Définir l&#39;objectif au centre xy de votre panorama éventuelle; l&#39;aide du logiciel panorama Zen, déterminer le nombre de postes de collecte requis pour chaque axe (x et y) pour couvrir votre région d&#39;intérêt. </li><li> Réévaluer et finaliser la fenêtre de collecte de l&#39;axe z. </li><li> Régler manuellement la sensibilité du détecteur et de la puissance du laser à la rampe de manière appropriée avec une profondeur accrue, l&#39;objectif est généralement de maintenir à peu près la même intensité de l&#39;image indépendamment de la profondeur d&#39;imagerie dans la tranche de tissu, mais aussi pour éviter le bruit de fond élevé. </li><li> Recueillir chaque image fluorescente séries de données. S&#39;il est nécessaire d&#39;éviter le chevauchement des signaux, exécutez la ligne lasers séquentiellement. </li></ol> Remarque: Le cas échéant, configurez le logiciel pour sauvegarder automatiquement les données sur le disque dur lors de la collecte. <ol start="7"><li> Modifiez les paramètres du logiciel pour recueillir les «réflexion» et «de transmission» des données, et d&#39;utiliser plus d&#39;une, longueur d&#39;onde laser plus pénétrant (par exemple 633 nm) pour capturer ces canaux. Déterminer la puissance du laser et la sensibilité du détecteur approprié pour &quot;réflectance&quot; et &quot;transmission&quot; collecte et répéter la même collection série à travers le dispositif implanté. </li><li> Exporter les données pour traitement ultérieur, la quantification et l&#39;analyse. </li></ol>

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<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+labeling+and+visualization+of+blood+vessels+with+lipophilic+carbocyanine+dye+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI.</a> Nature Protocols. 3, 1703-1708 (2008).</li>
<li>Clendenon, S. G., Young, P. A., Ferkowicz, M., Phillips, C., Dunn, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Tissue+Fluorescent+Imaging+in+Scattering+Specimens+Using+Confocal+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Deep Tissue Fluorescent Imaging in Scattering Specimens Using Confocal Microscopy.</a> Microscopy and Microanalysis. 17, 614-617 (2011).</li>
<li>Wilks, S. J., Richner, T. J., Brodnick, S. K., Kipke, D. R., Williams, J. C., Otto, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+Biasing%2C+Cyclic+Voltammetry%2C+%26+Electrical+Impedance+Spectroscopy+for+Neural+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Voltage Biasing, Cyclic Voltammetry, & Electrical Impedance Spectroscopy for Neural Interfaces.</a> J. Vis. Exp. (60), e3566(2012).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont aucune divulgation applicables à déclarer, financière ou autre.

Le &quot;Device-Capture Histologie&quot; (DCHist) méthode décrite ici permet l&#39;évaluation histologique de près les interactions entre morphologiquement préservé tissus du cerveau et les implants tissulaires. Collecte de tissus DCHist nécessite une séparation minutieuse des composants de l&#39;appareil crâne montés à partir de composants implantés dans le cerveau. DCHist nécessite également la collecte d&#39;une tranche histologique épais (&gt; 250 m). Ces coupes de tissus, une fois étiqueté, effacé, monté et imagé, peut fournir des indications nouvelles sur la blessure d&#39;implantation ou ultérieure réponse chronique à des dispositifs à demeure. Utilisation des outils de microscopie de pointe, l&#39;interface entre le tissu et le dispositif peuvent être visualisés et analysés en détails élevés, comme indiqué dans les figures 3-5. Les techniques présentées dans leur forme actuelle repose sur la capacité à creuser l&#39;écart lentement la coiffe fabriqué à partir de ciment dentaire en deux parties et Kwik-Sil jusqu&#39;au point d&#39;implantation du dispositif.L&#39;utilisation de ciment dentaire qui peut être brûlé ou autrement retirée et un élastomère de silicone clair à travers lequel de petits ciseaux peut être guidé visuellement grandement aider à réussir à séparer le dispositif implanté crâne de ses composants montés. Tenter de couper l&#39;appareil sous le crâne et surtout le cerveau afin de le récupérer in situ n&#39;est pas recommandée, car l&#39;implant crâne monté sera sorti du cerveau d&#39;un montant significatif. Bien plus minces, les implants plus petits, tels que les AEM tige unique de technologies NeuroNexus, sont plus propices à DCHist, les principes ne se limitent pas à tiges simples ou périphériques réseaux de microélectrodes. Collecte et stratégies d&#39;imagerie sont largement applicables à tiges multiples dispositifs et implants plus grands tels que les canules, les conditions étant qu&#39;ils doivent être séparés de toute monture crâne et recueillies dans une coupe de tissu épais. Bien que les auteurs se concentrent sur l&#39;analyse des tissusentourant les implants corticaux, dispositifs entraînés profondément dans le cerveau pourrait également être collectées et imagée. La profondeur de pose de l&#39;implant ne devrait pas affecter la capture de l&#39;implant dans une tranche à condition que le dispositif ne s&#39;écarte pas de manière extravagante de l&#39;angle connu d&#39;insertion. Limitations existent à l&#39;application utile de la méthode DCHist. Coupes de tissus du cerveau sont difficiles à l&#39;image à travers des centaines de micromètres, en particulier dans les domaines de la substance blanche, bien que des solutions de compensation optique peut grandement améliorer la profondeur d&#39;imagerie dans différents tissus 21. Pour améliorer encore la profondeur d&#39;imagerie, la microscopie à deux photons d&#39;excitation peut être utilisé en même temps que la compensation optique décrit. Une autre limitation potentielle de la méthode décrite peut être des méthodes spécifiques et des anticorps fluorescents immunohistochimie employées par les chercheurs. La diffusion passive entraîne généralement la prise en compte de ces marqueurs dans les tissus fixeet sur les sites de liaison d&#39;antigène. Les concentrations finales de travail anticorps doit être déterminée par des chercheurs au cas par cas afin de maximiser la pénétration des marques, tout en évitant des niveaux élevés d&#39;étiquetage arrière-plan. Marquage de l&#39;anticorps ne doit pas être variable entre les tranches qui sont traitées de manière identique, mais les anticorps différents peuvent varier considérablement dans leur capacité à pénétrer et à marquer leur antigène, avec certains anticorps facilement l&#39;étiquetage des antigènes de plusieurs centaines de micromètres de profondeur et d&#39;autres antigènes d&#39;étiquetage seulement quelques dizaines de micromètres de profondeur. Nous décrivons l&#39;amélioration de cette diffusion par l&#39;application d&#39;étiquettes d&#39;anticorps à un niveau supérieur concentrations typiques, pendant plusieurs jours d&#39;application, et dans une solution contenant un détergent dilué et sérum bloquant. Périodiquement, renversant les tranches favorise également la même étiquetage. Étapes d&#39;extraction des antigènes et des processus de fixation de remplacement (par exemple le glutaraldéhyde, micro-ondes, etc) peut être approprié pour des antigènes spécifiques. Anticorps secondaire-fluorochrome conjugués peuvent également varier dans leur performance marquage des coupes épaisses, même si cela n&#39;a pas été observé par les auteurs à l&#39;aide Alexa Fluor étiquettes d&#39;Invitrogen. Alternativement, les sujets animaux transgéniques exprimant des protéines fluorescentes dans les types cellulaires d&#39;intérêt peuvent être utilisés pour éviter les problèmes avec la pénétration des marques d&#39;anticorps, comme de nombreuses protéines fluorescentes, comme eGFP, conservent leur fluorescence après traitement au formaldéhyde, et peuvent être immédiatement visualisées dans des coupes de tissus. DCHist est un puissant ensemble de techniques pour recueillir et analyser l&#39;impact de microsystèmes implantés sur le tissu cérébral. Couplage avec le protocole histologique évaluation in vivo de la qualité de l&#39;électrophysiologie et de l&#39;impédance des électrodes 22 pourraient grandement améliorer notre compréhension des sources biologiques de la variabilité physiologie et de la dégradation. Le domaine de prothèses neurales implantées en particulier peuvent bénéficier de la fiche détaillée ima DCHistGing de l&#39;appareil intact / tissus d&#39;interface pour informer le développement de dispositifs AME biologiquement neutres.

Le domaine de neuroprothèses recherche vise à aider les personnes souffrant de divers handicaps et de troubles en court-circuitant les structures malades ou endommagés dans le corps par le biais du système nerveux central interfaçage 1,2 appareils. Microdispositifs Brain-implantés, tels que réseaux de microélectrodes (MEA), peut être utilisé pour enregistrer ou stimuler des structures cérébrales, et permettre ainsi la mise en place d&#39;interfaces à long terme entre l&#39;électronique et le tissu du SNC 3-5. AME pénétrantes, des dispositifs qui sont enfoncés dans le tissu cérébral, particulièrement prometteuses comme des interfaces bidirectionnelles en raison de la proximité étroite au sein de laquelle ils présentent électrodes à un ensemble relativement restreint de neurones voisins 6. Toutefois, le tissu complexe des réponses résultent de l&#39;implantation à long terme de ces accords pénétrants, ce qui entraîne souvent variables et peu à peu dégradant électrophysiologiques signal sur bruit plus de jours à plusieurs mois, et une augmentation impédance électriqueéquilibre entre sites d&#39;électrodes et la masse 7,8. Les origines supposées de ces changements comprennent l&#39;activation de la microglie, astrocytose réactive le long des microsystèmes, et une perte ou la migration des neurones du tissu environnant aux dispositifs implantés 9-11. Un défi majeur pour la compréhension de ces changements dans les tissus autour de chroniques AME pénétration, est la difficulté à saisir les données histologiques de l&#39;interface tissu intact autour de dispositifs implantés chroniquement 12. L&#39;analyse histologique du tissu avec l&#39;interface de périphérique / tissu toujours présent serait améliorer les actuels dispositif d&#39;enlèvement des protocoles histologiques. Avec un dispositif intact restant dans le tissu, l&#39;impact biologique des interactions relativement subtiles, telles que l&#39;utilisation de revêtements biocompatibles 13,14 ou compensation électrique de la surface d&#39;électrode 15,16, pourraient être numérisés et analysés par rapport à l&#39;implant. Havant nous démontrons une méthode de collecte, de traitement, et l&#39;image de l&#39;interface microdispositif intact pour la microscopie détaillée basée sur l&#39;analyse du tissu cérébral environnant. Dans ce procédé, le dispositif et le tissu cérébral environnant sont recueillies dans une coupe de tissu (&gt; 250 pm) d&#39;épaisseur en utilisant un vibratome. Pour améliorer la pénétration des marques histologique dans ces tranches épaisses, étiquettes fluorescentes histochimiques et immunohistochimiques sont appliquées à des concentrations élevées dans des solutions contenant du sérum bloquant et détergent pendant plusieurs jours. Une solution de compensation optique est utilisée pour améliorer la profondeur d&#39;imagerie de microscopie, et le tissu est monté en face des chambres 2-laser pour la suite microscopie confocale à balayage 17. À capturer l&#39;interface complète histologique, une étape commandée par ordinateur de translation est utilisé lors de l&#39;imagerie de recueillir z-pile panoramas le long de la longueur des implants. En plus de l&#39;imagerie appliquée étiquettes tissus, la collecte de réflectance laser retour des implantset la transmission de lumière à travers le tissu à la fois permettre la localisation de l&#39;interface de dispositif par rapport aux tissus environnants. Tissus préparés en utilisant ce &quot;Device-Capture Histologie&quot; (DCHist) protocole d&#39;imagerie permet d&#39;accéder aux morphologiquement préservé tissus / dispositif interactions, et améliore ainsi sur précédentes dispositif d&#39;enlèvement des protocoles histologiques 18.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Réactifs </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> 14533 </td><td> ADN marqueur </td></tr><tr><td> Lapin anti-Iba1 </td><td> Wako (Japon) </td><td> 019-19741 </td><td> Anticorps monocytes </td></tr><tr><td> Acrylique dentaire </td><td> Lang dentaire (divers distributeurs) </td><td> Poudre Jet réparation Denture &amp; Liquid </td><td> Coiffe de construction </td></tr><tr><td> Kwik-Sil </td><td> World Precision Instruments </td><td> KWIK-SIL </td><td> Couvrant exposés implants crâniens </td></tr><tr><td> Sérum normal de chèvre </td><td> ImmunoResearch Jackson </td><td> 005-000-121 </td><td> Le traitement des tissus </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100-500ml </td><td> Le traitement des tissus </td></tr><tr><td> Urée </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U4883 </td><td> Effacement de solution </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G20225 </td><td> Effacement de solution </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Équipement </td></tr><tr><td> Courbes micro-ciseaux </td><td> World Precision Instruments </td><td> 14208 </td><td> Couper l&#39;implant avant de retirer le cerveau </td></tr><tr><td> Lames de rasoir </td><td> Ted Pella </td><td> (Différentes tailles) </td><td> Pour une utilisation avec le bloc du cerveau </td></tr><tr><td> Acrylique cerveau Matrice </td><td> Ted Pella </td><td> 15054 </td><td> Bloquer le cerveau pour créer plan initial dans les tissus </td></tr><tr><td> Lames en plastique </td><td> Ted Pella </td><td> 260225 </td><td> Tissus de montage </td></tr><tr><td> Couverture en verre </td><td> Ted Pella </td><td> (Différentes tailles) </td><td> Tissus de montage </td></tr><tr><td> Réseaux d&#39;électrodes </td><td> Technologies NeuroNexus </td><td> (Différents modèles) </td><td> Exemple AME </td></tr><tr><td> Vibratome </td><td> Leica </td><td> VT1000 S </td><td> Système utilisé dans la méthode présentée </td></tr><tr><td> Lames Vibratome </td><td> (Différents fournisseurs) </td><td></td><td> Collecte tranches </td></tr><tr><td> Plaques à 24 puits </td><td> (Différents fournisseurs) </td><td></td><td> Stockage et de traitement des tranches de tissu </td></tr><tr><td> Microscope confocal à balayage motorisé XY-étape </td><td> Carl Zeiss Microscopie </td><td> Zeiss LSM 710 et «Zen 2010» du logiciel </td><td> Système utilisé dans la méthode présentée </td></tr><tr><td> Fer à souder </td><td> (Différents fournisseurs) </td><td></td><td> Excavation coiffe </td></tr></tbody></table>

intact caractérisation histologique du cerveau microdevices-implantées et les tissus environnants

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Les recherches sur la conception et l&#39;utilisation de microsystèmes cerveau implantés, tels que réseaux de microélectrodes, vise à produire des dispositifs cliniquement pertinentes qui s&#39;interfacent avec les tissus environnants chronique du cerveau. Tissu entourant ces implants est pensé à réagir à la présence des dispositifs au cours du temps, ce qui comprend la formation d&#39;un isolant &quot;cicatrice gliale&quot; autour des dispositifs. Cependant, l&#39;analyse histologique de ces changements dans les tissus est généralement effectuée après explantation du dispositif, dans un processus qui peut perturber la morphologie du tissu d&#39;intérêt. Ici nous démontrons un protocole dans lequel corticales implantés les appareils sont recueillis intact dans les tissus environnants cerveau des rongeurs. Nous décrivons comment, une fois perfusé avec un fixateur, les cerveaux sont retirés et tranchés de manière à éviter les appareils explantation. Nous soulignons l&#39;étiquetage des anticorps fluorescents et les méthodes de compensation optiques utiles pour la production d&#39;une information, les tissus épais encoresection. Enfin, nous démontrons que le montage et l&#39;imagerie de ces coupes de tissus afin d&#39;enquêter sur l&#39;interface biologique autour du cerveau implantés appareils.

AME Brain-implantés peuvent être collectées dans des tranches de tissu en séparant d&#39;abord les composants montés sur le crâne de certains composants du cerveau embarqués. Figure 2a montre les résultats de retirer un côté d&#39;une coiffe ciment dentaire et une partie de Kwik-Sil autour d&#39;un câble MEA sur un crâne de rat. Fer à souder a été utilisé pour retirer le ciment dentaire et Kwik-Sil dans une hotte. Le câblage et les structures non-implantés MEA ont ensuite été coupé par des ciseaux par les micro-lentement à travers l&#39;excavation Kwik-Sil vers le bas à la surface du cerveau fixe. Après le tranchage, l&#39;étiquetage et la compensation des tissus, de simples faits sur diapositives sont utiles pour le montage des tranches de tissu épais (Figure 2b). Une tranche de cerveau monté contenant un microdispositif implanté est illustré à la figure 2c. Imagerie par le biais de chaque côté de la lame peut vous permettre d&#39;évaluer l&#39;interface autour d&#39;un dispositif, comme le montre la figure 3 </strong&gt;, où la microglie ainsi que le soutien de silicium d&#39;un MEA sont visibles d&#39;un côté (figure 3a) et la microglie ainsi que des sites d&#39;électrodes et les traces sont visibles de l&#39;autre côté (figure 3b). Une fois monté, le tissu peut être visualisé à l&#39;aide d&#39;une platine de translation XY. Aperçus de marqueurs fluorescents à travers des tranches de tissu entières peuvent être générés à la résolution désirée (figure 4). L&#39;examen détaillé de l&#39;interface tissu morphologiquement préservé autour de microdispositifs implantés peuvent être collectées sous fort grossissement pour l&#39;analyse de la réponse tissulaire locale (figure 5). <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1.jpg" alt="Figure 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1highres.jpg"/> Figure 1. Vue d&#39;ensemble de la procédure. (Ca) Brain micro-implants chirurgies sont finalisé avec une couche de polymère Kwik-Sil entourant immédiatement l&#39;appareil, suivie d&#39;un revêtement de ciment acrylique. (D, e) après l&#39;euthanasie, la couche acrylique est brûlé, et le crâne montés des composants du dispositif sont séparés de composants implantés en coupant à travers l&#39;élastomère de silicone. (F, g) Le cerveau est alors retiré de la boîte crânienne et est découpée et montée à l&#39;étage vibratome. (Hk) sont des tranches de tissu recueilli, comprenant une tranche de tissu contenant le dispositif. (L) Les tissus peuvent ensuite être traitées et montés dans des chambres personnalisées pour la microscopie détaillée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50126/50126fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. (A) Effacer Kwik-Sil su élastomère de siliconerrounding un câble d&#39;électrode à barrettes (flèche) a été exposé par gravure d&#39;une fenêtre de distance dans le bouchon de ciment dentaire sur une tête de rongeur perfusé à l&#39;aide d&#39;un fer à souder. (B) Pour tenir compte dans l&#39;imagerie d&#39;autre d&#39;une tranche de tissu épais, simple &quot;glissement-chambres&quot; peut être réalisée par découpe d&#39;une lame couvre-objet en plastique et adhérant des deux côtés autour du tissu et de montage solution. (C) Une tranche de tissu de cerveau de rat avec implant intact (flèche rouge) est affiché après le montage. De chaque côté du tissu est rapidement accessible à l&#39;imagerie microscopique avec cette configuration. Pour l&#39;échelle, le panneau (a) est de 25 mm de diamètre à la base, tandis que les panneaux (B, C) ​​sont de 80 mm de diamètre à la base. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3.jpg" alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3highres.jpg"/> Figure 3. Int maximumensity z projections de 40 um d&#39;épaisseur, des piles d&#39;images recueillies à travers le côté arrière (a) et avant (b) d&#39;un réseau de microélectrodes implantées. Microglie (marquées avec anti-Iba1 et Alexa Fluor 633, blanc) et la réflectance de lumière laser (rouge), collectées à partir de la surface du dispositif, ont été consécutivement créés de part et d&#39;autre d&#39;une tranche de 400 um d&#39;épaisseur du tissu. Comme les implants cérébraux sont souvent opaques, montage avec accès optique pour les deux parties fournit une vue claire des structures tissulaires marquées &quot;derrière&quot; l&#39;implant par rapport à l&#39;objectif du microscope. Barre d&#39;échelle 50 pm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Une tranche DCHist étiquetés imagée en utilisant une étape contrôlée par ordinateur sur un microscope confocal à balayage laser. Les noyaux cellulaires (a) (colorés au Hoechst 33342) et (b) les monocytes / microglie(Étiqueté anti-Iba1) ont été simultanément imagée sur des canaux séparés. Transmission de lumière (c) et de la réflectance ont également été recueillies, montre l&#39;emplacement de l&#39;implant 4-semaines par rapport à Hoechst et Iba1 données. (D) Superposition de tous les canaux de transmission, mais est également indiquée. La zone rectangle blanc est détendu dans les images qui apparaissent à droite. La barre d&#39;échelle 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5.jpg" alt="Figure 5" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5highres.jpg"/> Figure 5. Utilisation d&#39;une platine de microscope commandé par ordinateur et un logiciel approprié, les données d&#39;imagerie panoramique peuvent être collectés autour de l&#39;implant. Réflectance (a) et de transmission (b) permettre la localisation de l&#39;appareil, tandis que les étiquettes fluorescentes anticorps ou chimiques (c, anti-Iba1 étiquetage de la microglie et macrophages) permettent une imagerie détaillée des composants du tissu le long de l&#39;interface tissu intact. Barre d&#39;échelle 200 um.

Nous présentons ici une méthode histologique pour la capture, l&#39;étiquetage, la compensation optique et l&#39;imagerie de l&#39;interface cerveau intact tissu autour de microdispositifs chroniquement implantés dans le tissu cérébral des rongeurs. Les résultats des techniques comprenant cette méthode sont utiles pour comprendre l&#39;impact des différentes pénétrantes cérébrales implants sur leur tissu environnant.

Intact Caractérisation histologique du cerveau Microdevices-implantées et les tissus environnants

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Le but de cette procédure est d’imager l’interface intacte du tissu cérébral autour de microdispositifs implantés de manière chronique dans le tissu cérébral des rongeurs. Ceci est accompli en utilisant d’abord un élastomère de silicone à cellules rapides et un acrylique dentaire en deux parties pour couvrir la craniotomie et former une calotte crânienne autour du dispositif implanté dans le cerveau. Après avoir perfusé l’animal avec un traitement tissulaire fixateur et post-mortem, la partie implantée du cerveau du dispositif est séparée du capuchon de la tête en brûlant l’acrylique dentaire et en coupant à travers la cellule rapide.Ensuite, le cerveau est retiré et tranché avec un viome pour capturer l’implant dans une section de tissu. La dernière étape consiste à préparer le tissu pour l’imagerie fluorescente en lavant l’étiquetage, puis en nettoyant la section du tissu dans une solution de clarification optique. En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour montrer la réponse biologique intacte que l’implant cérébral pénétrant produit dans les tissus environnants à l’échelle subcellulaire.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que l’explication, le dispositif, est que la technique évite de perturber le tissu entourant et adhérant au dispositif implanté afin que le tissu d’interface puisse être examiné intact. Cette méthode s’appuie sur des techniques avancées d’immunohistochimie et de microscopie et permet d’obtenir des données de microscopie confocale qui décrivent en détail la région entourant un dispositif implanté dans le cerveau. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neuroprothèses, telles que la mesure dans laquelle la mort cellulaire locale, la formation de cicatrices gliales et la réorganisation des vaisseaux sanguins ont un impact réel sur la durée de vie des dispositifs à micro-électrodes implantés dans le cerveau.Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’interface neuronale chronique des réseaux de micro-électrodes implantés dans le cerveau. Les techniques impliquées dans cette méthode peuvent également être appliquées à d’autres domaines de la recherche en neurosciences, y compris les canules implantées ou les fibres optiques Dans une hotte, commencez la procédure en retirant soigneusement la peau et d’autres tissus autour de la calotte crânienne en acrylique, à l’aide de pinces et de petits ciseaux tout en portant les gants insensibles à la chaleur. Utilisez un fer à souder pour produire une fenêtre dans l’acrylique denté et exposer une zone d’étanchéité rapide sous-jacente.L’appareil doit être visible, enfermé dans le sceau rapide transparent. Ensuite, sous un microscope chirurgical, découpez l’élastomère de silicium à l’aide d’une paire de micro-ciseaux incurvés. Retirez ensuite les petits morceaux de joint rapide à l’aide d’une pince à épiler et de micro-ciseaux jusqu’à la position où l’appareil pénètre dans le cerveau.Continuez à couper le long de la surface de la craniotomie pour séparer les composants du dispositif qui se fixent au polysilicium et au crâne des composants implantés dans le cerveau. Soyez prudent lorsque vous coupez à travers les composants exposés de l’appareil. Évitez de pousser ou de traîner les implants dans le tissu fixé.Ensuite, retirez l’os autour du chapeau de tête avec précaution en utilisant les shes crus après cela. Utilisez une spatule pour séparer le cerveau avec le dispositif implanté du crâne. Placez maintenant le cerveau dans une boîte de Pétri en verre remplie de HBHS.Utilisez le bloc cérébral et des lames de rasoir pour sectionner le cerveau et créer un plan plat correspondant étroitement à l’angle des dispositifs implantés. Après cela, enfoncez deux lames de rasoir à travers le tissu cérébral pour exposer la surface plane qui sera montée sur le Vibram. Ensuite, placez de la glace sous la plate-forme Vibram.Ensuite, séchez brièvement la surface du tissu sur une serviette en papier. Après cela, orientez l’échantillon de manière à ce que la dimension la plus large soit parallèle à la direction de mouvement de la lame de tonalité vibrante pour éviter que la lame ne renverse potentiellement le tissu, collez immédiatement le plan plat sur la platine avec de la super colle. Ensuite, la colle fixe un PBS réfrigéré sur la boîte de vibrato autour du tissu.Coupez maintenant les tranches de tissu entre 250 et 500 microns en utilisant le taux de vibration maximal et un taux de progression lent de la lame avec un angle de lame de 10 degrés par rapport à l’horizontale. Ensuite, collectez soigneusement les tranches avec un pinceau et une spatule et conservez un HBHS dans une assiette à 24 puits à quatre degrés Celsius tout en collectant les tranches, gardez une trace de l’épaisseur et de l’emplacement de chaque tranche au fur et à mesure qu’elles sont retirées dans la plaque à 24 puits. Une fois que l’appareil Insitu est visible, prélevez une tranche de tissu d’environ 500 microns d’épaisseur.Afin de capturer le dispositif en une seule tranche de tissu pour recueillir une section de tissu plus mince, des tranches de 100 microns peuvent être soigneusement prélevées pour s’approcher de près du dispositif. À ce moment-là, une tranche de moins de 500 microns d’épaisseur peut être collectée avec l’appareil à l’intérieur. Commencez le traitement des tissus en lavant les tranches trois fois à cinq minutes par lavage dans HBHS.Ensuite, incubez-les dans de l’hydrure de borah de sodium pendant 15 minutes. De chaque côté de la tranche, retournez lentement la tranche à l’aide d’un petit pinceau et évitez de toucher les zones autour du dispositif implanté. Une micro-cuillère en acier inoxydable ou recouverte de téflon peut également être utilisée avec le petit pinceau.Maintenant, lavez les tranches trois fois à cinq minutes par lavage dans une solution de lavage à température ambiante. Bloquez-les dans une solution de lavage pendant deux heures à température ambiante tout en retournant les tranches. Après une heure après deux heures, incubez les tranches dans l’anticorps primaire pendant environ 48 heures à quatre degrés Celsius.Ensuite, effectuez six lavages rapides de trois minutes avec une solution de lavage. Effectuez ensuite six lavages d’une heure dans une solution de lavage. Après cela, incubez-les dans des anticorps secondaires pendant environ 48 heures à quatre degrés Celsius.Encore une fois, effectuez six lavages rapides de trois minutes suivis de six lavages d’une heure dans une solution de lavage. Ensuite, retirez la solution de lavage et ajoutez la solution nettoyante pour le tartre U2 à base de glycérol. Couvrir l’assiette de papier d’aluminium et conserver à quatre degrés Celsius.Laissez les tranches épaisses disparaître environ une semaine ou des sections de tissus très épaisses pendant deux à trois semaines à quatre degrés Celsius. Après le dégagement, montez les sections de tissu sur des lames en utilisant une solution de clarification comme support de montage. Scellez toutes les lames avec du vernis à ongles transparent et conservez-les à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière, en utilisant des objectifs de microscope à plus longue distance.Commencez l’imagerie avec un microscope confocal à balayage laser ou un microscope à deux photons. Nous ferons la démonstration à l’aide d’un logiciel XS L SM seven 10 Carl Xi send et d’une platine de traduction XY contrôlée par ordinateur pour imager un panorama 3D autour d’un implant afin de corriger l’indice de réfraction de la solution de dégagement. Dans cette démonstration, nous saisissons une valeur d’indice de réfraction de 1,4 dans le logiciel de microscope Leica Zen pour la solution de nettoyage U2.Ce paramètre ajuste subtilement les intervalles de pas Z pour tenir compte de l’inadéquation de l’indice de réfraction dans le tissu proche de l’appareil. Évaluez grossièrement la fenêtre de l’axe Z appropriée et les paramètres de collecte de données dans la dimension zdi pour chaque canal fluorescent à l’aide d’une faible puissance laser, d’environ 0,5 à 5 % et de grandes tailles de pas Z. Utilisez ensuite le logiciel de panorama Zen pour définir l’objectif au centre XY du panorama final et pour déterminer le nombre de positions de collecte requises pour les axes x et y.Pour couvrir la zone qui vous intéresse, réévaluez et finalisez la fenêtre de collecte de l’axe Z en vérifiant rapidement la première et la dernière image de la pile. Ensuite, réglez manuellement la sensibilité du détecteur et la puissance du laser pour qu’elles s’adaptent de manière appropriée à l’augmentation de la profondeur. L’objectif est généralement de maintenir à peu près la même intensité d’image, quelle que soit la profondeur d’imagerie dans la tranche de tissu, et d’éviter un bruit de fond élevé.Collectez chaque série de données d’image fluorescente si nécessaire pour éviter le chevauchement des signaux, exécutez les lignes laser séquentiellement. Modifiez les paramètres du logiciel pour collecter les données ou les données de transmission et utilisez un laser de longueur d’onde plus long et plus pénétrant, tel que 6 à 33 nanomètres pour capturer ces canaux. Ensuite, déterminez la puissance laser appropriée et détectez une sensibilité pour la collecte de réflectance et de transmittance et répétez la même série de collecte autour du dispositif implanté.Enfin, exportez les données pour un traitement ultérieur, une quantification et une analyse. L’imagerie de chaque côté de la lame peut vous permettre d’évaluer l’interface autour d’un dispositif, comme illustré ici, où les microglies le long du support en silicium d’un MEA sont visibles d’un côté et les microglies le long des sites et des traces d’électrodes sont visibles de l’autre côté. Une fois que le tissu monté peut être imagé à l’aide d’une platine de translation XY, il est possible de générer des aperçus des marqueurs fluorescents sur l’ensemble de la tranche de tissu à la résolution souhaitée.Ici, les noyaux cellulaires sont colorés avec des crochets 3, 3, 3, 4, 2 et les monocytes microglie marqués avec 3, 2, 9. L’image anti-IBA a été simultanée sur des canaux séparés. La lumière de transmission et la réflectance ont également été collectées, montrant l’emplacement de l’implant de quatre semaines par rapport aux crochets et aux données IVA un, la superposition de tous les canaux, mais la transmission est indiquée ici.Un examen détaillé de l’interface tissulaire morphologiquement préservée autour des microdispositifs implantés peut être collecté sous un fort grossissement pour l’analyse de la réponse tissulaire locale, la réflectance et la transmittance permettent la localisation du dispositif tandis que les marqueurs d’anticorps fluorescents ou chimiques permettent une imagerie détaillée des composants tissulaires le long de l’interface tissulaire intacte. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de prendre vraiment le temps de séparer soigneusement les dispositifs implantés à travers le capuchon de tête et de prévoir que cette étape prendra plus de 30 minutes. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de collecter et de traiter des tranches de cerveau contenant des dispositifs implantés.Vous devriez également être en mesure d’étiqueter et de collecter des données histologiques décrivant la neurobiologie entourant ces dispositifs.

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