Name: La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Découvrez la production de complexes de peptides transmembranaires stabilisés par ponts disulfure pour l'analyse structurale par RMN en solution. Cette méthode permet d'étudier les interactions des protéines membranaires.

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Le financement de ce travail est assuré par la National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC projet de subvention à 1011352 MEC et MJC; Independent Research Institutes programme de soutien des infrastructures [IRIISS] subvention à WEHI) et le gouvernement du Victoria (VESKI Innovation Bourse de MEC; gouvernement de l&#39;État de Victoria Soutien opérationnel Infrastructure à WEHI). MEC est une reine Elizabeth II Fellow de l&#39;Australian Research Council. EFXB reconnaît l&#39;appui du Programme des bourses d&#39;études Norma Hilda Schuster à l&#39;Université de Melbourne.

1. Le clonage et la conception Construct Cloner les séquences d&#39;intérêt dans le vecteur PMM-peptide (qui peut être fourni sur demande) en utilisant HindIII et sites de restriction BamHI (voir Figure 1). L&#39;insert d&#39;ADN double-brin doit intégrer, dans l&#39;ordre suivant: un site HindIII; un seul codon méthionine pour le clivage par CNBr; l&#39;E. coli codon optimisé séquence codant pour un peptide, un codon d&#39;arrêt, un site BamHI. Tous les autres méthionines dans le peptide doit être éliminée et la séquence dipeptide Asp-Pro doit être évitée car elle sera également clivé dans des conditions acides. Un résidu de cystéine unique doit être introduit dans chaque séquence peptidique selon le positionnement souhaité de la réticulation disulfure dans le complexe final, et tous les autres cystéines doit être muté en sérine. Le plasmide porte une cassette de résistance à la kanamycine pour la sélection. 2. Expression de trpLE-PeptiFusion de <ol><li> Assurez-vous et stérile milieu filtrant M9/Kan une croissance minime (0,1 mM CaCl 2, 2 mM MgSO 4, 3 g / L KH 2 PO 4, 7,5 g / L de Na 2 HPO 4 · 2H 2 O, 0,5 g / L de NaCl, 1 g / L de NH 4 Cl, 4 g / L de glucose, 50 mg / l de sulfate de kanamycine). Supplément avec Centrum complet de A à Zinc de fournir des vitamines B et d&#39;oligoéléments:. Dissoudre 1 comprimé dans 40 ml H 2 O avec le mélange pendant 30 min, centrifuger pour éliminer la matière insoluble et stérile filtre le surnageant d&#39;orange Solution mère Conserver à 4 ° C dans l&#39;obscurité pendant 2 semaines et utiliser 4 ml / L dans M9. NOTE: 15 N-NH 4 Cl enrichi, 13 C-enrichie glucose ou d&#39;autres précurseurs des isotopes stables marqués peuvent être inclus dans un milieu M9 à ce stade si vous le souhaitez. </li><li> Inoculer une culture de 100 ml démarreur fraîchement transformé E. BL21 (DE3) souche coli dans un milieu M9/Kan. Développer une nuit à 37 ° C sous agitation à 200 rpm. </li><li> Le lendemain matin, cochez la DO 600 de la culture de départ - ce qui devrait être de l&#39;ordre de 2 ou plus. Diluer la culture de 100 ml de démarrage dans 1 litres total de Centrum supplémenté en milieu M9. Divisé en deux 2 flacons à chicanes L (500 ml de culture dans chaque flacon) et de croître à 37 ° C sous agitation à 140 tours par minute jusqu&#39;à ce que la DO 600 atteigne 0,6. </li><li> Réglez la température agitateur à 18 ° C et continuer agitation pendant 1 h, ce qui permet aux cultures de se refroidir complètement avant l&#39;induction. </li><li> Prélever un échantillon de pré-induction pour analyse SDS-PAGE (équivalent de 50 ul d&#39;une culture à une DO 600 = 1), puis ajouter IPTG à une concentration de 0,1 mM final pour induire l&#39;expression de la fusion trpLE-peptide. Continuer à croître à 18 ° C/140 rpm nuit (16-20 heures) sous induction IPTG. </li></ol> 3. Préparation corps d&#39;inclusion et reliure matrice de nickel <ol><li> La finale DO 600 de cultures d&#39;expression au jour le jour dans un milieu minimal est variable et should se situer entre 2,5 et 5,0. Prélever un échantillon pour analyse SDS-PAGE (équivalent de 50 ul d&#39;une culture à une DO 600 = 1) et prélever des cellules par centrifugation pendant 20 min à 5000 x g. </li><li> Resuspendre culot cellulaire de 1 L de culture dans 50 ml de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 20 mM de β-ME, 0,2 M de NaCl). Les suspensions cellulaires peuvent être conservés congelés pour un traitement ultérieur. </li><li> Lyser les cellules par sonication sur glace à la puissance maximale pendant 1 min et reste sur la glace pendant 5 min. Nous utilisons un Sonicator Misonix 3000 (max de sortie 600 watts) à panne ½ pouces haute intensité remplaçable. Répétez sonication / refroidissement pour les trois cycles. </li><li> Recueillir des corps d&#39;inclusion insolubles (IB) matériau par centrifugation pendant 15 minutes à 20.000 xg et jeter le surnageant. Un lâche, mince couche de débris cellulaires de couleur claire peut être visible sur le dessus de la pastille dense IB, ce qui peut être emportée avec de l&#39;eau ou un tampon en agitant doucement. Étapes 3.3 et 3.4 peut être répété pour améliorer la pureté de la fraction IB si desirouge. Des échantillons de granulés et de matériel surnageant doit être pris pour analyse SDS-PAGE pour confirmer la localisation de fusion trpLE-TM de corps d&#39;inclusion. </li><li> Dissoudre IB pellets en solution de guanidine (6 M guanidine-HCl, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1% de Triton X-100, 5 mM β-ME), en utilisant 25-50 ml par litre de culture traitée. Cette étape nécessitera plusieurs heures avec agitation occasionnelle et sonication douce. </li><li> Effacer le lysat par centrifugation IB pendant 1 heure à 75,000-100,000 xg et 20 ° C. Décanter le surnageant et filtrer à travers une membrane de 0,2 um. </li><li> Combiner le lysat effacé IB, dans un tube de 50 ml conique ou un plus grand récipient pouvant être fermé solidement, avec de la résine d&#39;affinité au nickel qui a été lavé avec de l&#39;eau et on équilibre à une solution de guanidine. Utiliser 3-4 ml de résine réglé par litre de culture traitée pour des fusions qui expriment à un degré similaire à celle trpLE-DAP12TM montré ici (figure 3, ligne 2). Bind lots, en incubant nuit à t salle<html> empérature en mélangeant doucement. </li></ol> 4. La réticulation oxydative sur colonne <ol><li> Chargez la suspension de résine IB lysat / nickel dans une colonne à écoulement par gravité vide avec support de lit poreux, ajoutant en continu jusqu&#39;à ce que la totalité du volume traverse. Recueillir et mettre de côté le flux continu, qui peut encore contenir des protéines de fusion non lié. </li><li> Laver la résine de nickel par écoulement gravitaire avec 5 volumes de lit de solution d&#39;urée (8 M d&#39;urée, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl) contenant 5 mM de β-ME. </li><li> Laver la résine de nickel à nouveau avec 5 volumes de lit de solution d&#39;urée sans β-ME. </li><li> Laver la résine de nickel pour la troisième fois avec 5 volumes de lit de solution d&#39;urée qui a été complétée par 20 uM CuSO 4 et 2 mM de glutathion oxydé. Après ce lavage, fermer la sortie de la colonne et incuber 30 minutes à température ambiante pour permettre la formation de pont disulfure maximale. </li></ol> 5. Élution TFA et quantification contenu &quot;&gt; ATTENTION: L&#39;acide trifluoroacétique (TFA) provoque de graves brûlures au contact avec la peau et les vapeurs sont extrêmement irritantes concentré TFA doit être utilisé que dans une hotte chimique approuvé fumées avec des lunettes de protection et des gants sans latex Vérifier la compatibilité chimique de tous.. les matériaux utilisés, le polypropylène est compatible avec toutes les étapes de ce protocole. <ol><li> Laver la solution d&#39;urée oxydant avec 10 volumes de lit d&#39;eau et sécher le lit de la colonne en appliquant une ligne vide à la sortie de la colonne. </li><li> Fermez la sortie de la colonne et ajoutez 1,5 volumes de lit de neat (99-100%) TFA. Mélanger la résine de nickel avec une petite spatule à assurer une exposition à l&#39;acide et incuber pendant 5 min. Ouvrir la sortie de la colonne et recueillir l&#39;éluat acide, sous pression lentement avec une seringue ou d&#39;air comprimé si nécessaire pour faire sortir tout le liquide. </li><li> Répéter l&#39;étape d&#39;élution acide avec encore 1,5 volumes de lit de TFA pur. Travailler rapidement à cette étape pour éviter la dissolution totale de l&#39;Beaded matrice d&#39;agarose. Production de protéine peut être déterminée à ce stade, selon l&#39;équation de Beer-Lambert et le coefficient d&#39;extinction molaire théorique de la séquence trpLE-peptide. Diluer un échantillon de l&#39;éluat TFA (1:20 à 1:50) dans le trifluoroéthanol (TFE) et de mesurer l&#39;absorbance à 280 nm, en utilisant un mélange TFA / TFE à la même dilution en blanc. </li></ol> 6. La digestion par CNBr ATTENTION: Le bromure de cyanogène (CNBr) est extrêmement toxique et doit être manipulé que sous une hotte chimique approuvé fumées. PPE, y compris des lunettes de sécurité, blouse de laboratoire et gants sans latex sont absolument nécessaires. CNBr est réactif à l&#39;humidité et doit être amené à température ambiante avant ouverture. Communiquez avec votre bureau de la sécurité institutionnelle pour obtenir des instructions sur la neutralisation / élimination des CNBr contaminés par des solutions et des matériaux. <ol><li> Diluer l&#39;éluat acide à la concentration de TFA 80% final par addition goutte à goutte de l&#39;eau tout en mélangeant délicatement. Si un précipité se forme, unjj revenir un petit volume (0,5 à 1 ml) de TFA pur jusqu&#39;à ce que la solution devienne limpide, puis re-bonne à 80% avec de l&#39;eau. Prenez un 5 pl pré-digérer l&#39;échantillon pour analyse SDS-PAGE, le gel dans de l&#39;azote liquide et lyophilisation de l&#39;échantillon immédiatement. </li><li> Ajouter cristaux CNBr à environ 0,2 g / ml, en prenant soin de peser le produit chimique toxique en toute sécurité dans des lieux fermés, pré-pesés tubes ou à l&#39;aide d&#39;un équilibre intérieur de la hotte pour vapeur chimique. Mélanger doucement jusqu&#39;à dissolution complète. Rincer et sceller le récipient de réaction sous gaz inerte (azote ou argon flux) et incuber 3-4 heures à la température ambiante, à l&#39;abri de la lumière. </li><li> Prenez un 5 pl post-digestion de l&#39;échantillon pour analyse SDS-PAGE et de geler immédiatement et lyophiliser. Transférer la réaction de digestion à une cassette de dialyse en cellulose régénérée ou le tube (acétate de cellulose se dissout dans l&#39;acide concentré) avec un seuil de coupure de poids moléculaire de 3,5 kDa ou moins, en fonction de la taille du complexe peptide attendu. Dialyser pendant une nuit à 4 litres d&#39;eau dans lehotte pour réduire la concentration de TFA et décomposer toute CNBr n&#39;ayant pas réagi. Laissez de la place dans la cassette de dialyse ou le tube pour une augmentation significative du volume (autant que de deux à trois fois) pendant la dialyse pendant la nuit. </li><li> Retirer la solution de réaction dialysée avec précipité en suspension à partir de la cassette de dialyse ou un tube (plus de la protéine va précipiter lorsque la concentration de TFA est réduite) et transférer la suspension de tubes de 50 ml coniques. Geler et lyophiliser pour éliminer l&#39;eau et des traces de CNBr / TFA. Cette étape est susceptible de nécessiter plusieurs jours. ATTENTION: Tant la réaction de dialyse digest et l&#39;eau de dialyse devraient continuer à être traité comme toxiques et manipulés / éliminés avec les précautions qui s&#39;imposent. </li><li> Des échantillons de cultures de stades pré-induction et de récolte, de corps d&#39;inclusion surnageant et le culot, éluat TFA et CNBr digéré matériau peut être analysé par SDS-PAGE. Préparer des échantillons par chauffage à 95 ° C dans Invitrogen NuPAGE sampl LDSe tampon. Éluat TFA et digérer des échantillons doivent être préparés dans des conditions réductrices et à la fois non réductrice afin de faciliter l&#39;identification des produits et l&#39;évaluation de réticulation oxydative. </li><li> Séparez les échantillons sur un 12% NuPAGE bis-tris gel d&#39;acrylamide préfabriqué en utilisant MES-tampon SDS courir pour une résolution optimale des produits plus petits digérer. </li></ol> 7. En phase inverse Purification HPLC de disulfure réticulés complexes peptidiques <ol><li> Dissoudre jusqu&#39;à 100 mg de produits lyophilisés digérer dans 2-3 ml d&#39;acide formique pur et la charge sur une échelle préparative (21,2 x 150 mm) Agilent ZORBAX SB-300 C3 PrepHT colonne dans le solvant A (typiquement 10-20% d&#39;acétonitrile ou 5 -10% d&#39;isopropanol dans de l&#39;eau avec 0,1% de TFA). </li><li> Éluer les produits de digestion dans un gradient de solvant B (acétonitrile ou de l&#39;isopropanol avec 0,1% de TFA) pendant au moins 5 volumes de colonne. Voir la discussion des suggestions sur le choix des conditions optimales pour gradient séquences peptidiques différentes. </li><li> Prendre50-100 échantillons ul de chaque fraction HPLC pour analyse SDS-PAGE et congeler et lyophiliser immédiatement. L&#39;élimination des solvants HPLC est rapide et devrait être achevée en 1-2 heures. </li><li> Préparer des échantillons lyophilisés pour HPLC SDS-PAGE en chauffant à 95 ° C dans un tampon d&#39;échantillon NuPAGE Invitrogen LDS sans agent réducteur. Laisser refroidir et diviser chaque échantillon de façon égale dans 2 tubes à centrifuger, ajouter 100 mM de DTT à l&#39;un d&#39;eux et le réchauffage brièvement. </li><li> Séparer les échantillons réduits et non réduits HPLC sur un 12% de bis-tris NuPAGE gel d&#39;acrylamide préfabriqué avec MES-SDS exécutant tampon que ci-dessus. Les petits peptides hydrophobes souvent ne prennent pas de Coomassie tache bien et peut ne pas fonctionner à leurs poids moléculaires attendus. Cependant, la comparaison des échantillons réduits et non réduits devrait faciliter l&#39;identification des produits peptidiques réticulés et l&#39;évaluation de la pureté. </li><li> Analyser les candidats peptide fractions contenant par laser assistée par matrice ionisation par désorption temps de vol (MALDI-AF) spectrométrie de masse (voir la discussion) afin d&#39;identifier les espèces d&#39;intérêt et de confirmer sa masse attendue. </li><li> Mélanger, geler et lyophiliser les fractions HPLC contenant le pur, réticulé TM peptide complexes et prennent du poids sec du produit final pour déterminer le rendement. Fractions ayant un contenu élevé isopropanol ne peut pas rester congelés. Si fractions peptidiques sécher vers le bas pour un film plutôt qu&#39;un produit lyophilisé moelleux, re-dissoudre complètement le film dans un petit volume de pure hexafluoroisopropanol (HFIP), congeler et lyophiliser nouveau. Le produit HFIP traité devrait être un petit cône blanc qui est facilement renversée et pesés. </li></ol>

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Les auteurs déclarent n&#39;avoir aucun conflit d&#39;intérêts financiers.

Expression de trpLE-TM fusions. D&#39;après notre expérience, trpLE-TM fusions sont mal exprimé dans un milieu de culture riche à 37 ° C, et les conditions de culture décrites ici ont fait leurs preuves pour de nombreuses séquences différentes contenant de une à quatre domaines TM avec des rendements allant 50 à 150 mg / L de pur, de fusion intacte. Fusions encodage de trois ou quatre fragments TM RCPG (CCR5 humain TM1-TM3 et TM4-TM7, respectivement) ou un fragment de noyau catalytique de peptidase du peptide s...

Ce protocole détaille une procédure que nous avons développé pour produire des complexes disulfure stabilisées transmembranaire (TM) de peptides destinés à des études structurales par RMN solution. La procédure prend avantage de l&#39;expression robuste offerte par le système ΔtrpLE1413 fusion (voir ci-dessous) et permet des complexes peptidiques TM de composition définie pour être générés en utilisant des techniques sophistiquées d&#39;étiquetage des isotopes stables pour les modernes des expériences de RMN multidimensionnelles. Nous avons utilisé ces techniques pour déterminer les structures RMN plusieurs qui ont révélé de nouveaux renseignements importants sur la façon d&#39;activation des lymphocytes immunorécepteurs sont assemblées à partir de plusieurs sous-unités de protéines membranaires par des interactions entre leurs domaines TM (récemment revu à 1). Ces techniques sont applicables à de nombreux autres systèmes de protéines membranaires, ainsi que toute une gamme de méthodes analytiques en aval, en plus de RMN en solution. Bien que l&#39;exemple donné ici utilise des résidus cystéine nativespour créer un complexe qui imite la nature liaisons disulfure des protéines, le design est aussi bien adapté pour la création de ponts disulfures d&#39;ingénierie pour stabiliser des complexes qui sont normalement maintenues ensemble par des faibles, des interactions non covalentes comme homo-et hétéro-dimères complexes de MC Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-protéines de la famille ou des hétérodimères αβ 04.02 complexes intégrines 5,6. Extrêmement séquences peptidiques hydrophobes tels que ceux issus de la bicouche lipidique, couvrant des portions de protéines TM sont des sujets extrêmement difficiles pour les études biochimiques et biophysiques. En plus d&#39;être très difficile à manipuler à l&#39;aide de protéines standard et des techniques de chimie des peptides, ils sont souvent très toxiques pour les cellules et sont donc difficiles à produire par recombinaison. Nous et les autres 7,8 9-11 ont connu un succès important en exprimant ces séquences peptidiques difficiles chez les bactéries que dans le même cadre carboxy-terminalefusions avec une version modifiée de la séquence dérivée de la ΔtrpLE1413 E. coli opéron trp 12. Le polypeptide ~ 13 kDa trpLE codée par cette séquence peut être produite à des niveaux élevés en vertu d&#39;un promoteur T7 et est entièrement localisée à corps d&#39;inclusion où les problèmes liés à la toxicité et / ou d&#39;instabilité sont contournées. Modification de la séquence par l&#39;addition d&#39;un amino-terminale 9-histidine étiquette 13 et l&#39;élimination des résidus internes de méthionine et de cystéine de la séquence trpLE 14 souhaités trpLE-peptide fusions d&#39;être purifiés par des ions métalliques et la chromatographie d&#39;affinité digéré à l&#39;aide de bromure de cyanogène (CNBr ) pour libérer la séquence peptidique désirée. Nous avons utilisé avec succès ce système pour exprimer plus d&#39;une douzaine de séquences différentes sous forme de fusions trpLE représentant des fragments de protéines membranaires qui contiennent moins de quatre domaines TM (7,8 et résultats non publiés; voir également la section Discussion). Lainnovation majeure dans ce protocole est l&#39;identification des conditions dans lesquelles les non-structurées et très peu soluble trpLE-TM fusions peuvent être efficacement disulfure réticulé dans le contexte d&#39;un flux de travail optimisé. Plusieurs aspects de l&#39;expression à haut rendement, la manipulation et la purification des produits peptidiques ont également été soigneusement optimisé, ainsi que les recommandations présentées ici sont tout aussi pertinentes pour la production de disulfure non-réticulés (monomère) produits peptidiques TM.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom de réactif / Matériel </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Le bromure de cyanogène </td><td> ALDRICH </td><td> P.No-C91492, CAS-506-68-3 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES. Très toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Le contact avec des acides, dégage un gaz très toxique. Très toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner à long terme des effets néfastes pour l&#39;environnement aquatique. </td></tr><tr><td> L&#39;acide trifluoroacétique </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.CODE-1000984387, numéro CAS 76-05-1 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES., Provoque de graves brûlures. Nocif par inhalation. Nocif pour les organismes aquatiques, peut entraîner à long terme des effets néfastes pour l&#39;environnement aquatique. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> P.No M7154, numéro CAS 60-24-2 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES. Toxique par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Irritant pour la peau. Risque de lésions oculaires graves. Peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau. Très toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner à long terme des effets néfastes pour l&#39;environnement aquatique. </td></tr><tr><td> 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Numéro de produit 52512, CAS-No. 920-66-1 </td><td> SUBSTANCE DANGEREUSE. MARCHANDISES DANGEREUSES. Nocif par inhalation et par ingestion. Provoque des brûlures. </td></tr><tr><td> L&#39;acide formique </td><td> Merck KGaA </td><td> K41186564 </td><td> Liquide et vapeurs inflammables. Provoque des brûlures graves de la peau et des lésions oculaires. </td></tr><tr><td> Urée </td><td> UNIVAR, AJAX Finechem </td><td> Numéro de produit, 817, N ° CAS 57-13-6 </td><td> Lorsqu&#39;il est chauffé, decomposes de dioxyde de carbone et l&#39;ammoniac; si brûlé, émet de faibles quantités d&#39;oxydes d&#39;azote. Peut causer des rougeurs et irritations de la peau et les yeux. </td></tr><tr><td> Chlorhydrate de guanidine </td><td> Amresco </td><td> P.No-M110, Numéro CAS: 50-01-1 </td><td> Nocif en cas d&#39;ingestion, irritant pour les yeux graves, Provoque une irritation cutanée, la toxicité aiguë par voie orale, irritant pour la peau Irritant pour les yeux,. </td></tr><tr><td> TRITON X-100 </td><td> SIGMA </td><td> Nombre-T8532 Produit N ° CAS: 9002-93-1 </td><td> Triton X-100 est un détergent non ionique, 100% d&#39;ingrédient actif, qui est souvent utilisé dans des applications biochimiques pour solubiliser les protéines. Triton X-100 n&#39;a pas de propriétés antimicrobiennes et considéré comme un relativement doux détergent non dénaturant </td></tr><tr><td> Son-Sélect nickel-affinité sur gel </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogue Num-P6611 </td><td> EST-Select Gel affinité nickel est un métal immobilisé-ion chromatographie d&#39;affinité (CMAP) de produit. L&#39;Nick HIS-Selectel affinité gel est un chélate de propriété quadridentate sur billes d&#39;agarose chargé avec du nickel qui est conçu pour se lier spécifiquement des protéines contenant histidine. </td></tr><tr><td> (-)-Glutathion oxydé </td><td> SIGMA-ALDRICH </td><td> Catalogue num 150568 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Misonix S-3000 sonicateur </td><td> QSONICA </td><td> S-3000 (discontinué) </td><td> Puissance de sortie 600 watts. 1/2-inch remplaçable pointe de la sonde prend 1/2-inch forte intensité, haut volume conseils et une gamme de haute intensité et de faible volume conseils. Plus proches des modèles actuellement disponibles dans cette entreprise sont Q500 Q700 et. </td></tr><tr><td> Version du logiciel système de chromatographie BioLogic DuoFlow, 5,3: RP-HPLC </td><td> Bio-Rad Laboratories </td><td> Catalogue Num 760-0047, No Config: AU500571, N ° de série: 484BR3705 </td><td> Peptides se lie d&#39;inverser la phase colonnes HPLC en haute aqueous phase mobile et sont élués des colonnes HPLC RP avec grande phase mobile organique. En RP HPLC des peptides sont séparés en fonction de leur caractère hydrophobe. Peptides peuvent être séparés par l&#39;exécution d&#39;un gradient linéaire de solvant organique. </td></tr><tr><td> Prep HT C3 ZORBAX 300SB-analytique Colonne HPLC, 21,2 x 150 mm granulométrie de 5 um </td><td> Agilent </td><td> Pas de produit: 895150-909 </td><td> HPLC en phase inverse colum </td></tr><tr><td> NuPAGE 12% Bis-Tris Gels </td><td> Life Technologies </td><td> NP0341BOX </td><td> Gels pré coulés pour l&#39;électrophorèse des protéines </td></tr><tr><td> Slide-A-lyseur de cassettes de dialyse G2, 3,5 K MWCO </td><td> Thermo Scientific </td><td> Pas de produit: 87724 </td><td> Dialyse échantillon </td></tr></tbody></table>

la production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Interactions physiques entre les lipides incorporés hélice alpha domaines de protéines membranaires jouent un rôle crucial dans le repliement et l&#39;assemblage des complexes protéiques membranaires et dans des processus dynamiques tels que transmembranaire (TM) de signalisation et de régulation de la teneur en protéines de la surface cellulaire. Comprendre les caractéristiques structurelles de conduite de l&#39;association des séquences particulières nécessite des analyses sophistiquées biophysiques et biochimiques de complexes peptidiques TM. Cependant, l&#39;hydrophobie extrême de domaines TM rend très difficile à manipuler à l&#39;aide des techniques standard de chimie des peptides, et la production de matériel d&#39;étude approprié s&#39;avère souvent prohibitif difficile. Identifier les conditions dans lesquelles les peptides peuvent adopter des conformations hélicoïdales stables et forment des complexes ajoute spontanément un autre niveau de difficulté. Nous présentons ici un procédé pour la production d&#39;homo-ou hétéro-dimères complexes peptidiques TM à partir de matériaux qui sont exprimées dans E. coli, ce qui permet l&#39;incorporation de marqueurs isotopiques stables pour la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou non-naturelles des acides aminés pour d&#39;autres applications relativement peu de frais. La principale innovation de cette méthode est que les complexes de MC sont produites et purifiées comme covalente disulfure associés (réticulé) qui peuvent former des assemblages de structures stables, stoechiométrique et homogène après reconstitution dans un détergent, lipides ou d&#39;autres matériaux de membrane-mimétiques. Nous présentons également des procédures soigneusement optimisés pour l&#39;expression et la purification qui sont également applicables si la production de simples domaines TM ou complexes réticulés et donner des conseils pour adapter ces méthodes à de nouvelles séquences TM.

Le niveau d&#39;expression atteint des fusions trpLE est variable et dépend fortement de la séquence d&#39;acides aminés du peptide ci-joint. Figure 3 montre l&#39;analyse par SDS-PAGE de pré-induction (piste 1) et l&#39;heure de la récolte (piste 2) échantillons provenant d&#39;une culture qui a produit environ 120 mg de pur, intact trpLE-DAP12TM de fusion de 1 litre de culture et de 4 ml matrice de nickel. Tous de la fusion trpLE-DAP12TM a été localisé le corps d&#39;inclusion de pellets (piste 4), pa...

Les études biophysiques et biochimiques des interactions entre les domaines de la protéine membranaire embarqués face à de nombreux défis techniques, dont le premier est l&#39;obtention de matériel d&#39;étude approprié. Cet article décrit un protocole de production et de purification du disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire qui sont appropriés pour l&#39;analyse structurale par une solution de résonance magnétique nucléaire (RMN) et d&#39;autres applications analytiques.

La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Ce protocole produit des complexes stabilisés de manière covalente de peptides transmembranaires pour des études structurales visant à comprendre comment les protéines membranaires interagissent les unes avec les autres à travers leurs domaines intégrés dans les lipides. Tout d’abord, exprimer une protéine de fusion marquée hist contenant la séquence transmembranaire d’intérêt chez e coli. Ensuite, extrayez la protéine de la fraction corporelle d’inclusion à l’aide de guine et de détergent à l’aide d’une matrice d’affinité nickel.Concentrez la protéine de fusion marquée hist et le sulfure de di, reliquez-la à la forme diamétrale en lavant la colonne dans une solution contenant des agents oxydants. Ensuite, éluez la protéine de fusion réticulée dans l’acide tri-fluoracétique et traitez-la avec du bromure de cyanogène pour libérer le partenaire de fusion, puis isolez le produit peptidique réticulé du mélange de digestion par HPLC en phase inverse. En fin de compte, l’identité et la pureté des produits sont vérifiées par des analyses de page SDS et de spectrométrie de masse.Le principal avantage de cette technique est que des complexes sociométriques purs sont produits pour les études

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Découvrez la production de complexes de peptides transmembranaires stabilisés par ponts disulfure pour l'analyse structurale par RMN en solution. Cette méthode permet d'étudier les interactions des protéines membranaires.

La production de disulfure stabilisées complexes peptide transmembranaire pour des études structurales

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