La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales

Ce protocole produit des complexes stabilisés de manière covalente de peptides transmembranaires pour des études structurales visant à comprendre comment les protéines membranaires interagissent les unes avec les autres à travers leurs domaines intégrés dans les lipides. Tout d’abord, exprimer une protéine de fusion marquée hist contenant la séquence transmembranaire d’intérêt chez e coli. Ensuite, extrayez la protéine de la fraction corporelle d’inclusion à l’aide de guine et de détergent à l’aide d’une matrice d’affinité nickel.

Concentrez la protéine de fusion marquée hist et le sulfure de di, reliquez-la à la forme diamétrale en lavant la colonne dans une solution contenant des agents oxydants. Ensuite, éluez la protéine de fusion réticulée dans l’acide tri-fluoracétique et traitez-la avec du bromure de cyanogène pour libérer le partenaire de fusion, puis isolez le produit peptidique réticulé du mélange de digestion par HPLC en phase inverse. En fin de compte, l’identité et la pureté des produits sont vérifiées par des analyses de page SDS et de spectrométrie de masse.

Le principal avantage de cette technique est que des complexes sociométriques purs sont produits pour les études structurales à l’aide de techniques telles que la RMN en solution ou à l’état solide. Même lorsque deux domaines transmembranaires sont connus pour interagir, la solubilité peptidique et la formation de complexes sont souvent en désaccord dans des conditions expérimentales. Commencer avec un complexe bien défini stabilisé de manière covalente peut élargir considérablement la gamme de conditions expérimentales qui peuvent être testées pour une collecte de données de haute qualité.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à gérer ces fragments de protéines extrêmement hydrophobes. Ce protocole et les conseils fournis dans le manuscrit qui l’accompagne sont conçus pour fournir une solution simple à certains des défis les plus courants dans le processus de prédiction et de purification. Palais des métaux, une culture d’un litre de bactéries exprimant la fusion des peptides tripes et remise en suspension dans 50 millilitres de tampon de lyse.

Ensuite, effectuez trois cycles de sonication à puissance maximale pendant une minute et refroidissez sur glace pendant cinq minutes. Récolter le corps d’inclusion insoluble par centrifugation à 20 000 g pendant 15 minutes, décanter et mettre de côté le surnageant. Les étapes de sonication et de centrifugation peuvent être répétées si une meilleure pureté de la fraction IB est requise.

Réservez des échantillons de la pastille et du surnageant pour l’analyse de la page FDS afin de confirmer le déclenchement. La localisation par fusion TM vers les corps d’inclusion dissout maintenant les granules de corps d’inclusion dans une solution de guine en utilisant entre 25 et 50 millilitres par litre de culture. Mélanger doucement à température ambiante pendant plusieurs heures avec un ensoleillement occasionnel.

Ensuite, éliminez le lysat du corps d’inclusion par centrifugation à 75 000 à 100 000 fois G pendant une heure. À température ambiante, filtrez le supernat à travers une membrane de 0,2 micron dans un tube conique de 50 millilitres. Combinez le lysat de corps d’inclusion transparent avec de la résine d’affinité de nickel qui a été équilibrée à la solution de guine pour lier le lot.

Mélangez doucement la suspension pendant la nuit à température ambiante. Chargez la suspension de résine de nickel lysat du corps d’inclusion dans une colonne d’écoulement par gravité vide avec un support de lit poreux jusqu’à ce que tout le volume s’écoule. Collectez et mettez de côté le flux à travers lequel peut encore contenir la protéine de fusion non liée.

Lavez ensuite la résine de nickel par gravité. Écoulement avec cinq volumes de lit de solution d’urée contenant cinq faisceaux millimolaires de mercaptoéthanol. Effectuez un deuxième lavage sans poutre mercaptoéthanol pour le troisième lavage.

Utilisez une solution d’urée complétée par du sulfate de cuivre et du glutathion oxydé. Fermez ensuite la sortie de la colonne et incubez 30 minutes à température ambiante pour permettre la formation maximale de liaisons disulfure. Lavez la solution d’urée oxydante avec 10 volumes de lit d’eau.

Appliquez ensuite une ligne d’aspiration pour sécher le lit de la colonne et fermez la sortie de la colonne. Maintenant, dans une hotte de sécurité chimique, ajoutez 1,5 volume de lit de TFA pur, remuez la résine de nickel avec une petite spatule pour assurer une exposition uniforme à l’acide et incubez pendant cinq minutes. Recueillir l’éluat acide en pressurisant doucement avec une conduite d’air comprimée si nécessaire pour expulser tout le liquide.

Pour mesurer le rendement en protéines, procédez à la dilution de l’EIT TFA dans du trifluoroéthanol et mesurez l’absorbence à 280 nanomètres contre A-T-F-A-T-E. Diluer l’acide elu à 80 % de la concentration finale de TFA par goutte à goutte. Ajout d’eau tout en mélangeant doucement.

Si vous précipitez les formes, rajoutez une petite quantité de TFA jusqu’à ce que la solution clarifie. Puis recorriger à 80 % avec de l’eau. Réservez un échantillon de prédigestature de cinq microlitres pour l’analyse de la page FDS et congelez-le immédiatement dans de l’azote liquide.

Ensuite, pesez les cristaux de bromure de cyanogène pour environ 0,2 gramme par millilitre d’échantillon. Prendre soin de peser le produit chimique toxique en toute sécurité. Ajouter le bromure de cyanogène à l’échantillon dans une hotte de sécurité et mélanger doucement jusqu’à dissolution complète.

Rincez maintenant le récipient de réaction dans un joint de gaz inerte et incubez pendant trois à quatre heures à température ambiante à l’abri de la lumière. Réservez un échantillon de cinq microlitres pour l’analyse de la page FDS, congelez-le immédiatement dans de l’azote liquide et lyophilisez-le avec l’échantillon de prédilivères. Transférez ensuite la réaction de digestion dans une cassette de dialyse en cellulose régénérée, ce qui permet une augmentation significative du volume.

Dialysez l’échantillon pendant la nuit contre quatre litres d’eau dans la hotte chimique. Le lendemain matin, retirer la solution réactionnelle dialysée avec précipité de protéines en suspension de la cassette de dialyse et transférer la suspension dans un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, congelez et lyophilisez l’échantillon pendant plusieurs jours pour éliminer l’eau et toute trace de cyanogène, de bromure et de TFA dissoudre jusqu’à 100 milligrammes de produits de digestion lyophilisés dans trois millilitres d’acide formique pur mélangé jusqu’à ce que la solution soit complètement éclaircie.

Chargez l’échantillon sur une colonne de balance préparative zoax SB 300 C3 dans un flux de solvant A à l’aide d’une boucle d’échantillonnage de cinq millilitres. Ensuite, éluez les produits de digestion dans un gradient de solvant B, sur au moins cinq volumes de colonne. Analysez les fractions HPLC par page SDS et spectrométrie de masse MALDI TOF pour identifier l’espèce d’intérêt et confirmer sa lyophilisation de masse attendue.

Les fractions HPLC contenant le produit peptidique réticulé. Si le produit sèche en un film plutôt qu’en poudre, il peut être redissous dans un petit volume de HFIP congelé dans un liquide et lyophilisé. Encore une fois, le résultat sera un cône blanc duveteux qui est facilement incliné et pesé Une séquence d’ADN codant pour la transmembrane et les régions de signalisation de la molécule de signalisation transmembranaire de l’immunorécepteur.

DAP 12 a été cloné dans le vecteur peptidique PMM en utilisant les sites de restriction Hindi trois et BAM H un. La construction d’expression bactérienne qui en résulte produit une protéine de fusion de trip marquée avec des résidus internes uniques de méthionine et de cystine pour le clivage du bromure de cyanogène et la réticulation oxydative. Le niveau d’expression atteint pour les fusions de tripes varie en fonction de la séquence d’acides aminés du peptide attaché.

Cette préparation a produit environ 120 milligrammes de protéines de fusion pures et intactes à partir d’un litre de culture et de quatre millilitres de matrice de nickel. Après la lyse cellulaire, la protéine de fusion a été localisée dans la pastille corporelle d’inclusion. Environ 70 % de la fusion des tripes de DAP 12 TM purifiées au nickel était réticulée au disulfure sous forme DME.

Bien que les produits peptidiques DAP 12 TM ne soient pas facilement identifiables dans l’ensemble des échantillons de bromure de cyanogen, la comparaison des bandes de fusion intacte et de fragments de déclenchement dans l’échantillon de digestion réduite indique que la digestion de la fusion était complète à environ 60 % dans cette séparation typique des produits de digestion. Sur une colonne C3 à l’échelle préparative utilisant la HPLC en phase inverse, les produits liés font allusion à un gradient en deux étapes du solvant B. Le produit peptidique réticulé au sulfure de diss est identifiable dans l’analyse de la page FDS des principales fractions HPLC dans des conditions non réductrices et réductrices. L’analyse par spectrométrie de masse de Maldi tof confirme l’identité du peptide dème dans le pic quatre avec le produit principal à 6729,2 Daltons.

N’oubliez pas que travailler avec du bromure de cyanogène, des solvants organiques et des acides concentrés peut être extrêmement dangereux. Un équipement de protection approprié doit être porté lors de l’exécution de ces procédures et le bromure de cyanogène ne doit jamais être manipulé à l’extérieur de la cagoule de sécurité chimique approuvée. Cette technique a fourni le matériel d’étude clé pour trois structures différentes de solutions et de MR de complexes peptidiques transmembranaires, démontrant comment les récepteurs immunitaires multi-sous-unitaires s’assemblent par le biais d’interactions protéiques au sein de la membrane lymphocytaire.

Nous pensons que l’application de cette technique s’avérera tout aussi précieuse pour d’autres systèmes de protéines membranaires.